CC BY
22
Изучение протективного внеклеточного протеома Staphylococcus aureus № 6
И.М. Грубер1 ([email protected]), Ф.В. Доненко2, Е.А. Асташкина1, В.О. Шендер3, Р.К. Зиганшин3, М.В. Киселевский2
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва
2ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина», Москва 3ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова», Москва
Резюме
В последние годы повсеместно наблюдается увеличение распространения инфекций как внебольничных (ВИ), так и связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), причиной которых является S. aureus. Ранее с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим (LC-MS) анализом был исследован спектр белков S. aureus № 6 с молекулярной массой 30 - 50 кДа, секретируемых в культуральную среду в конце экспоненциальной фазы роста, обладающих протективной активностью. Из выявленных пептидов было идентифицировано 11 белков, и были получены предварительные результаты относительно протективной активности выделенного белоксодержащего соединения (БСС), обозначенного как «исходное». При его фракционировании с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose была получена протективная фракция -II БСС, подкожная иммунизация которой при генерализованной инфекции мышей BALB/c, развивающейся в результате ретро-орбитального введения сублетальной дозы S. aureus, приводит к снижению высеваемости из почки и формированию абсцессов почки, по сравнению с контролем.
Цель работы: изучение протективного внеклеточного протеома II БСС S. aureus № 6.
Материалы и методы. LC-MS анализ полученных данных был проведен путем сравнения выявленного масс-спектра белков II БСС с результатами протеомного изучения вирулентного штамма S. aureus Newman, широко используемого в исследованиях. C применением различных баз данных было достоверно выявлено более 100 кластеров взаимодействующих белков. Результаты. При анализе основное внимание уделили 46-ти идентифицированным белкам, участвующим в различных биологических процессах. Так, наибольшую группу (19 белков) составляют ферменты углеводного обмена, 8 из которых участвуют в ключевых этапах гликолиза; 6 белков относятся к факторам патогенности (в том числе хлопьеобразующие факторы А и В, гап-тоглобинсвязывающий поверхностный белок) и 4 - к стрессовым белкам. Остальные 17 белков составляют обширную группу белков, участвующих в различных метаболических и биосинтетических процессах.
Заключение. Полученные результаты подтвердили данные других исследователей об идентификации большого количества секретированных S. aureus белков и об их слабом совпадении c выделенными из клинических изолятов. Это свидетельствует о справедливости положения о пластичности генома S. aureus, влияющего на гетерогенность профиля экзопротеома, что в большой степени определяет сложности в разработке эффективных противостафилококковых вакцин.
Ключевые слова: протеом, жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрическим анализом, секретируемые белоксодержащие соединения, углеводный обмен, факторы патогенности
The Study of Protective Extracellular Proteome Staphylococcus aureus № 6
I.M. Gruber1 ([email protected]), F.V. Donenko2, E.A. Astashkina1, V.O. Shender3, R.K. Ziganshin3, M.V. Kiselevsky2 1Federal State Budgetary Research Institution «I.I. Mechnikov Sientific Research Institute for Vaccine and Sera», Moscow 2 Federal State Budgetary Research Institution «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow.
3Federal State Budgetary Research Shemyakin-Ovchinnikov Institution for Bioorganic Chemistry, Moscow Abstract
In recent years, there is a persistent increase in the spread of community-acquired infections and medical care associated infections, the cause of which is S. aureus. Previously using liquid chromatography in combination with mass spectrometry (LC-MS) analysis, spectrum of having protective activity S. aureus № 6 proteins with a molecular weight of 30 - 50 kDa, secreted into the culture medium at the end of the exponential growth phase, was investigated. 11 proteins were identified from indicated peptides and preliminary results of the protective activity of the secreted protein-based substances (SPS), marked as «initial», were obtained. While its fractionation with ion exchange chromatography on DEAE-Sepharose, the protective fraction - II SPS - was obtained. Its hypodermic immunization leads to reduction of kidney inoculation, and to kidney abscess formation, compared to the control, during the generalized infection of mice BALB/c, developing as a result of retro-orbital injection of sublethal dose S. aureus.
Aim. investigation the protective extracellular proteome IISPS S. aureus № 6.
Material and methods. LC-MS analysis of the received data was carried out by comparing the detected mass-spectrum protein II SPS with the results of proteomic study of the virulent strain of S. aureus Newman widely used in researches. More than 100 interacting protein clusters were identified for certain using various databases.
Results. During analysis main attention was paid to 46 identified proteins involved in various biological processes. Thus, the largest group (19 proteins) is composed of carbohydrate metabolism enzymes, eight of which are involved in key stages of glycolysis; 6 proteins are related to pathogenicity factors (including clamping factors A and B, gaptoglobin-adhesive surface protein) and 4 proteins are related to stress ones. The remaining 17 proteins represent a large group of proteins involved in various metabolic and biosynthetic processes.
