CC BY
42
2017, Т. 159, кн. 2 С. 248-261
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
УДК 579.887.121
АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ К ФТОРХИНОЛОНАМ: МОДУЛЯЦИЯ ПРОТЕОМА И ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ Acholeplasma laidlawii
12 1 12 Е.С. Медведева ' , Т.Ю. Малыгина , Н.Б. Баранова ' ,
12 1 12 12 А.А. Музыкантов ' , М.Н. Давыдова , О.А. Чернова ' , В.М. Чернов '
1 Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, г. Казань, 420111, Россия 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия
Аннотация
Недавно было установлено, что активное участие в адаптации Acholeplasma laidlawii -микоплазмы, являющейся возбудителем микоплазмозов у растений и животных, а также основным контаминантом клеточных культур, к антимикробным препаратам и патогенезе - принимают внеклеточные везикулы - окруженные мембраной наноструктуры, опосредующие у бактерий секрецию, сигналинг и межклеточную коммуникацию. В настоящей работе впервые показано, что развитие устойчивости A. laidlawii к ципрофлокса-цину - широко применяемому для подавления микоплазм препарату группы фторхино-лонов - сопровождается значительными изменениями везикулярного протеома, существенная часть которого представлена факторами бактериальной вирулентности, и повышением митотоксичности в отношении клеток эукариот - лимфоцитов периферической крови человека in vitro. Полученные результаты определяют необходимость коррекции системы контроля микоплазмозов и микоплазменных контаминаций клеточных культур с учетом нового типа инфектов - внеклеточных везикул бактерий.
Ключевые слова: микоплазмы, Acholeplasma laidlawii, внеклеточные везикулы, ципрофлоксацин, устойчивость, протеом, факторы вирулентности, генотоксичность, мутагенность
Введение
Контроль микоплазменных инфекций и контаминаций представляет серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства, фундаментальных исследований и практических работ, связанных с клеточными технологиями и биотехнологическим производством [1-4]. Микоплазменная контаминация может приводить к изменению множества параметров клеток в культуре, перестройке метаболизма, необратимой трансформации, потере клеточной линии и, соответственно, ложной интерпретации результатов исследований [5-7]. Распространенный способ решения проблемы микоплазменных инфекций и контами-наций - использование антибактериальных препаратов группы фторхинолонов, макролидов и тетрациклинов [5, 8, 9]. Основной проблемой при этом является быстрая адаптация микоплазм к антимикробным препаратам, механизмы которой не вполне ясны [7].
Недавно было показано, что в развитие устойчивости к антимикробным препаратам у бактерий, в том числе у микоплазм, могут быть вовлечены внеклеточные везикулы (ВВ) [10, 11]. ВВ - сферические, окруженные мембраной наноструктуры диаметром менее 0.2 мкм, опосредующие белковый трафик и перенос детерминант вирулентности и участвующие в формировании системы паразит -хозяин, а также в адаптации к различным условиям среды [5, 12-14]. На примере Acholeplasma laidlawii - микоплазмы, инфицирующей человека, животных, насекомых, основного контаминанта клеточных культур и вакцинных препаратов, возбудителя фитомикоплазмозов, было показано активное участие ВВ в развитии устойчивости бактерии к фторхинолонам и установлено, что внеклеточные везикулы предшествуют проникновению клеток микоплазмы в ткани растений, вызывают нарушение их ультраструктуры, индуцируют модуляцию экспрессии генов и синтеза белков инфицированных организмов [5, 15-19]. В результате глобального протеомного профилирования в составе везикул A. laidlawii PG8 было идентифицировано значительное количество факторов вирулентности [20, 21], в том числе с потенциальной генотоксичностью в отношении клеток эукариот.
Ранее нами были получены данные, свидетельствующие, что A. laidlawii обладает токсигенным и мутагенным потенциалом, и показано, что везикулы ми-коплазмы могут проявлять мутагенный эффект в отношении лимфоцитов периферической крови человека in vitro [18, 22]. Однако в литературе отсутствуют какие-либо сведения о сравнительном анализе генотоксичности ВВ у штаммов A. laidlawii с дифференциальной чувствительностью к антибактериальным препаратам. В этой связи задачей нашей работы явилось выяснение особенностей протеомного профиля и генотоксичности внеклеточных везикул, продуцируемых клетками штаммов A. laidlawii, различающихся по чувствительности к ци-профлоксацину.
