Динамика протеома антибиотикорезистентных штаммов Staphylococcus aureus при воздействии субингибирующих концентраций бета-лактамных антибиотиков Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭВОЛЮЦИИ ЭКОСИСТЕМ

DOI: 10.17816/ecogen1624-10

ДИНАМИКА ПРОТЕОМА АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ СУБИНГИБИРУЮЩИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ БЕТА-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ

© Ю.В. Сопова 1 2, В.В. Гостев 3, О.С. Калиногорская 3, А.Н. Лыхолай 2, С.В. Сидоренко 3

1 Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н.И. Вавилова, Санкт-Петербург;

2 ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург;

3 ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней», Санкт-Петербург

Для цитирования: Сопова Ю.В., Гостев В.В., Калиногорская О.С., и др. Динамика протеома антибиотикорезистентных штаммов Staphylococcus aureus при воздействии субингибирующих концентраций бета-лактамных антибиотиков // Экологическая генетика. — 2018. — Т. 16. — № 2. — С. 4-10. doi: 10.17816/ecogen1624-10.

Поступила в редакцию: 11.12.2017 Принята к печати: 13.06.2018

& Устойчивость к цефтаролину — новому антибиотику семейства цефалоспоринов — была обнаружена у клинических изолятов метициллинрезистентных Staphylococcus aureus, выделенных еще до внедрения антибиотика в медицинскую практику. Для выявления механизмов формирования устойчивости к новому антибиотику было проведено сравнение белковых профилей мутантов, устойчивых к цефтаролину, при воздействии субингибирующими концентрациями бета-лактамных антибиотиков и ванкомицина. Обнаружено, что индукция меропенемом приводит к экспрессии стафилококковой бета-лактамазы у мутантных штаммов, устойчивых к цефтаролину. При индукции другими антибиотиками, а также у исходных штаммов экспрессии бета-лактамазы не отмечали.

& Ключевые слова: антибиотики; протеом; метициллинрезистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA).

PROTEOME DYNAMICS OF ANTIBIOTIC RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS EXPOSED TO SUB-INHIBITORY CONCENTRATIONS OF BETA-LACTAMS

© Y.V. Sopova 1 2, V.V. Gostev 3, O.S. Kalinogorskaya 3, A.N. Lykholay 2, S.V. Sidorenko 3

1 St. Petersburg branch of Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Saint Petersburg, Russia;

2 Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia;

3 Pediatric Research and Clinical Center for Infectious Diseases, Saint Petersburg, Russia;

For citation: Sopova YV, Gostev VV, Kalinogorskaya OS, et al. Proteome dynamics of antibiotic resistant Staphylococcus aureus strains exposed to sub-inhibitory concentrations of beta-lactams. Ecological genetics. 2018;16(2):4-10. doi: 10.17816/ecogen1624-10.

Received: 11.12.2017 Accepted: 13.06.2018

& Background. Ceftaroline is one of the first cephalosporins with activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), it effectively binds to and inhibits penicillin-binding protein 2a (PBP2a). However, isolates with decreased susceptibility to ceftaroline were reported before the commercial release of the antibiotic. The aim of this study was to provide an overview of the proteome changes occurring in MRSA isolates resistant to ceftaroline in response to sub-inhibitory concentrations of cell-wall active antibiotics. Materials and methods. Ceftaroline-resistant mutants were generated from two MRSA SA0077 and SA0422 isolates belonging to ST8-t008-SCCmec IV genetic lineage (sequence type 8, spa type t008, staphylococcal chromosomal cassette mec type IV) and one MRSA isolate SA0085 belonging to ST239-t631-SCCmec III genetic lineage (sequence type 239, spa type t631, staphylococcal chromosomal cassette mec type III). Proteome response of parental and mutant strains to subinhibitory concentration of beta-lactams and vancomycin was analyzed. Results. The protein patterns revealed significant increase of 30 KDa band in mutant strains under induction by meropenem, no changes were observed in parental strains or under induction with other antibiotics. According to MS analysis, three proteins represented the band of the mutant strain in absence of meropenem induction. However, under meropenem induction additional protein was detected (BlaZ). Conclusion. The cross talk between two systems with overlapping functions involved in transcription control of PBP2a and BlaZ ensure ceftaroline resistant phenotype.

& Keywords: Antibiotics; proteome; MRSA.