Conclusion. The received results confirmed the data of other researchers on the identification of a large number of secreted proteins of S. aureus and on their low coincidence with secreted from clinical isolates. This demonstrates the validity of the postulate of the plasticity of the S. aureus genome affecting the exoproteome profile that largely determines the difficulties in creation of effective anti-staphylococcal vaccines.
Key words: proteome, liquid chromatography in combination with mass spectrometry, secreted protein-based substances, carbohydrate metabolism, pathogenicity factors
Введение
Staphylococcus aureus - оппортунистический бактериальный патоген, часто являющийся причиной как внебольничных инфекций (ВИ), так и связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), включающих бактериемию, эндокардит, остеомиелит, септический артрит, пневмонию и другие заболевания [1 - 4]. В последние годы повсеместно наблюдается увеличение распространения заболеваний стафилококковой этиологии [5, 6].
При геномном секвенировании двух метицил-лин-резистентных (MRSA) штаммов S. aureus, вызывающих ВИ (клонов MW2, или USA400, и пандемического USA300), установлено, что около 20% состава генома обусловлено горизонтальным переносом многочисленных мобильных генетических элементов, включающих профаги и острова патогенности (содержащие специализированные факторы патогенности, такие как экзотоксины и экзопротеины, способствующие разрушению защиты хозяина), которые отсутствуют у традиционных MRSA-штаммов COL, N315 и MRSA252, вызывающих ИСМП [7, 8]. После проведения сравнительного филогенетического анализа авторы установили клональную взаимосвязь штаммов S. aureus Newman, а также COL, NCTC8325, USA300 и большие эволюционные различия с рядом штаммов, вызывающих ИСМП, при этом заключили, что профаги и острова патогенности играют основную роль в вирулентности и эволюции S. aureus. Про-теомный анализ изолятов S. aureus (P - MSSA и USA300 - MRSA) показал, что они продуцируют поверхностные секретируемые белки IsaA, LytM, Nuc, пропептид Atl (pro-Atl) и 4 фенол-растворимых модулина (PSM ), причем PSM способствуют распространению S. aureus на влажной поверхности, в частности колонизации катетеров [9, 10]. В связи с этим на мышиных моделях бактериемии и кожной инфекции было изучено протективное в отношении S. aureus действие 8 указанных выше белков [10]. При этом у иммунизированных мышей по сравнению с контролем (неиммунизированные мыши)
был установлен высокий уровень IgG к антигенам, однако не отмечено ни снижения высеваемости (из крови, легких, селезенки, печени и почек на модели бактериемии), ни летальности, не выявлено редукции кожной инфекции (при внутрикожном заражении). Эти результаты, по мнению авторов, свидетельствуют об антигенной активности изученных белков, как на мышиной модели, так и на людях (что было показано в отношении некоторых приведенных белков), при отсутствии протективного действия рассматриваемых белков на мышиной модели.
Ранее были представлены результаты определения спектра белков, которые синтезирует и выделяет в культуральную среду S. aureus № 6 на ранней стадии роста - в конце экспоненциальной фазы [11]. С помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим (LC-MS) анализом был исследован спектр секретированных белков с молекулярной массой преимущественно 30 - 50 кДа, для которых были получены предварительные данные о протективной активности. В этом исследовании анализ полученных данных был проведен путем сравнения выявленного масс-спектра белков с результатами протеомного изучения, осуществленного в Европейском институте биоинформатики с помощью программы Mascot (Matrix Science, Бичвуд, США) с использованием базы данных белковых последовательностей MSDB (http:// www.proteomics.leeds.ac.uk/bioinf/msdb.html; обновление от 31 августа 2006 года; Proteomics Department at the Hammersmith Campus of Imperial College, Лондон Великобритания). В ходе исследования было выявлено 208 пептидов, из них было идентифицировано 11 белков; остальные компоненты, обнаруженные при электрофорезе в геле, предположительно являлись полисахаридами или пептидогликанами, как ранее отмечено в секрети-руемых белковых препаратах K. рneumoniaе [12]. С помощью программы PSORTb, базы знаний UniProt (UniProt Knowledgebase) и базы данных Европейского института биоинформатики было уста-
новлено цитоплазматическое происхождение 7-ми из 11-ти идентифицированных белков. Учитывая изоэлектрические точки идентифицированных белков (два белка находятся в щелочном диапазоне, остальные - в области кислых значений рН), было высказано предположение об образовании комплексов, имеющих нейтральный заряд, что является одним из важных условий молекулярного транспорта белкового комплекса через клеточную мембрану. Таким образом, в исследовании было выявлено минимальное количество белков, которые синтезирует бактерия при выходе из фазы покоя: это 2 белка - экспортера, 5 - ферменты углеводного обмена, 2 - участвуют в биосинтезе жирных кислот и декарбоксилировании глицина и суперок-сиддисмутаза - фермент, способствующий течению окислительно-восстановительных реакций. Успешная работа этих ферментов обеспечивает бактерию всем необходимым для дальнейшего развития, а нарушение их работы может быть сигналом о плохих внешних условиях, что может блокировать развитие популяции. Следует отметить, что изученное белоксодержащее соединение (БСС) обозначено как «исходное», поскольку оно является основой для фракционирования. В последующих исследованиях установлено, что одним из наиболее про-тективных БСС является фракция, полученная при ионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose и обозначенная как II БСС [13]. Данное БСС представляет особый интерес, поскольку двукратная подкожная иммунизация при генерализованной инфекции, развивающейся в результате ретроор-битального введения сублетальной дозы S. aureus, приводит к снижению по сравнению с контролем высеваемости из почки и формирования абсцессов почки.