Материалы и методы
В работе использовали штамм A. laidlawii PG8В, полученный из коллекции микроорганизмов ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (г. Москва). Культивирование A. laidlawii PG8B проводили при 37°С на модифицированной жидкой питательной среде Эдварда (ПСЭ). Устойчивый штамм получали последовательным пересевом исходного штамма A. laidlawii PG8B в ПСЭ с возрастающей концентрацией антибиотика (ципрофлоксацин). В результате был получен штамм A. laidlawii PG8Ri0, растущий при концентрации ципрофлоксацина 10 мкг/мл. Чувствительный штамм A. laidlawii PG8S получали путем отбора клонов исходного штамма, растущих при концентрации ципро-флоксацина ниже значения минимальной ингибирующей концентрации антибиотика, определенной для A. laidlawii PG8B.
Определение чувствительности A. laidlawii к антибиотику проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде с градиентом концентрации антибактериального препарата с последующим определением минимальной ингибирующей концентрации.
Выделение и очистку внеклеточных везикул из культур различающихся по чувствительности к антибиотику штаммов A. laidlawii, а также контроль чистоты
препаратов (отсутствие в образцах клеток микоплазмы) проводили согласно алгоритму [23], модифицированному в соответствии с особенностями культивирования микоплазмы [22].
Генотоксичность внеклеточных везикул A. laidlawii оценивали по влиянию ВВ на уровень митотической активности лимфоцитов периферической крови человека, а также на частоту хромосомных и геномных нарушений в метафазных пластинках культивированных in vitro лимфоцитов [24]. Препараты исследовали с помощью системы автоматического сканирования Metafer 4 с микроскопом проходящего света AxioImager.Z2 (Zeiss, Германия) и системы кариотипирова-ния Ikaros (MetaSystems, Германия).
Протеомное профилирование внеклеточных везикул осуществляли с помощью 1D-LC-ESI-MS/MS согласно [25]. Для идентификации белков использовали программу Mascot MS/MS Ions Search. Классификацию идентифицированных белков проводили в соответствии с функциональными категориями COG (www.ncbi.nlm.nih.gov/COG).
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения Microsoft Excel, для сравнения значений использовали критерий х2 и критерий Стьюдента.
Результаты и их обсуждения
Для выяснения особенностей протеомного профиля и генотоксичности внеклеточных везикул, продуцируемых клетками различающихся по чувствительности к ципрофлоксацину штаммов A. laidlawii, нами были использованы лабораторный штамм A. laidlawii PG8В (МПК - 0.5 мкг/мл), A. laidlawii PG8B, обработанный ципрофлоксацином (A. laidlawii PG8BCIP+), а также полученные от него штаммы с дифференциальной чувствительностью к ципрофлоксацину, проявляющие повышенную чувствительность - A. laidlawii PG8S (МПК - 0.2 мкг/мл) -и устойчивость к антимикробному препарату - A. laidlawii PG8R10 (МПК -20 мкг/мл) и A. laidlawii PG8R10, выращенный на ПСЭ без ципрофлоксацина (A. laidlawii PG8R^CIP-).
С помощью 1D-LC-ESI-MS/MS в везикулах штаммов микоплазмы нами идентифицированы белки (97 у A. laidlawii PG8B, 62 у A. laidlawii PG8BCIP+, 17 у A. laidlawii PG8R10, 19 у A. laidlawii PG8R10CIP- и 78 у A. laidlawii PG8S) и получены данные, свидетельствующие о существенных различиях везикулярного протеома у штаммов A. laidlawii с дифференциальной чувствительностью к ци-профлоксацину как в количественном, так и в качественном отношении.
Спектры везикулярных белков у A. laidlawii PG8В, A. laidlawii PG8R10, A. laidlawii PG8S различаются как у разных штаммов, так и у одного и того же штамма при культивировании в присутствии/отсутствие антимикробного препарата (рис. 1). В везикулярном профиле штаммов обнаруживаются целевые белки ципрофлоксацина, а также других антибактериальных препаратов, универсального каскада стресс-реактивности, фундаментальных клеточных процессов и вирулентности. При этом в везикулах всех штаммов преобладают цитоплазмати-ческие белки, значительную долю составляют белки, участвующие в энергообразовании, трансляции, а также в транспорте и метаболизме углеводов. Существенная часть везикулярных белков приходится на факторы вирулентности
Рис. 1. Диаграмма Венна «общих» и «специфичных» белков, выявленных в везикулах штаммов А. 1а1ё1ам>И РвББ, А. ¡тШами Р08БС1Р+, А. ЫШами РО8К10, А. 1а1ё1ам>И РО8К10С1Р-и А. ШЛам>и PG8S. В скобках указано количество идентифицированных белков
бактерий (38%, 50%, 41%, 74% и 50% для А. Шкт>п Р08В, А. Шкт>п Р08ВС1Р+, А. ШМам>и Р08Я10, А. ШМам>п PG8Rl0CIP- и А. ЫМам>и PG8S соответственно). При этом спектры факторов вирулентности в везикулах всех исследуемых штаммов А. ШЛам>п весьма различаются.