ВВЕДЕНИЕ к антибактериальным препаратам представляет ре-

Формирование и распространение среди возбуди- альную угрозу современной системе здравоохранения. телей инфекционных болезней человека устойчивости Согласно оценке Всемирной организации здравоохра-

нения, в группу патогенов, вызывающих наибольшее беспокойство и требующих срочной разработки новых лечебных препаратов, включены метициллинрези-стентные Staphylococcus aureus (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus — MRSA) [1]. Первые MRSA были обнаружены в 1961 г. [2], через два года после внедрения в медицинскую практику метициллина — полусинтетического пенициллина, синтезированного для преодоления устойчивости, связанной с быстрым распространением среди стафилококков бета-лактамаз, способных гидролизовать природные пенициллины [3]. Однако в реальности MRSA сформировались еще в середине 40-х гг., задолго до внедрения метициллина в медицинскую практику, скорее всего, под селективным прессингом пенициллина [4]. Механизм устойчивости заключается в приобретении стафилококками дополнительного пенициллинсвязывающего белка 2а (ПСБ2а, ген mecA), отличающегося сниженной аффинностью к большинству бета-лактамных антибиотиков. Таким образом, устойчивость распространяется на все бета-лактамные антибиотики [5].

Препаратами выбора для лечения MRSA-инфек-ций традиционно рассматривали гликопептиды (ван-комицин), относительно недавно для этой цели были разработаны и внедрены в практику оксазолидиноны (линезолид), липопептиды (даптомицин), глицилцикли-ны (тигециклин). Значительным прорывом в лечении MRSA-инфекций стала разработка цефалоспорино-вых антибиотиков цефтобипрола и цефтаролина [6], проявляющих анти-MRSA-активность благодаря повышенной аффинности к пенициллинсвязывающему белку 2 (ПСБ2а) [7]. Однако при изучении коллекций MRSA, полученных еще до внедрения цефтаролина в практику, были обнаружены штаммы, проявляющие устойчивость к этому антибиотику [8]. В дальнейшем при изучении клинических изолятов, а также лабораторных мутантов было выявлено несколько новых механизмов, обусловливающих резистентность как к цефтаролину, так и к бета-лактамам в целом. К наиболее хорошо изученным относятся аминокислотные замены в пеницил-линсвязывающем домене ПСБ2а [9]. Менее ясна роль в формировании резистентности некоторых геномных изменений, выявленных у устойчивых к цефтаролину изолятов MRSA. К таким изменениям относятся мутации в гене неэссенциального ПСБ2 [10, 11], в про-моторной и кодирующей областях гена эссенциаль-ного пенициллинсвязывающего белка 4 (ПСБ4) [12], в генах обмена циклического ди-аденозинмонофосфата (c-di-AMP) и эффлюксной помпы AcrB [13].

В Российской Федерации цефтаролин разрешен к медицинскому применению с 2012 г. Перспективы его использования во многом ограничены возможностью быстрого формирования и распространения резистентности. Прогнозирование вероятности формирования резистентности при клиническом применении антибио-

тиков возможно при селекции резистентных мутантов в экспериментах in vitro. К доступным методам расшифровки механизмов резистентности следует отнести анализ структуры и экспрессии генов — наиболее вероятных мишеней действия антибиотиков. Применительно к цефтаролину таковыми являются гены пени-циллинсвязывающих белков. В то же время уже сейчас очевидно, что устойчивость к цефтаролину может быть связана с более сложными механизмами, чем модификация мишени. Для выявления таких механизмов целесообразно использовать сравнительный протеомный и геномный анализ исходных изолятов и их изогенных устойчивых мутантов.

Целью настоящей работы был сравнительный про-теомный анализ изолятов MRSA, принадлежащих к основным генетическим линиям, распространенным на территории Российской Федерации, и их производных, полученных в результате селекции на среде с це-фтаролином.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные изоляты. В работу были включены три изолята Staphylococcus aureus: SA0077, SA0085 и SA0422 из музейной коллекции Детского научно-клинического центра инфекционных болезней. Эти штаммы выделены в 2011—2012 гг. от пациентов с различными стафилококковыми инфекциями и относятся к широко распространенным на территории РФ генотипам MRSA. Изоляты SA0077 и SA0422 относятся к сиквенс-типу 8, spa-типу t008 и содержат стафилококковую mec-кас-сету IV типа (ST8-t008-SCCmec IV), тогда как изолят SA0085 относится к сиквенс-типу 239, spa-типу t631 и содержит стафилококковую mec-кассету III типа (ST239-t631-SCCmec III).