Цель работы - изучение протективного внеклеточного протеома II БСС S. aureus № 6.
Материалы и методы
Белоксодержащие соединения штамма Staphylococcus aureus № 6 (из коллекции ГИСК № 201200) получали из фильтрата культуральной жидкости после выращивания в жидкой синтетической питательной среде с добавлением экстракта дрожжевого растворимого («Биотехновация», Москва) и глюкозы до окончания фазы экспоненциального роста по описанной ранее технологии [12]. II БСС получали на колонке с ионообменным носителем DEAE-Sepharose, предварительно уравновешенной 50 мМ цитратным буфером, и элюировали 0,1 М цитратным буфером. Фракционирование по молекулярной массе проводили с помощью ультрафильтрации на двух фильтрах с порогом отсечения белка ниже 30 кДа и выше 100 кДа [13].
Жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрическим (LC-MS) анализом проводили в соответствии с [14]. Анализ полученных данных был проведен путем сравнения выявленного масс-спектра белков с результатами проте-
омного изучения вирулентного штамма S. aureus Newman, выделенного от инфицированного человека и широко используемого в исследованиях [15].
Для определения функциональной аннотации идентифицированных белков были использованы онлайн-сервис STRING-db [http://string-db.org] и базы данных KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), GO (Gene Ontology), PFAM (Protein Families) и INTERPRO (Integrated Resource Of Protein Families, Domains And Functional Sites). Достоверно (p < 0,05) выявлено более 100 кластеров взаимодействующих белков.
Результаты и обсуждение
Из всех обнаруженных белков особое внимание было уделено белкам с молекулярной массой 30 -90 кДа. В некоторых случаях были также учтены белки (5 белков, отмеченных звездочкой в табл.), идентифицированные при первом протеомном анализе «исходного» БСС (фруктозо-1,6-бифосфат альдолаза 1 класса, фосфоглицерат киназа, трио-зофосфат изомераза, супероксид дисмутаза, белок Н системы расщепления глицина) [11] или относящиеся к факторам вирулентности и стрессовым белкам, которые по своему участию в биологических процессах были разделены на 4 группы (см. табл.):
I группа - наиболее многочисленная (19 белков), как и в первом исследовании [11], составляют ферменты углеводного обмена с цитоплазматической локализацией (13 белков; один белок № 9 - фосфо-пируват гидратаза - отмечается также внеклеточ-но); для 6 белков локализация не установлена. Из белков этой группы 9 (№ 1 - 9) участвуют в гликоли-зе/глюконеогенезе, в метаболизме и катаболизме углеводов; 2 фермента (№ 10 - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа А и № 11 - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа В) - в гликолизе, в метаболизме углеводов; № 12 - глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа - в метаболизме углеводов, в окислительно-восстановительном процессе; № 13 - пируваткарбоксилаза - в глюконеогенезе; № 14 - 6-фосфоглюконат дегидрогеназа - в пентозо-фосфатном цикле, в метаболизме и катаболизме углеводов, 2 фермента (№ 15 (Е2) - дигидролипо-амидацетил трансфераза и № 16 (Е3) - дигидро-липоамид дегидрогеназа) - в гликолизе, относясь к ферментам пируват дегидрогеназного комплекса; № 17 - D-аланин-полифосфорибитол-лигаза и № 18 - рибокиназа - участвуют соответственно в биосинтезе липотейхоевой кислоты и в метаболизме пентозы на этапе фосфорилирования. Следует подчеркнуть, что 8 из приведенных ферментов (№ 7, 10, 11, 4, 8, 9, 5, 6) участвуют в ключевых этапах гликолиза: в изомеризации производного глюкозы и в дальнейшем фосфорилирировании с возникновением триозофосфата, который окисляется до 3-фосфоглицериновой кислоты с последующим переходом через 2-фосфоглицерат в пируват, кото-
Таблица.