В везикулах А. aid¡awii PG8B, А. ЫЛам>и PG8Rl0CIP-, а также А. ЫЛам>п Р08$ регистрируется глобальный регулятор вирулентности - полирибонуклео-тид-нуклеотидилтрансфераза (PNPase), тогда как в везикулах А. ¡aid¡awii PG8Rl0 и А. ¡aid¡awii PG8BCIP+ этот белок не обнаруживается. PNPase участвует в инвазии бактериальных патогенов и их внутриклеточной репликации [26]. Отсутствие этого белка в везикулах соответствующих штаммов может указывать на изменение стратегии патогенности бактерии в присутствие антимикробных препаратов. Различия в спектре везикулярных белков у всех штаммов микоплазмы, ассоциированных с факторами бактериальной вирулентности, могут определять дифференциальность патогенного потенциала соответствующих инфектов.
Важными показателями при оценке генотоксичности различных соединений является их мутагенность и пролиферативная активность обработанных ими клеток [24]. При этом наличие митотоксичного или митозостимулирующего действия ВВ, продуцируемых клетками бактерий, можно оценить по уровню ми-тотической активности лимфоцитов периферической крови человека - митоти-ческим индексом (МИ), который отражает соотношение числа клеток, находящихся в митозе, к общему числу проанализированных клеток изучаемой ткани, а в случае лимфоцитов - способности к трансформации их до бластов и к делению. Мутагенное действие везикул, продуцируемых клетками бактерий, может определяться по частоте хромосомных и геномных нарушений в метафазных пластинках лимфоцитов периферической крови человека в присутствие соответствующих наноструктур.
а юн
30%
[ ВВ ЛЛаШаюИ РС8В
II ВВ А.!аШаки РС8В<1Р+
III ВВ АШШаш Р(,8Кт
IV ВВ А-ЫШаки РСвИю™
V ВВ ААаШакИ РС88
* * * * 4% 3% 5% 2% 0%
II III IV
V контроль
б 100
ч® 40
и X 80
ы
ч 70
X
=
60
=
а 41
и
а
Т 40
=
н о 30
г"
= 5 20
10
I ВВ А.ШсИакИ РС8В
II ВВ А.Ш/апИ РС8ВПР
III ВВ А.1аШ1т'Н РСвИю
IV ВВ А.1аМ1(ти Р(,8К|п"
V ВВ А.1аШ1акН РС88
34%
5%
ш
0,7% 0,5% 0,6% 3%
III IV V контроль
Рис. 2. Мутагенность (а) и митотоксичность (б) ВВ штаммов А. Шё1ам>и. Контроль -лимфоциты периферической крови человека без добавления ВВ штаммов А. Шё1см>и. Звездочкой обозначены значимые отличия от ВВ А. Шё1ам>и Рв8В, р < 0.05
1> ¡¡а «и п к 1 2 3 4 5 Ь и ъ 2« 5ё II 6 7 8 9 10 11 12 Й ЙЯ II ¿к а 5 ы 13 14 15 16 17 18 КЙ О А щб КЙ 19 20 21 22 X У б *. V * «ч
И II 1 н 1 1 2 3 4 5 2 И «1 и п и II 6 7 8 9 10 11 12 «6 в* Н «1 и А 13 14 15 16 17 18 II ** 44 I) 19 20 21 22 XV г Л - ¿тс* * г* / ^ *
Рис. 3. Кариограммы (а, в) и метафазные пластинки (б, г) лимфоцитов периферической крови человека при культивировании в присутствии ВВ штаммов А. laidlawii: а, б - мутагенность ВВ А. Ыё1ам>и Р08ВСП>+; в, г - мутагенность ВВ А. Ыё1ам>и Рв8Я10
Результаты определения МИ, а также уровня хромосомных и геномных аберраций при совместном культивировании лимфоцитов периферической крови человека с ВВ разных штаммов А. ШЛам>и представлены на рис. 2 и 3.
В результате проведения соответствующих исследований нами было установлено, что ВВ A. laidlawii PG8B, A. laidlawii PG8BCIP+, A. laidlawii PG8R10, A. laidlawii PG8R10 и A. laidlawii PG8S могут проявлять генотоксичные свойства в отношении лимфоцитов периферической крови человека - индуцировать геномные нарушения (гипоплоидия) и подавление митотической активности клеток эукариот (рис. 2, 3). Однако характер и степень проявления генотоксич-ности везикул, продуцируемых клетками штаммов с дифференциальной чувствительностью к ципрофлоксацину, различаются. При этом развитие устойчивости к антимикробному препарату у микоплазмы сопровождается повышением митотоксичности и снижением мутагенности.