Селекция устойчивости к цефтаролину. Селекцию проводили в течение 40 пассажей в сердечно-мозговом агаре (Merck, Germany), содержащем антибиотик цефтаролин (AstraZeneca, UK) в диапазоне концентраций, подавляющих рост бактерий. Среды с посевами выдерживали до 96 часов от момента посева до появления первых колоний. Затем отбирали все колонии и снова пересевали на свежие среды с антибиотиком. В процессе селекции каждые 5 пассажей несколько колоний реидентифицировали с целью мониторинга контаминации на приборе Microflex LT (Bruker Daltonics, Germany) с использованием программного пакета BioTyper. Антибиотикочувствительность оценивали методом серийных микроразведений в бульоне Мюллера — Хинтона (Bio-Rad, France) с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в соответствии с ISO 20776-1. Постановку опыта осуществляли в 96 луночных планшетах (НПО «Медпо-лимер», Санкт-Петербург). В качестве контрольного штамма был использован S. aureus ATCC29213 (Remel Culti-Loops, США).

Секвенирование генов mecA и pbp2. Секвениро-вание проводили по Сэнгеру на приборе 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Japan) с прямыми и обратными прочтениями. Для секвенирования использовали ампликоны, покрывающие всю длину генов. Секвенирование осуществляли после 5, 20 и 40 пассажей.

Выделение белка из S. aureus. После выращивания в течение ночи в жидкой среде LB культуры S. aureus инокулировали в 200 мл жидкой среды LB без добавления антибиотиков или с добавлением одного из антибиотиков: меропенема в концентрации 8 мг/л; ампициллина — 50 мг/л; оксациллина — 32 мг/л; ванкомицина — 8 мг/л. Клетки выращивали в течение 4 часов, затем собирали центрифугированием (5000 g, +4 °C, 10 минут). Осадки замораживали при —70 °C и хранили при этой температуре до момента использования. Для разрушения клеток к осадкам добавляли буфер TBS и стеклянные шарики (Sigma), после чего 5 минут встряхивали на дезинтеграторе B. Braun (B. Braun, Мелзунген, Германия). Лизат клеток центрифугировали (10 000 g, +4 °C, 10 минут) для удаления клеточного дебриса. Концентрацию белка в суперна-танте определяли с помощью флуориметра Qubit® 2.0 (Thermo Fisher Scientific).

SDS-PAGE. Образцы белка смешивали с 4Х буфером для нанесения на гель (50 mM Tris (pH 6,8), 2 % (w/v) SDS, 5 % (v/v) глицерин, 5 % (v/v) меркап-тоэтанол, 0,05 % (w/v) бромфеноловый синий) и кипятили при 100 °C в течение 15 минут. На акриламидный гель (10 % акриламида для стандартного электрофореза, 12 % акриламида для более детального разделения белков) наносили по 20 мкг белка из каждой пробы, электрофорез проводили в аппарате Mini-PROTEAN II (Bio-Rad) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Гель окрашивали в растворе Кумасси (0,5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 20 % (v/v) этанол, 10 % (v/v) ледяная уксусная кислота) в течение 12 часов. В качестве маркера молекулярного веса использовали предокрашенный маркер PageRuler (Thermo Fisher Scientific).

Трипсинолиз белков в фрагментах акриламидно-го геля. Фрагмент окрашенного Кумасси геля вырезали, дважды промывали водой, после чего нарезали на кубики объемом 1 мм3. Кубики заливали буфером (50 mM NH4HCO3 / ацетонитрил 1 : 1 (v/v)) и инкубировали 15 минут, после чего убирали всю жидкость и добавляли ацетонитрил так, чтобы он покрыл все фрагменты геля. Через 5 минут ацетонитрил убирали и заливали кубики буфером (50 mM NH4HCO3) и инкубировали 5 минут, затем добавляли равный объем ацетонитрила и инкубировали 15 минут. После этого снова убирали всю жидкость и добавляли ацетонитрил так, чтобы он покрыл все фрагменты геля. Через 5 минут убирали всю жидкость и высушивали фрагменты геля в вакуумном центробежном концен-