Анализ внеклеточных белков, идентифицированных во IIБСС с помощью жидкостной хроматографии -масс-спектрометрии в конце фазы экспоненциального роста S. aureus № 6
Группа белков si с номер доступа Обозначение гена название белка мм, кДа р! Участие в биологическом процессе Локализация
1 A6QK93 fda Фруктозо-1,6-бифосфат альцолаза 1 класса* fructose-bisphosphate aldolase class 1 33.034 4.92 н/и
2 A6QIW9 fbaA Фруктозо-бифосфат альцолаза fructose-bisphosphate aldolase 30.933 5.01 н/и
3 A6QFH3 pgi Глюкозо-6-фосфат изомераза glucose-6-phosphate isomerase 49.835 4.83 ЦП
4 A6QF82 pgk Фосфоглицерат киназа* phosphoglycerate kinase 42.633 5.17 гликолиз/ ЦП
5 A6QDL6 ldh1 L-лактат цегицрогеназа 1 L-lactate dehydrogenase 1 34.678 4.95 глюконеогенез, метаболизм (МУ) и катаболизм ЦП
6 A6QK89 ldh2 L-лактат цегицрогеназа 2 L-lactate dehydrogenase 2 34.457 4.78 углеводов (КУ) ЦП
7 A6QF83 tpiA Триозофосфат изомераза* triosephosphate isomerase 27.419 4.80 ЦП
8 A6QF84 gpm Фосфоглицерат мутаза 56.447 4,74 ЦП
phosphoglycerate mutase
я х ш 5 ю о о о 9 A6QF85 eno Фосфопируват гицратаза phosphopyruvate hydratase 47.146 4.55 ЦП, ВК
10 A6QF81 gapA Глицеральцегиц-Зфосфат цегицрогеназа А glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseA 36.374 4.89 гликолиз, в МУ и КУ н/и
« о ш ш ЕЕ > н 11 A6QHM0 gapB Глицеральцегиц-3фосфат цегицрогеназа В glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B 37.130 5.95 н/и
ш 5 d ш в 12 A6QH52 zwf Глюкозо-6-фосфат-1-цегицрогеназа glucose-6-phosphate-1- dehydrogenase 57.045 5.31 МУ, окислительно- восстановительный процесс ЦП
13 A6QFW9 pycA Пируваткарбоксилаза Pyruvate carboxylase 129.413 5.18 глюконеогенез, биосинтез углеводов ЦП
14 A6QH57 gnd 6-фосфоглюконат цегицрогеназа 6-phosphogluconate dehydrogenase 51.944 5.00 пентозофосфатный цикл, МУ и КУ н/и
15 A6QFV1 Е 25 (pdhC) Дигицролипоамиц-ацетил-трансфераза (Е2) dihydrolipoamide acetyltransferase 46.412 4.90 гликолиз, ферменты пируват- н/и
16 A6QH64 IpdA Дигицролипоамиц цегицрогеназа (Е 3) dihydrolipoyl dehydrogenase 51.311 5.30 дегидрогеназного комплекса ЦП
17 A6QFE3 dltA D-аланин-полифосфорибитол лигаза D-alanine-polyphosphoribitol ligase subunite1 54.868 4.83 биосинтез липотейхоевой кислоты ЦП
18 A6QDP2 rbsK Рибокиназа Ribokinase 100,884 4,85 метаболизм пентозы, фосфорилирование ЦП
19 A6QFU0 ptsI Фосфоенолпируват-протеинфосфатаза phosphoenolpyruvate-protein phosphatase 63,353 4,66 компонент фос-фотрансферазной транспортной системы, катализирующей транслокацию фос-форильной группы ЦП
Группа белков oí С номер доступа Обозначение гена название белка мм, кДа р! Участие в биологическом процессе Локализация
20 Q53653 clfA Хлопьеобразующий фактор А dumping factor A 97,002 3,61 индукция образования бактериальных скоплений, прикрепление бактерий особенно к цепи фибриногена КС, ВК
21 O86476 clfB Хлопьеобразующий фактор В dumping factor B 97,205 3,84 КС, ВК
s н о о х х а> о н я с 22 A6QG32 isdC Железорегулируемый поверхностный белок iron-regulated surface determinant protein 24,840 8,94 железорегулируемый белок, взаимодействует с гемом, влияет на образование гемоглобина КС, ВК
^ d о н ^ я в 23 O86487 sdrC Серин-аспартатный белок С serine-aspartate repeat-containing protein С 102,854 4.20 клеточная адгезия, связывание костных сиалопротеинов, способствуют взаимодействию с внеклеточным матриксом КС, ВК
24 O86489 sdrE Серин-аспартатный белок Е serine-aspartate repeat-containing protein E 126,474 4.22 КС, ВК