Как следует из полученных нами данных, везикулы штамма A. laidlawii PG8B снижают митотический индекс лимфоцитов периферической крови в 6.8 раз и индуцируют гипоплоидию у 30% клеток. В кариограммах гипоплоидных клеток отмечается резкое снижение количества хромосом - вплоть до 19-25. При этом среди анеуплоидных клеток регистрируются Х-моносомии, а также моносомии и нуллисомии по аутосомным хромосомам.
Характер изменений митотического индекса лимфоцитов, культивируемых с везикулами штаммов A. laidlawii PG8BCIP+, PG8R10 и PG8R10 , в значительной мере совпадает - наблюдается почти полное подавление пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови человека. Результаты анализа кариограммы лимфоцитов, обработанных везикулами этих штаммов, свидетельствуют об отсутствии в метафазах видимых хромосомных/хроматидных нарушений, но встречаются клетки с гипоплоидией.
Согласно сравнительному анализу везикулярного протеома штаммов A. laidlawii с дифференциальной чувствительностью к ципрофлоксацину, в составе ВВ присутствуют только два «общих» белка - енолаза и фактор элонгации Tu, которые ассоциированы с адгезией инфектов - бактериальной вирулентностью, определяющей генотоксичный потенциал [27, 28]. В ответ на прикрепление бактерий к эукариотической клетке эти белки могут индуцировать универсальный каскад реакций, определяющих задержку клеточного деления. Однако существенные различия в уровне митотоксичности и мутагенности ВВ у A. laidlawii PG8B, A. laidlawii PG8R10 и A. laidlawii PG8S позволяют предположить возможность вовлечения и других везикулярных компонентов в реализацию соответствующих эффектов.
Согласно данным литературы, ряд бактериальных белков (цикломодулины, цитотоксины, GroEL, Hsp60, а также некоторые специфичные для разных видов бактерий полипептиды) могут влиять на пролиферативную активность клеток эукариот [29, 30]. В составе ВВ штаммов A. laidlawii PG8B, A. laidlawii PG8BCIP+ и A. laidlawii PG8S нами был обнаружен белок GroEL, который у бактерий является мультифункциональным белком-совместителем ("protein moonlighting"). Показано, что этот белок и его гомологи могут оказывать влияние на скорость роста клеточных культур и индуцировать цитотоксичность в отношении клеток человека in vitro [31]. Однако отсутствие GroEL в везикулах A. laidlawii PG8R10 указывает на то, что генотоксичность ВВ микоплазмы может быть связана и с другими элементами наноструктур. Идентификация факторов генотоксично-сти ВВ микоплазмы предполагает всесторонний анализ состава этих структур,
основанный на использовании комплексного подхода с применением современных методов высокого разрешения.
Заключение
В результате наших исследований впервые выполнен сравнительный анализ протеомного профиля и мутагенности внеклеточных везикул у штаммов A. laidlawii с дифференциальной чувствительностью к ципрофлоксацину, и показано, что внеклеточные везикулы всех штаммов проявляют генотоксичность в отношении эукариотических клеток, которая отчасти может быть связана с особенностями протеомного профиля штаммов микоплазмы. Полученные нами результаты свидетельствуют о выраженной модуляции везикулярного протео-ма у микоплазмы при изменении условий и относительной специфичности паттерна секретируемых белков в каждом конкретном случае. При этом значительная доля белков в ВВ у всех штаммов связана с факторами бактериальной вирулентности, различный спектр которых может определять дифференциальность их патогенного потенциала.
Существенное изменение степени пролиферативной активности и геномных нарушений в лимфоцитах периферической крови человека при культивировании их с везикулами штамма A. laidlawii, проявляющего повышенную устойчивость к ципрофлоксацину, может быть обусловлено существенной модуляцией везикулярного состава у микоплазмы при адаптации к антимикробному препарату. Данные в пользу этого предположения получены для Acinetobacter baumanii и Staphylococcus aureus в связи с развитием у бактерий устойчивости к антимикробным препаратам [32, 33].
Для идентификации всех факторов генотоксичности ВВ потребуется анализ ВВ с применением широкого спектра омикс-технологий, включая анализ профиля РНК. Вместе с тем очевидно, что присутствие в везикулах факторов бактериальной вирулентности у всех штаммов микоплазмы и генотоксичность, проявляемая ВВ в отношении эукариотических клеток, определяют необходимость коррекции системы контроля микоплазменных инфекций с учетом ин-фектов нового типа и изменения регламента работы с клеточными культурами.