траторе Labconco при 18 °C. Высушенные фрагменты геля заливали буфером (10 mM дитиотрейтол, 50 mM NH4HCO3) и инкубировали 45 минут при 56 °C. Затем пробирки охлаждали до комнатной температуры, убирали всю жидкость и добавляли равный объем буфера (55 мМ йодоацетамид, 50 mM NH4HCO3), после чего инкубировали 30 минут при комнатной температуре в темноте. Всю жидкость убирали, промывали фрагменты геля буфером (50 mM NH4HCO3 / ацетонитрил 1 : 1 (v/v)) 2 раза, добавляли ацетонитрил так, чтобы он покрыл все фрагменты геля, и инкубировали 5 минут. Высушивали фрагменты геля в вакуумном центробежном концентраторе Labconco при 18 °C. Высушенные фрагменты геля заливали буфером (20 нг/мкл трипсин, 25 mM NH4HCO3) и инкубировали в течение 18 часов при 37 °C. Добавляли 20 мкл 2 % ацетони-трила, помещали в ультразвуковую баню и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин при 37 °C. Супер-натант отбирали, обработку ультразвуком повторяли еще 2 раза с 25 % и 50 % ацетонитрилом. Полученный раствор высушивали в вакуумном центробежном концентраторе Labconco при 18 °C и использовали для дальнейшего анализа.

Масс-спектрометрический анализ. Для идентификации пептидов после трипсинолиза пробы наносили на планшеты-мишени MTP AnchorChip™ 384 (Bruker Daltonics). Идентификацию проводили с помощью масс-спектрометра UltrafleXtreme (Bruker Daltonics). В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидроксикоричную кислоту. Для анализа ионных пиков применяли программное обеспечение FlexAnalysis 3.2 (Bruker Daltonics). Пептиды идентифицировали с помощью программного обеспечения Mascot 2.4.2 (Matrix Science, http://www.matrixscience.com) на основе базы данных UniProt (http://www.uniprot.org/) с селекцией белков S. aureus. Во время анализа использовали предустановленные параметры допуска по массе пептида ("Mass tolerance") (допуск по массе предшественника 100 ppm, допуск по массе фрагмента 0,9 Da). В качестве калибранта применяли стандарт Peptide Calibration Standard II 8222570 (Bruker Daltonics). Допустимыми модификациями считали карбоксиметилирование ци-стеина и частичное окисление метионина.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Для количественной оценки интенсивности окрашивания белковых полос на акриламидных гелях использовали систему Bio-Rad ChemiDoc™ XRS+ System и программное обеспечение Image Lab 6.0. (Bio-Rad). Относительную интенсивность окрашивания конкретной полосы определяли как отношение интенсивности окраски этой полосы к интенсивности окраски всей дорожки. Эксперимент проводили в трех биологических повторностях, для сравнения использовали /-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После проведения 40 циклов селекции для всех исходных штаммов (8Л0077/0, БЛ0085/0 и 8Л0422/0) были получены мутанты, устойчивые к цефтаролину (БЛ0077/40, БЛ0085/40 и 8Л0422/40). Так, если исходные значения МПК цефтаролина для всех трех изо-лятов составляли 0,5—2 мкг/мл, то после селекции они превысили 64 мкг/мл. Стабильность приобретенного признака была проверена путем проведения 10 пассажей на среде без антибиотика, после чего изменений в МПК выявлено не было. Ранее мы показали, что появление мутаций в генах mecA и pbp2 может рассматриваться как первичный этап формирования устойчивости к цефтаролину [10], поэтому для секвенирования были выбраны именно эти гены. Анализ нуклеотидных последовательностей генов mecA и pbp2 исходных изолятов и их устойчивых производных не выявил каких-либо мутаций, что дало основание для выполнения протеомного исследования с целью поиска другого возможного механизма устойчивости.

Было проведено сравнение белковых профилей исходных чувствительных изолятов (БЛ0077/0, 8Л0085/0 и БЛ0422/0) и устойчивых к цефтаролину мутантов (БЛ0077/40, БЛ0085/40 и БЛ0422/40), полученных на их основе. При выращивании культур без добавления антибиотиков и в присутствии ампициллина, окса-циллина или ванкомицина отличий между исходными и мутантными штаммами обнаружено не было. Однако при инкубации в присутствии меропенема у му-

тантов БЛ0077/40, БЛ0085/40 и БЛ0422/40 в геле, окрашенном Кумасси, появлялась более яркая полоса, соответствующая белкам с молекулярной массой примерно 30 кДа, (рис. 1, а). При сравнении относительной интенсивности окрашивания этой полосы у исходного штамма БЛ0077/0 и устойчивого к цефтаролину штамма БЛ0077/40 с добавлением и без добавления в среду меропенема было установлено, что на среде с меропенемом у устойчивого к цефтаролину штамма БЛ0077/40 интенсивность окрашивания достоверно (А < 0,05) выше, чем в остальных случаях. Электрофорез в 12 % акриламидном геле показал наличие в указанной полосе нескольких белков, близких по размеру (рис. 1, Ь).