25 A6QHR4 sasl (NWMN 1624) Гаптоглобинсвязывающий поверхгостный белок haptoglobin-binding surface anchored protein 100,874 5.05 гаптоглобинсвязывающий белок КС, ВК
26 A6QEK3 hchA Молекулярный шаперон molecular chaperone Hsp31 and glyoxalase 3 32,272 4,90 терморегулируемый белок, шаперон ЦП
s ш о ш _0 ш о о о 27 A6QH96 sodA Супероксиддисмутаза* superoxide dismutase 22,697 5,08 окислительно- восстановительный процесс ЦП
28 A6QF72 trxB Тиоредоксинредуктаза thioredoxin reductase 33,711 5,21 ЦП
ш d н о 29 A6QF76 cIpP АТФ-зависимая протеиназа ATP-dependent Clp protease 21,558 5,13 расщепление белков (важная роль в деградации неправильно упакованных белков) ЦП
я т ш н i s о о 30 A6QFF2 ampA (pepA) Аминопептидаза (белок семейства) aminopeptidase 54.269 5,53 расщепление белков, деление клетки (метаболизм глютатиона, гидролазная активность) ЦП
31 A6QKC3 arcB Орнитин карбамилтрансфераза В ornithine carbamoyltransferase B 37.855 5.15 метаболизм карбоновой кислоты и кетона ЦП
_ü о о ш ^ о d с 32 A6QG68 argF Орнитин карбамилтрансфераза F ornithine carbamoyltransferase F 37.725 5.06 биосинтез аминокислот (аргинина, глютамина) ЦП
5 т s ^ о о я н ш 2 33 A6QER9 argS Аргинил^РНК лигаза arginyl-tRNA ligase 62.400 5.08 биосинтез макромолекул, активация аминокислот (амино-ацетилтрансфераз-ная активность для трансляции белка) ЦП
34 A6QGU5 asd Аспартат-семиальдегид дегидрогеназа aspartate-semialdehyde dehydrogenase 36.434 4.90 биосинтез аминокислот (оксидоредуктазная активность) ЦП
Группа белков oí с номер доступа Обозначение гена название белка мм, кДа р! Участие в биологическом процессе Локализация
35 A6QFI1 cdr КоА-дисульфид редуктаза coenzyme A disulfide reductase 49.375 5,35 окислительно- восстановительный процесс (оксидоредуктазная активность, связывание нуклеотидов) ЦП
36 A6QGU6 dapA Дигидропиколинат синтаза 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase 32,564 4,80 биосинтез аминокислот (карбоновой кислоты, лизина) ЦП
37 A6QGU7 dapB Дигидропиколинат редуктаза 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase 26,638 5,23 биосинтез аминокислот, окислительно- восстановительный процесс ЦП
38 A6QDC3 deoB Фосфопентамутаза Phosphopentomutase 43,826 4,98 фосфороорганиче-ский биосинтез, в т.ч. рибозофосфатный ЦП
я т ш н i s о о о ^ о о ш ^ о 39 A6QFB6 gcvH Белок Н системы расщепления глицина* Glycine cleavage system H protein 14,084 3,99 катализирует деградацию глицина ЦП
40 A6QEI0 gltX Глутамат-tPHK синтетаза glutamate-tRNA ligase 39.990 5.21 биосинтез макромолекул, активация аминокислот ^РНК- аминоацилирование для трансляции белка) ЦП
с 5 т s ^ о о я 41 A6QI14 hemH Феррохелатаза ferrochelatase 35.208 4.87 катализирует биосинтез, перенос ионов железа к протопорфирину IX ЦП
ш 2 42 A6QIV7 glyA Серин-гидроксиметилтрансфераза serine hydroxymethyltransferase 45,318 5,75 превращение серина и глицина ЦП
43 A6QGK7 glnA глутаминсинтетаза glutamine synthetase 51,749 5,05 биосинтез карбоновой кислоты и глутамина, метаболизм азота ЦП
44 A6QIS1 kdpB Калий-транспортная АТФ-аза рotassium-transporting ATPase B chain 73,454 5,32 катализирует гидролиз АТФ в сочетании с обменом водорода и ионов калия МС
45 A6QEE3 metS Метионин-tPHK лигаза methionine-tRNA ligase 74,838 5,16 элонгация белка, инициация трансляции тРНК ЦП
46 A6QD58 tycG Гистидинкиназа sensor kinase protein 69,972 5,58 входит в 2-х компонентную систему, участвующую в фосфорилировании; регулирующую автолиз, образование пленки, метаболизм клетки МС
Примечание: обозначение локализации белков: н/и - не изучено; ЦП - в цитоплазме; ВК - внеклеточно; КС - в клеточной стенке.