Благодарности. Авторы выражают благодарность врачу-генетику ООО «Клиника Нуриевых» Л.Р. Самойловой за помощь в проведении экспериментов по определению генотоксичности.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты № 15-4402594, 16-34-00660) и гранта Президента РФ (проект № МК-1099.2017.4).
В исследовании использовали оборудование Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России (ID RFMEFI59414X0003).
Литература
1. Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М., Вишняков И.Е. Микоплазмы в биологии и медицине XXI века. - СПб: Наука, 2016. - 400 с.
2. Maniloff J. Phylogeny and Evolution // Molecular biology and pathogenicity of Mycoplasmas / Ed. by Sh. Razin, R. Herrman. - N. Y.: Kluwer Academic/Plenum Publ., 2002. -572 p.
3. Razin Sh. The genus Mycoplasma and related genera (Class Mollicutes) // The Prokaryotes. -2006. - V. 4: Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria. - P. 836-904.
4. Rottem S., Kosower N.S., Kornspan J.D. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas // Biomedical Tissue Culture / Ed. by L. Ceccherini-Nelli, B. Matteoli. - InTech, 2012 - P. 953-978. - doi: 10.5772/51518.
5. Чернов В.М., Чернова О.А., Санчес-Вега Х.Т., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Ми-коплазменные контаминации клеточных культур: везикулярный трафик у бактерий и проблема контроля инфектогенов // Acta Naturae. - 2014. - Т. 6, № 3. - С. 43-53.
6. Mariotti E., D'Alessio F., Mirabelli P., Di Noto R., Fortunato G., Del Vecchio L. Mol-licutes contamination: a new strategy for an effective rescue of cancer cell lines // Bio-logicals. - 2012. - V. 40, No 1. - P. 88-91. - doi: 10.1016/j.biologicals.2011.10.006.
7. Uphoff C.C., Drexler H. Elimination of mycoplasmas from infected cell lines using antibiotics // Methods Mol. Biol. - 2011. - V. 731. - P. 105-114. - doi: 10.1007/978-1-61779-080-5_9.
8. Bebear C.M., Pereyre S., Peuchant O. Mycoplasma pneumoniae: susceptibility and resistance to antibiotics // Future Microbiol. - 2011. - V. 6, No 4. - P. 423-431. - doi: 10.2217/fmb.11.18.
9. Uphoff C.C., Drexler H.G. Detection of mycoplasma contaminations // Meth. Mol. Biol. -2013. - V. 946. - Р. 1-13. - doi: 10.1007/978-1-62703-128-8_1.
10. Чернов В.М., Чернова О.А., Горшков О.В., Баранова Н.Б., Музыкантов А.А., Нестерова Т.Н., Пономарева А.А. Взаимодействие микоплазм и растений: экстраклеточные мембранные везикулы и фитопатогенность Acholeplasma laidlawii PG8 // Докл. РАН. - 2013. - Т. 450, № 4. - С. 483-487. - doi: 10.7868/S086956521316024X.
11. Windsor H.M., Windsor G.D., Noordergraaf J.H. The growth and long term survival of Acholeplasma laidlawii in media products used in biopharmaceutical manufacturing // Bio-logicals. - 2010. - V. 38, No 2. - P. 204-210. - doi: 10.1016/j.biologicals.2009.11.009.
12. Kulp A., Kuehn M.J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles // Annu. Rev. Microbiol. - 2010. - V. 64. - P. 163-184. - doi: 10.1146/annurev.micro.091208.073413.
13. Manning A.J., Kuehn M.J. Contribution of bacterial outer membrane vesicles to innate bacterial defense // BMC Microbiol. - 2011. - V. 11. - Art. 258, P. 1-14. - doi: 10.1186/1471-2180-11-258.
14. Medvedeva E.S., Baranova N.B., Mouzykantov A.A., Grigorieva (Malygina) T.Y., Da-vydova M.N., Trushin M.V., Chernova O.A., Chernov V.M. Adaptation of mycoplasmas to antimicrobial agents: Acholeplasma laidlawii extracellular vesicles mediate the export of ciprofloxacin and a mutant gene related to the antibiotic target // Sci. World J. - 2014. -V. 2014. - Art. 150615, P. 1-7. - doi: 10.1155/2014/150615.
15. Чернов В.М., Чернова О.А., Медведева Е.С., Сорвина А.И., ДавыдоваМ.Н., РоговаМ.А., Серебрякова М.В. Ответные реакции клеток Acholeplasma laidlawii PG8 на холодо-вой шок и окислительный стресс: протеомный анализ и стресс-реактивные белки микоплазмы // Докл. РАН. - 2010. - Т. 432, № 5. - С. 708-711.