Для идентификации этих белков у штамма БЛ0077/40 был проведен масс-спектрометрический анализ, результаты которого представлены в табл. 1. Независимо от условий культивирования (в присутствии меропенема или без него) штамм БЛ0077/40 продуцировал три белка: 1,4-дигидро-2-нафтоил-СоЛ синта-зу — фермент, участвующий в биосинтезе менахинона (витамина К2) [14]; 2,3-бисфосфоглицерат-зависимую фосфоглицерат мутазу — фермент, катализирующий интерконверсию 2-фосфоглицерата и 3-фосфоглицера-та [15]; стафилококковый секреторный антиген, играющий роль в экспрессии резистентности к макролидам, его детальная функция не ясна [16].

В то же время при индукции меропенемом штамм БЛ0077/40 продуцировал стафилококковую бета-лак-

SA0077/0 SA0077/40 SA0085/0 SA0085/40 M - + - + - + - +

245 кДа 190 кДа 135 кДа 100 кДа 80 кДа 58 кДа

46 кДа 32 кДа

25 кДа 22 кДа

Рис. 1. Белковые профили сходных изолятов (SA0077/0, SA0085 и SA0422/40), полученных на их основе. М — маркер меропенема, ( — ) — инкубация в среде без меропенема стрелкой полосы для штамма SA0077/0 на среде без мер с меропенемом 5,3 ± 0,56; для штамма SA0077/40 на ср де с меропенемом — 13,9 ± 5,3 (а); сравнение белковы: лением меропенема ( + ) и без него ( — ) при электрофоре: Fig. 1. Protein profiles of similar isolates (SA 0077/0, SA 0085/0 ant and SA0422/40). M — molecular weght marker, ( + ) — inci meropenem. Average intensity of staining for line pointed wit ropenem; 5,3 ± 0,56 for SA0077/0 strain on media with mer nem; 13,9 ± 5,3 for SA0077/40 strain on media with merope grown on merapenem-containing media( + ) and without mei

)77/0 SA0077/40 SA0085/0 SA0085/40 SA0422/0 SA0422/40

SA0077/0 SA0077/40

Ш Ш

ЕГ ш t r

S S fi fei

S 1 5

îû * *

245 кДа 190 кДа

100 кДа

58 кДа

46 кДа

22 кДа

116 кДа

сходных изолятов (SA0077/0, SA0085/0 и SA0422/0)и устойчивых мутантов (SA0077/40, SA0085/40 ученных на их основе. М — маркер молекулярного веса, ( + ) — инкубация в среде с добавлением

- инкубация в среде без меропенема. Средние показатели интенсивности окрашивания выделенной ш штамма SA0077/0 на среде без меропенема составляют 4,8 ± 0,19; для штамма SA0077/0 на среде ± 0,56; для штамма SA0077/40 на среде без меропенема 4,8 ± 0,73; для штамма SA0077/40 на сре-

— 13,9 ± 5,3 (а); сравнение белковых профилей мутанта SA0077/40, выращенного на среде с добав-

1 ( + ) и без него ( — ) при электрофорезе в 12 % акриламидном геле (b)

lilar isolates (SA 0077/0, SA 0085/0 and SA 0422/0) and their resistant derivatives (SA0077/40, SA0085/40 — molecular weght marker, ( + ) — incubation in meropenem-containing media, ( — ) — incubation without

2 intensity of staining for line pointed with an arrow is 4,8 ± 0,19 for SA0077/0 strain on media without me-

3 for SA0077/0 strain on media with meropenem; 4,8 ± 0,73 for SA0077/40 strain on media without merope-SA0077/40 strain on media with meropenem (а); comparison of protein profiles of SA0077/40 mutant strain, n-containing media( + ) and without meropenem ( — ) by PAGE in 12% acrylamide gel (b)

Таблица 1

Белки, выявляемые у изолята SA0077/40 при инкубации в присутствии меропенема и в контрольных условиях

Table 1

Proteins detected in SA0077/40 isolate incubated in the presence of meropenem and under control conditions

Антибиотик в среде Выявленные белки Выявленные пептиды (номера аминокислот) Молекулярная масса белка