рый на заключительном этапе гликолиза превра- боксилируется в аэробных условиях при участии щается в лактат. Кроме того, часть пирувата декар- ферментов пируватдегидрогеназного комплекса
(№ 15 и 16) и окисляется в ацетил-КоА, который затем проходит превращения в цикле трикарбоновых кислот. При этом, особенно в дыхательной цепи (в аэробном процессе), а также в анаэробном гликолизе, происходит накопление энергии;
II группа - 6 белков (№ 20 и 21 - хлопьео-бразующие факторы А и В, № 23 и 24 - серин-аспартатные белки С и Е, № 25 - гаптоглобин связывающий поверхностный белок), относящихся, соответственно, к факторам патогенности и стрессовым белкам;
III группа - стрессовые белки - белка (№ 26 -молекулярный шаперон Hsp31, № 27 - суперок-сиддисмутаза, № 28 - тиоредоксинредуктаза, № 29 - АТФ-зависимая протеиназа);
IV группа - остальные белки (№№ 30 - 46) составляют обширную группу белков, участвующих в различных метаболических и биосинтетических процессах.
С использованием таких же протеомных методов исследователи идентифицировали сотни белков [15 - 17]. Так, A.K. Ziebandt с соавт. [17] иден-тифицитровали 43 внеклеточных белка S. aureus, а M. Nakano с соавт. [16] - 29 внеклеточных белков, образуемых метициллин-резистентными штаммами S. aureus. При изучении встречаемости белков в экзопротеоме 25-ти клинических изоля-тов S. aureus, из 63-х идентифицированных секре-тированных белков только 7 отмечены у всех изо-лятов (Aly, IsaA, Lip, LytM, Nuc, SA0620 и SA2097) [15]. Следует отметить, что, несмотря на использование в анализе той же программы Mascot, которая была применена и в нашем исследовании «исходного» белоксодержащего соединения, в нем выявлен лишь белок - SA0295, один из редко отмеченных авторами (у менее чем в 20% изученных штаммов). M.J. Sibbald [15] заключает, что пластичность генома S. aureus является одним из факторов, влияющих на гетерогенность профиля экзопротеома и обоснованно делает важные предположения:
• во-первых, гетерогенная экспрессия генов, в частности генов вирулентности, наблюдаемая in vitro, в еще большей степени влияет на вариабельность in vivo;
• во-вторых, с этими различиями в вирулентности штаммов могут быть связаны различия в клинических проявлениях инфекции у разных хозяев;
• в-третьих, поскольку сравнение профилей экспрессии генов вирулентности штаммов-изо-лятов выявило, что они индуцируют весьма сходные симптомы, исследователи надеются идентифицировать протеомное обозначение
симптомов, что поможет понять специфические механизмы патогенности; • в-четвертых, показано, что носительство S. aureus повышает уровень высокоселективного и протективного антительного ответа на суперантигены колонизирующих штаммов. Подобно этому специфический адаптивный иммунный ответ может усиливаться в ответ на другие факторы вирулентности, которые также варьируют между штаммами. Авторы предполагают, что этим можно объяснить тот факт, что носители S. aureus, у которых впоследствии развивается бактериемия, имеют лучший прогноз исхода, чем неносители.
Таким образом, проведенное изучение проте-ома II БСС, полученного в конце фазы экспоненциального роста S. aureus № 6, подтвердило результаты других исследователей, касающиеся идентификации большого количества секретированных белков и слабого совпадения (на данном этапе изучения) рассматриваемых белков в выделенных клинических изолятах и экспериментальных штаммах. Это в большой степени объясняется, вероятно, разными методическими подходами к выделению белоксодержащих соединений, их характеристике и требует дальнейшего изучения их роли в жизнедеятельности бактериальной клетки и в воздействии на макроорганизм для выявления их участия, в частности, в составе комплекса эффективных протективных антигенов.
Выводы
1. При протеомном анализе внеклеточного белоксодержащего соединения (II БСС) S. aureus № 6, обладающего протективными свойствами и способностью снижать обсемененность почек мышей и формирование абсцессов почек, идентифицировано 46 белков, участвующих в различных биологических процессах.
2. Наибольшую группу (19 белков) составляют ферменты углеводного обмена, 8 из которых участвуют в ключевых этапах гликолиза; определены 6 белков, относящихся к факторам патогенности (в том числе хлопьеобразующие факторы А и В, гаптоглобинсвязывающий поверхностный белок), и 4 стрессовых белка.
3. Полученные результаты подтверждают положение о пластичности генома S. aureus, влияющего на гетерогенность профиля экзопротеома, что в большой степени определяет сложности в разработке эффективных противостафилокок-ковых вакцин.