16. Чернов В.М., Чернова О.А., Медведева Е.С., Давыдова М.Н. Адаптация микоплазм к условиям среды: особенности реорганизации протеома у Acholeplasma laidlawii PG8 при длительном воздействии стрессоров // Докл. РАН. - 2011. - Т. 438, № 4. -С. 562-565.
17. Медведева Е.С., Баранова Н.Б., Музыкантов АА., Григорьева Т.Ю., Давыдова М.Н., Чернова О.А., Чернов В.М. Экстраклеточные везикулы микоплазм и формирование устойчивости бактерий к фторхинолонам // Докл. РАН. - 2014. - Т. 454, № 6. -С. 725-728. - doi: 10.7868/S0869565214060255.
18. Chernov V.M., Chernova O.A., Mouzykantov A.A., Efimova I.R., Shaymardanova G.F., Medvedeva E.S., Trushin M.V. Extracellular vesicles derived from Acholeplasma laidlawii PG8 // Sci. World J. - 2011. - V. 11 - P. 1120-1130. - doi: 10.1100/tsw.2011.109.
19. Chernov V.M., Chernova O.A., Medvedeva E.S., Mouzykantov A.A., Ponomareva A.A., Shaymardanova G.F., Gorshkov O. V., Trushin M.V. Unadapted and adapted to starvation Acholeplasma laidlawii cells induce different responses of Oryza sativa, as determined by proteome analysis // J. Proteomics. - 2011. - V. 74, No 12. - P. 2920-2936. - doi: 10.1016/j.jprot.2011.07.016.
20. Музыкантов А.А., Баранова Н.Б., Медведева Е.С., Григорьева Т.Ю., Чернова О.А., Чернов В.М. Экспортируемые белки микоплазм: протеом экстраклеточных мембранных везикул Acholeplasma laidlawii PG8 // Докл. РАН. - 2014. - Т. 455, № 1. -С. 99-104. - doi: 10.7868/S086956521407024X.
21. Медведева Е.С., Давыдова М.Н., Музыкантов А.А., Баранова Н.Б., Григорьева Т.Ю., Синягина М.Н., Булыгина Е.А., Чернова О.А., Чернов В.М. Геномный и протеомный профили штаммов A. laidlawii, различающихся по чувствительности к ципро-флоксацину // Докл. РАН. - 2016. - Т. 466, № 2. - С. 228-232. - doi: 10.7868/S0869565216020274.
22. Chernov V.M., Mouzykantov A.A,, Baranova N.B., Medvedeva E.S., Grygorieva T.Y., Trushin M.V., Vishnyakov I.E., Sabantsev A.V., Borchsenius S.N., Chernova O.A. Extracellular membrane vesicles secreted by mycoplasma Acholeplasma laidlawii PG8 are enriched in virulence proteins // J. Proteomics. - 2014. - V. 110. - P. 117-128. - doi: 10.1016/j.jprot.2014.07.020.
23. Lee E.Y., Choi D.Y., Kim D.K. Gram-positive bacteria produce membrane vesicles: pro-teomics-based characterization of Staphylococcus aureus-derived membrane vesicles // Proteomics. - 2009. - V. 9, No 24. - P. 5425-5436. - doi: 10.1002/pmic.200900338.
24. Прохорова И.М., Фомичёва П.Н., Ковалёва М.И. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды. — Ярославль: Яросл. гос. ун-т, 2003. - 32 с.
25. Lazarev V.N., Levitskii S.A., Basovskii Y.I., Chukin M.M., Akopian T.A., Vereshchagin V.V., Kostrjukova E.S., Kovaleva G.Y., Kazanov M.D., Malko D.B., Vitreschak A.G., Sernova N.V., Gelfand M.S., Demina I.A., Serebryakova M.V., Galyamina M.A., Vtyurin N.N., Rogov S.I., Alexeev D.G., Ladygina V.G., Govorun V.M. Complete genome and proteome of Acholeplasma laidlawii // J. Bacteriol. - 2011. - V. 193, No 18. - P. 4943-4953. - doi: 10.1128/JB.05059-11.
26. Clements M.O., Eriksson S., Thompson A., Lucchini S., Hinton J.C., Normark S., Rhen M. Polynucleotide phosphorylase is a global regulator of virulence and persistency in Salmonella enterica // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2002. - V. 99, No 13. - P. 8784-8789.
27. Henderson B., Martin A. Bacterial moonlighting proteins and bacterial virulence // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2013. - V. 358. - P. 155-213. - doi: 10.1007/82_2011_188.