1,4-дигидро-2-нафтоил-СоА синтаза тепВ МЕКВ_8ТААС GHGGYVGEDQIPR (81-93) VGSFDAGYGSGYLAR (147-161) 30406

- 2,3-бисфосфоглицерат-зави-симая фосфоглицерат мутаза gpmA аРМА_БТААС HYGGLQGLNKDDAR (89-102) KEFGEEQVHIWR (103-114) EFGEEQVHIWRR (104-114) NLFTGWEDVNLSEQGINEATR (18-38) VIPFWTDHISQYLLDGQTVLVSAHGNSIR (159-187) 26663

Стафилококковый секреторный антиген $5аА2 88АА2_8ТААС IGSTWGNASNWANAAAR (183-199) NLYTSGQCTYYVFDR (164-178) 29309

1,4-дигидро-2-нафтоил-СоА синтаза тепВ МЕ№_8ТААС GHGGYVGEDQIPR (81-93) VGSFDAGYGSGYLAR (147-161) 30406

+ меропенем 2,3-бисфосфоглицерат-зави-симая фосфоглицерат мутаза gpmA ОРМА_8ТААС KEFGEEQVHIWR (103-114) EFGEEQVHIWRR (104-114) NLFTGWEDVNLSEQGINEATR (18-38) VIPFWTDHISQYLLDGQTVLVSAHGNSIR (159-187) SYDVKPPAETEEQR (116-129) YNHLDKR (138-144) 26663

Стафилококковый секреторный антиген $5аА2 88АА2_8ТААС IGSTWGNASNWANAAAR (183-199) 29309

Бета-лактамаза ЫаХ ВЬАС_8ТААи EVKFNSDKR (50-58) 31349

тамазу РС1 (ген Ь1а1), относящуюся к классу А сери-новых бета-лактамаз. Важно отметить, что у исходного штамма 8А0077/0 значимой продукции бета-лактамазы в ответ на индукцию меропенемом не обнаруживали. Стафилококковые бета-лактамазы отличаются узким субстратным профилем, они гидролизуют природные и полусинтетические пенициллины, а также частично цефалоспорины I поколения, подавляются всеми известными ингибиторами бета-лактамаз. В ранних экспериментах с помощью иммунологических методов у стафилококков удавалось выделить четыре варианта бета-лактамаз [17], наличие этих вариантов подтверждалось незначительными различиями в профиле субстратной специфичности [18]. Однако в последующих экспериментах получить антисыворотки с аналогичными свойствами не удавалось.

Считается, что экспрессия стафилококковых бета-лактамаз носит индуцибельный характер и находится под контролем двухкомпонентной системы регуляции: В1аР-В1а1-В^. Необратимое связывание бета-лак-тамного антибиотика с сенсорным доменом мембранного белка В1аР является первым этапом в передаче сигнала, за которым следует аутопротеолиз цитоплаз-

матического домена этого белка. Далее происходит протеолиз репрессора В1а1, его диссоциация с участком связывания с ДНК и начинается транскрипция генов blaZ/blaR/blaI [19]. На описанную выше двухкомпо-нентную систему структурно и функционально очень похожа двухкомпонентная система регуляции экспрессии гена тесА. Система состоит из аналогичных компонентов (МесР-Мес1-МесА) [20]. Системы частично комплементарны, репрессию транскрипции гена тесА могут вызывать и Мес1 и В1а1 [21].

С точки зрения современных представлений о механизмах устойчивости стафилококков к бета-лактамным антибиотикам объяснить выявленный в настоящей работе феномен индукции меропенемом синтеза бета-лак-тамазы РС1 штаммами, устойчивыми к цефтаролину, достаточно сложно. В качестве одной из причин можно предположить возникновение у устойчивых штаммов мутаций в мембранных белках В1аР или МесР, приводящих к избирательному повышению их аффинности к меропенему. Однако феномен индукции синтеза бета-лактамазы меропенемом никак не объясняет формирования у мутантов устойчивости к цефтаролину. Выявить изменений в синтезе устойчивыми мутантами других

белков в условиях их культивирования как в присутствии антибиотиков, так и без них не удалось.