Литература
1. Майчук Д.Ю., Дехнич А.В., Сухорукова М.В. Оценка перспективности применения нетилмицина для топической терапии бактериальных инфекций в офтальмологии с учетом чувствительности основных возбудителей в РФ. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2015; 17 (3): 241 - 249.
2. Теплякова О.В., Руднов В.А., Шлыкова Г. И., Доценко Т. Г. Септический артрит у взрослых. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2015; 17 (3): 187 - 206.
3. Bayer A.S. Staphylococcal bacteremia and endocarditis. Arch. Intern. Med. 1982; 142: 1169 - 1177.
4. Sheagren J.N. Staphylococcus aureus - the persistent pathogen. N. Engl. J. Med. 1984; 310: 1368 - 1373.
5. Данилов А.И., Алексеева И.В., Аснер Т.В., Власова Е.Е., Данилова Е.М., Дехнич А.В. и др. Этиология инфекционного эндокардита в России. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2015; 17 (1): 4 - 10.
6. Kennedy A.D., Otto M., Braughton K.R, Whitney A.R, Chen L., Mathema B. et al. Epidemic community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: recent clonal expansion and diversification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 1327 - 1332.
7. Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K. Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands. J. Bacteriol. 2008; 190: 300 - 310.
8. Diep B.A., Otto M. The role of virulence determinants in community-associated MRSA pathogenesis. Trends Microbiol. 2008; 16 (8): 361 - 369.
9. Tsompanidou E., Denham E.L., Becher D., de Jong A., Buist G., van Oosten V. et al. Distinct roles of phenol-soluble modulins in spreading of Staphylococcus aureus on wet surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79: 886 - 895.
10. van den Berg S., Koedijk D.G.A.M., Back J.W., Neef J., Dreisbach A., van Dijl J.M., Bakker-Woudenberg I.A.J.M., Buist G. Active Immunization with an Octa-Valent Staphylococcus aureus Antigen Mixture in Models of S. aureus Bacteremia and Skin Infection in Mice. PLoS ONE. 2015; 10 (2): e0116847.
11.Donenko F.V., Gruber I.M., Semenova I.B., Priyatkin R.G., Ziganshin R.H., Zaryadyeva E.A. et al. Growth-dependent release of carbohydrate metabolism-related and antioxidant enzymes from Staphylococcus aureus strain 6 as determined by proteomic analysis. Experiment and therapeutic medic. 2011; 2: 1199 -1204.
12.Тришин А.В., Доненко Ф.В., Курбатова Е.А., Воюшин К.Е., Киселевский М.В., Егорова Н.Б. и др. Протективная активность секретируемых белков Streptococcus pneumoniae и Klebsiella pneumoniae. Журн. микробиол. 2008; 4: 46 - 50.
13. Грубер И.М., Асташкина Е.А., Лебединская О.В., Егорова Н.Б., Киселевский М.В., Доненко Ф.В. и др. Исследование протективных свойств секретируемых белоксодержащих соединений Staphylococcus aureus № 6. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2015; 14 (4): 86 - 93.
14. Shender V.O., Pavlyukov M.S., Ziganshin R.H., Arapidi G.P., Kovalchuk S.I., Anikanov N.A. et al. Proteome-metabolome profiling of ovarian cancer ascites reveals novel components involved in intercellular communication. Mol Cell Proteomics. 2014; 13 (12): 3558 - 3571.
15. The Staphylococcus aureus secretome. Rijksuniversiteit Groningen. 2010. Доступно на: http://www.rug.nl/research/portal/files/14562146/titlecon.pdf.
16. Nakano M, Kawano Y., Kawagish M., Hasegawa T., linuma Y., Oht M. Two-dimensional analysis of exoproteins of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) for possible epidemiological applications. Microbiol Immunol. 2002; 46: 11 - 22.
17. Ziebandt A.K., Becher D., Ohlsen K., Hacker J., Hecker M., Engelmann S. The influence of agr and sigma B in growth phase dependent regulation of virulence factors in Staphylococcus aureus. Proteomics. 2004; 4: 3034 - 3047.
References
1. Maychuk D.Yu., Dekhnich A.V., Sukhorukova M.V. Surveillance of activity of netilmicin in comparision with other antimicrobials against Russian ophthalmic bacterial isolates. Clin Microbiol Antimicrob Chemother. 2015; 17 (3): 241 - 249 (in Russian).
2. Teplyakova O.V., Rudnov V.A., Shlykova G.I., Dotsenko T.G. Septic arthritis in adult. Clin. Microbiol. Antimicrob. Chemother. 2015; 17(3): 187 - 206 (in Russian).