28. Thomas C.M., Jacobs E., Dumke R. Characterization of pyruvate dehydrogenase subunit B and enolase as plasminogen-binding proteins in Mycoplasma pneumoniae // Microbiology. - 2013. - V. 159, Pt. 2. - P. 352-365. - doi: 10.1099/mic.0.061184-0.
29. Goulhen F., Hafezi A., Uitto V.J., Hinode D., Nakamura R., Grenier D., Mayrand D. Subcellular localization and cytotoxic activity of the GroEL-like protein isolated from Actinobacillus actinomycetemcomitans // Infect. Immun. - 1998. - V. 66, No 11. -P. 5307-5313.
30. De Rycke J., Ducommun B. Bacterial cyclostatin, or how do bacteria manipulate the eu-karyotic cell cycle // Med. Sci. (Paris). - 2003. - V. 19, No 11. - P. 1128-1136.
31. Smitherman L.S., Minnick M.F. Bartonella bacilliformis GroEL: Effect on growth of human vascular endothelial cells in infected cocultures // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2005. -V. 1063. - P. 286-298.
32. Li Z.T., Zhang R.L., Bi X.G., Xu L., Fan M., Xie D., Xian Y., Wang Y., Li X.J., Wu Z.D., Zhang K.X. Outer membrane vesicles isolated from two clinical Acinetobacter baumannii strains exhibit different toxicity and proteome characteristics // Microb. Pathog. - 2015. -V. 81. - P. 46-52. - doi: 10.1016/j.micpath.2015.03.009.
33. Jeon H., Oh M.H., Jun S.H., Kim S.I., Choi C. W., Kwon H.I., Na S.H., Kim Y.J., Nicholas A., Selasi G.N., Lee J.C. Variation among Staphylococcus aureus membrane vesicle proteo-mes affects cytotoxicity of host cells // Microb. Pathog. - 2016. - V. 93. - P. 185-193. -doi: 10.1016/j.micpath.2016.02.014.
Поступила в редакцию 16.02.17
Медведева Елена Сергеевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза; ассистент кафедры генетики
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
ул. Лобачевского, д. 2/31, г. Казань, 420111, Россия Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: elena-med@list.ru
Малыгина Татьяна Юрьевна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза; ассистент кафедры генетики
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
ул. Лобачевского, д. 2/31, г. Казань, 420111, Россия Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: redfox-house@mail.ru
Баранова Наталья Борисовна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза; ассистент кафедры генетики Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
ул. Лобачевского, д. 2/31, г. Казань, 420111, Россия Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: natalja-b@yandex.ru
Музыкантов Алексей Александрович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза; старший научный сотрудник НИЛ «Омиксные технологии»
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
ул. Лобачевского, д. 2/31, г. Казань, 420111, Россия Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: muzaleksei@mail.ru
Давыдова Марина Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
ул. Лобачевского, д. 2/31, г. Казань, 420111, Россия E-mail: davydova@mail.knc.ru
Чернова Ольга Александровна, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ патогенеза; профессор кафедры генетики Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
ул. Лобачевского, д. 2/31, г. Казань, 420111, Россия Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: ol.chernova2010@yandex.ru
Чернов Владислав Моисеевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ патогенеза; заведующий кафедрой генетики
Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН
ул. Лобачевского, д. 2/31, г. Казань, 420111, Россия Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: chernov@kibb.knc.ru
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)
2017, vol. 159, no. 2, pp. 248-261
Adaptation of Mycoplasmas to Fluoroquinolones: Modulation of Proteome and Genotoxicity of Extracellular Vesicles of Acholeplasma laidlawii
E.S. Medvedevaa'b*, T.Y Malyginaa", N.B. Baranovaab, А.А. Mouzykantovab, M.N. Davydovah, O.A. Chernova a'b, V.M. Chernov a'b
3Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Kazan Scientific Center, Russian Academy of Sciences, Kazan, 420111 Russia
bKazan Federal University, Kazan, 420008 Russia E-mail: elena-med@list.ru, redfox-house@mail.ru
Received February 16, 2017 Abstract
The paper is devoted to the comparative analysis of proteomic profiles and genotoxicity of extracellular vesicles produced by cells that differ in sensitivity to ciprofloxacin of Acholeplasma laidlawii strains - the mycoplasma, being a causative agent of mycoplasmoses of plants and animals, as well as the main contaminant of cell cultures. The relevance of the study is determined by the fact that extracellular vesicles - nanostructures surrounded by a membrane mediating intercellular communication and patho-genesis in bacteria are involved in adaptation of A. laidlawii to antimicrobials and present a new type of infects, the study of which is associated with the prospects of determining the mechanisms of hostparasite systems and solution of problems of pathogen control. The present study has been performed with a view of elucidation of the proteome profile features and assessment of the genotoxicity of extracellular vesicles of A. laidlawii in the development of resistance of the mycoplasma to ciprofloxacin -a drug of fluoroquinolone group which is widely used for inhibiting mycoplasmas. To achieve this goal, we have used the standard microbiological methods, as well as the modern physical and chemical methods, including proteomic profiling with help of 1D-LC-ESI-MS/MS, PCR, automatic scanning, and karyotyping system for assessment of the genotoxicity of vesicles.