Ранее были описаны клинические изоляты S. aureus, проявляющие устойчивость к бета-лактамным антибиотикам в отсутствие гена mecA. Установлено, что гиперэкспрессия стафилококковой бета-лактамазы может способствовать устойчивости к другим бета-лактамным антибиотикам. В исследовании 2013 г. [22] было показано, что при искусственной передаче плазмиды, несущей полноценный промотор и сам ген blaZ, повышается устойчивость стафилококка к оксациллину, несмотря на то что фермент не способен гидролизовать этот антибиотик. Механизм устойчивости связывают с негативным влиянием регуляторной системы bla на репрес-сорную функцию MecI. Полученные в ходе настоящего исследования данные косвенно подтверждают возможную роль гиперэкспрессии бета-лактамазы в формировании устойчивости к цефтаролину. Однако для подтверждения таких выводов требуются дополнительные исследования, в частности проведение полногеномного секвенирования и исследование биохимической активности самого фермента в отношении разных бета-лак-тамных антибиотиков. Не совсем понятным остается вопрос о роли меропенема как мощного индуктора синтеза бета-лактамазы, дополнительные исследования в области связывания и активации разных молекул бе-та-лактамов с рецепторами и взаимодействия с самим ферментом также чрезвычайно интересны в свете возможного поиска новых механизмов резистентности.

Уведомление: исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-1500185) и в рамках госзадания 0112-2018-0015.

Исследование проведено с использованием оборудования ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ».

ЛИТЕРАТУРА

1. Who.int [Internet]. Geneva: World Health Organization. Antibacterial agents in clinical development: an analysis of the antibacterial clinical development pipeline, including tuberculosis. [cited 2017 Sep 21] Available from: http://www.who.int/medicines/areas/ rational_use/antibacterial_agents_clinical_develop-ment/en/.

2. Jevons MP. Celbenin-resistant Staphylococci. BMJ. 1961;(1):124-125.

3. Kirby WM. Extraction of a Highly Potent Penicillin Inactivator from Penicillin Resistant Staphylococci. Science. 1944;99(2579):452-453. doi: 10.1126/sci-ence.99.2579.452.

4. Harkins CP, Pichon B, Doumith M, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus emerged long before the introduction of methicillin into clinical practice. Genome Biol. 2017;18(1):130. doi: 10.1186/s13059-017-1252-9.

5. Acar JF, Courvalin P, Chabbert YA. Methicillin-resis-tant staphylococcemia: bacteriological failure of treatment with cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother (Bethesda). 1970;10:280-285.

6. Laudano JB. Ceftaroline fosamil: a new broad-spectrum cephalosporin. J Antimicrob Chemother. 2011;66 Suppl 3:iii11-18. doi: 10.1093/jac/dkr095.

7. Otero LH, Rojas-Altuve A, Llarrull LI, et al. How allosteric control of Staphylococcus aureus penicillin binding protein 2a enables methicillin resistance and physiological function. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110(42): 16808-16813. doi: 10.1073/ pnas.1300118110.

8. Kelley WL, Jousselin A, Barras C, et al. Missense mutations in PBP2A Affecting ceftaroline susceptibility detected in epidemic hospital-acquired methicillin-re-sistant Staphylococcus aureus clonotypes ST228 and ST247 in Western Switzerland archived since 1998. Antimicrob Agents Chemother. 2015;59(4): 1922-30. doi: 10.1128/AAC.04068-14.

9. Lahiri SD, Alm RA. Potential of Staphylococcus aureus isolates carrying different PBP2a alleles to develop resistance to ceftaroline. J Antimicrob Chemother. 2016;71(1):34-40. doi: 10.1093/jac/dkv329.

10. Гостев В.В., Калиногорская О.С., Дмитренко О.А., и др. Молекулярные механизмы снижения чувствительности к цефтаролину метициллинорезистентных Staphylococcus aureus // Антибиотики и химиотерапия. - 2016. - Т. 61. - № 9-10. - С. 17-21. [Gos-tev VV Kalinogorskaya OS, Dmitrenko OA, et al. Molecular Mechanisms of Ceftaroline Susceptibility Reduction in Methicillin-Resistant Staphylococcus auieus. Antibiotics and chemoterapy. 2016;61(9-10):17-21. (In Russ.)]

11. Lahiri SD, Alm RA. Identification of non-PBP2a resistance mechanisms in Staphylococcus aureus after serial passage with ceftaroline: involvement of other PBPs. J Antimicrob Chemother. 2016;71( 11 ):3050-7. doi: 10.1093/jac/dkw282.

12. Chan LC, Gilbert A, Basuino L, et al. PBP 4 Mediates High-Level Resistance to New-Generation Cephalo-sporins in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60(7):3934-3941. doi: 10.1128/ AAC.00358-16.