3. Bayer A.S. Staphylococcal bacteremia and endocarditis. Arch. Intern. Med. 1982;142: 1169 - 1177.
4. Sheagren J.N. Staphylococcus aureus - the persistent pathogen. N. Engl. J. Med. 1984; 310: 1368 - 1373.
5. Danilov A.I., Alekseeva I.V., Asner T.V., Vlasova E.E., Danilova E.M., Dekhnich A.V. Etiology of infective endocarditis in Russia. Clin Microbiol Antimicrob Chemother. 2015;17 (1): 4 - 10 (in Russian).
6. Kennedy A.D., Otto M., Braughton K.R., Whitney A.R., Chen L., Mathema B. et al. Epidemic community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: recent clonal expansion and diversification. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 1327 - 1332.
7. Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K. Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands. J. Bacteriol. 2008; 190: 300 - 310.
8. Diep B.A., Otto M. The role of virulence determinants in community-associated MRSA pathogenesis. Trends Microbiol. 2008; 16 (8): 361 - 369.
9. Tsompanidou E., Denham E.L., Becher D., de Jong A., Buist G., van Oosten V. et al. Distinct roles of phenol-soluble modulins in spreading of Staphylococcus aureus on wet surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79: 886 - 895.
10. van den Berg S., Koedijk D.G.A.M., Back J.W., Neef J., Dreisbach A., van Dijl J.M., Bakker-Woudenberg I.A.J.M., Buist G. Active Immunization with an Octa-Valent Staphylococcus aureus Antigen Mixture in Models of S. aureus Bacteremia and Skin Infection in Mice. PLoS ONE 2015; 10(2): e0116847.
11. Donenko F.V., Gruber I.M., Semenova I.B., Priyatkin R.G., Ziganshin R.H., Zaryadyeva E.A. et al. Growth-dependent release of carbohydrate metabolism-related and antioxidant enzymes from Staphylococcus aureus strain 6 as determined by proteomic analysis. Experiment. and therapeutic medic. 2011; 2: 1199 - 1204.
12. Trishin A.V., Donenko F.V., Kurbatova E.A., Voyushin K.E., Kiselevsky M.V., Egorova N.B. et al. Protective activity of secreted proteins of Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae. Zh. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. 2008; 4: 46 - 50 (in Russian).
13. Gruber I.M., Astashkina E.A., Lebedinskaya O.V., Egorova N.B., Kiselevsky M.V., Donenko F.V. et al. Immunogenic activity of secreted protein-based compounds Staphylococcus aureus № 6. Epidemiology & Vaccinal Prevention. 2015; 14 (4): 86 - 93 (in Russian).
14. Shender V.O., Pavlyukov M.S., Ziganshin R.H., Arapidi G.P., Kovalchuk S.I., Anikanov N.A. et al. Proteome-metabolome profiling of ovarian cancer ascites reveals novel components involved in intercellular communication. Mol Cell Proteomics. 2014; 13 (12): 3558 - 3571.
15. The Staphylococcus aureus secretome. Rijksuniversiteit Groningen. 2010. Available at: http://www.rug.nl/research/portal/files/14562146/titlecon.pdf.
16. Nakano M., Kawano Y., Kawagish M., Hasegawa T., Iinuma Y., Oht M. Two-dimensional analysis of exoproteins of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) for possible epidemiological applications. Microbiol Immunol. 2002; 46: 11 - 22.
17. Ziebandt A.K., Becher D., Ohlsen K., Hacker J., Hecker M., Engelmann S. The influence of agr and sigmaB in growth phase dependent regulation of virulence factors in Staphylococcus aureus. Proteomics. 2004; 4: 3034 - 3047.
Живая гриппозная вакцина безопасна для детей с аллергией
Аллергия на куриный белок может больше не считаться противопоказанием для введения интраназальной живой гриппозной вакцины (ЖИВГ).
Для оценки безопасности ЖИВГ было отобрано 779 детей в возрасте 2 - 18 лет, страдающих аллергией на яичный белок. Согласно данным клинических исследований, у 270 участников (34,7%) ранее фиксировались анафилактические реакции на яйца, у 157 человек (20,1%) аллергия была выражена респираторным синдромом и реакцией со стороны сердечно-сосудистой системы. Также у 57,1% участников была диагностирована астма.
Все пациенты прошли иммунизацию ЖИВГ, не были отмечены системные аллергические реакции на содержащийся в препарате яичный белок. Ученые отмечают, что
только у 9 участников (1,2%) была зафиксирована умеренная реакция на вакцину сразу после ее введения. Об отсроченной аллергической реакции, возможно связанной с иммунизацией, сообщил 221 пациент, при этом никому из участников изучения не понадобилась госпитализация.
По результатам исследования был сделан вывод, что ЖИВГ безопасна для иммунизации детей с аллергией на яичный белок, так как она хорошо переносится даже пациентами, страдающими астмой.
Источник: Safety of live attenuated influenza vaccine in young people with egg allergy: multicentre prospective cohort study. BMJ 2015; 351: h6291.