13. Banerjee R, Gretes M, Harlem C, et al. A mecA-negative strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with high-level beta-lactam resistance contains mutations in three genes. Antimicrob Agents Chemother. 2010;54(11):4900-4902. doi: 10.1128/ AAC.00594-10.

14. Ulaganathan V, Agacan MF, Buetow L, et al. Structure of Staphylococcus aureus 1,4-dihydroxy-2-naph-thoyl-CoA synthase (MenB) in complex with aceto-acetyl-CoA. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007;63(Pt 11):908-913. doi: 10.1107/ S1744309107047720.

15. Hill B, Attwood MM. Purification and characterization of phosphoglycerate mutase from methanol-grown Hy-phomicrobium X and Pseudomonas AMI. J Gen Microbiol. 1976;96(1):185-193. doi: 10.1099/0022128796-1-185.

16. Martin PK, Bao Y, Boyer E, et al. Novel locus required for expression of high-level macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 2002; 184(20):5810-5813. doi: 10.1128/ JB.184.20.5810-5813.2002.

17. Richmond MH. Wild-Type Variants of Exopenicillinase from Staphylococcus Aureus. Biochem J. 1965;94:584-593. doi: 10.1042/bj0940584.

18. Kernodle DS, Stratton CW, McMurray LW, et al. Differentiation of beta-lactamase variants of Staphylococ-cus aureus by substrate hydrolysis profiles. J Infect Dis. 1989;159(1):103-108. doi: 10.1093/infdis/159.1.103.

19. Fuda CC, Fisher JF, Mobashery S. Beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus: the adaptive resistance of a plastic genome. Cell Mol Life Sci.

2005;62(22):2617-2633. doi: 10.1007/s00018-005-5148-6.

20. Hiramatsu K, Asada K, Suzuki E, et al. Molecular cloning and nucleotide sequence determination of the regulator region of mecA gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). FEBS letters. 1992;298(2-3):133-6. doi: 10.1016/0014-5793(92)80039-J.

21.Blazquez B, Llarrull LI, Luque-Ortega JR, et al. Regulation of the expression of the beta-lactam antibiotic-resistance determinants in methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Biochemistry. 2014;53(10):1548-1550. doi: 10.1021/bi500074w.

22. Arede P, Ministro J, Oliveira DC. Redefining the role of the beta-lactamase locus in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: beta-lactamase regulators disrupt the Mecl-mediated strong repression on mecA and optimize the phenotypic expression of resistance in strains with constitutive mecA expression. Anti-microb Agents Chemother. 2013;57(7):3037-3045. doi: 10.1128/AAC.02621-12.

Ф Информация об авторах

Юлия Викторовна Сопова — канд. биол. наук, научный сотрудник, лаборатория генетического моделирования заболеваний человека. Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Санкт-Петербург. E-mail: sopova@ hotmail.com.

Анна Николаевна Лыхолай — специалист по МАЛДИ масс-спектром етрии и хроматографии, ресурсный центр «Развитие молекулярных и клеточных технологий». ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург. E-mail: a.lykholay@ spbu.ru.

Владимир Валерьевич Гостев — канд. биол. наук, научный сотрудник, отдел медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии. ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней» Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].

Ольга Серафимовна Калиногорская — канд. мед. наук, научный сотрудник, отдел медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии. ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней» Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].

Сергей Владимирович Сидоренко — д-р биол. наук, профессор, заведующий отделом, отдел медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии. ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней» Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург. E-mail: [email protected].

'S Information about the authors

Julia V. Sopova — PhD, Researcher, Laboratory of Genetic Models of Human Diseases, St. Petersburg branch of Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences. Saint Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].

Anna N. Lykholay — MALDI Mass-Spectrometry and Chromatog-raphy Specialist, Research Resource Center for Molecular and Cell Technologies, Saint Petersburg State University. Saint Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].

Vladimir V. Gostev — Researcher, PhD, Department of Medical Microbiology and Molecular Epidemiology. Pediatric Research and Clinical Center for Infectious Diseases. Saint Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].

Olga S. Kalinogorskaya — Researcher, PhD, Department of Medical Microbiology and Molecular Epidemiology. Pediatric Research and Clinical Center for Infectious Diseases. Saint Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].

Sergey V. Sidorenko — Professor, Head, Department of Medical Microbiology and Molecular Epidemiology. Pediatric Research and Clinical Center for Infectious Diseases. Saint Petersburg, Russia. E-mail: [email protected].