It has been shown that a significant part of vesicular proteome of A. laidlawii strains with differential sensitivity to ciprofloxacin represents the bacterial virulence factors, as well as that the vesicles of all strains exhibit genotoxicity to lymphocytes of human peripheral blood in vitro. The most important of these results is the fact that the development of resistance of A. laidlawii to ciprofloxacin is accompanied by a significant modulation of vesicular proteome and the increase of mitotoxicity to eukaryotic cells. The obtained data are essential for fundamental research and applied works in the control system
of socially significant infections, contaminations of cell cultures and vaccines. The results of the study provide fundamentally new notions about the processes of adaptation of A. laidlawii to antimicrobial drugs and pathogenicity of extracellular vesicles of mycoplasma, as well as suggest the necessity for correction of the control system of mycoplasmas with a view of bacterial vesicles as a new type of infects.
Keywords: mycoplasmas, Acholeplasma laidlawii, extracellular vesicles, ciprofloxacin, resistance, proteome, virulence factors, genotoxicity, mutagenicity
Acknowledgments. We are grateful to L.R. Samoilova, a genetic doctor at OOO Klinika Nurievykh, for her help in performing the experiments on genotoxicity.
The study was supported by the Russian Foundation for Basic Research (projects no. 15-44-02594, 16-34-00660) and the Grant of the President of the Russian Federation (project no. MK-1099.2017.4).
The investigation was carried out using the equipment of the Interdisciplinary Center of Shared Facilities, Kazan State University with the state support from the Ministry of Education and Science of the Russian Federation (ID RFMEFI59414X0003).
Figure Captions
Fig. 1. Venn's diagram showing "common" and "specific" proteins revealed in vesicles of the following stains: A. laidlawii PG8B, A. laidlawii PG8BCIP+, A. laidlawii PG8Ri0, A. laidlawii PG8Ri0CIP-, and A. laidlawii PG8S. The number of identified proteins is given in brackets.
Fig. 2. Mutagenicity (a) and mitotoxicity (b) of BB strains of A. laidlawii. Control variant - lymphocytes of human peripheral blood without addition of ВВ strains of A. laidlawii. Significant differences from ВВ A. laidlawii PG8B,p < 0.05 are shown with shown with asterisk mark.
Fig. 3. Karyograms (a, c) and metaphase plates (b, d) of lymphocytes in human peripheral blood during cultivation in the presence of ВВ strains of A. laidlawii. a, b - mutagenicity of ВВ A. laidlawii PG8BCIP+; c, d - mutagenicity of ВВ A. laidlawii PG8R10.
References
1. Borkhsenius S.N., Chernova O.A., Chernov V.M., Vishnyakov I.E. Mycoplasma in Biology and Medicine of the 21st Century. St. Petersburg, Nauka, 2016. 400 p. (In Russian)
2. Maniloff J. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Phylogeny and Evolution. Razin Sh., Herrman R. (Eds.). New York, Kluwer Academic/Plenum Publ., 2002. 572 p.
3. Razin Sh. The Prokaryotes. The Genus Mycoplasma and Related Genera (Class Mollicutes). Vol. 4. Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria. 2006, pp. 836-904.
4. Rottem S., Kosower N.S., Kornspan J.D. Biomedical Tissue Culture. Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas. Ceccherini-Nelli L., Matteoli B. (Eds.). InTech, 2012, pp. 953-978. doi: 10.5772/51518.
5. Chernov V.M., Chernova O.A., Sanchez-Vega J.T., Kolpakov A.I., Ilinskaya O.N. Mycoplasma contamination of cell cultures: Vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Nat., 2014, vol. 6, no. 3, pp. 41-51.
6. Mariotti E., D'Alessio F., Mirabelli P., Di Noto R., Fortunata G., Del Vecchio L. Mollicutes contamination: A new strategy for an effective rescue of cancer cell lines. Biologicals, 2012, vol. 40, no. 1, pp. 88-91. doi: 10.1016/j.biologicals.2011.10.006.
7. Uphoff C.C., Drexler H. Elimination of mycoplasmas from infected cell lines using antibiotics. Methods Mol. Biol., 2011, vol. 731, pp. 105-114. doi: 10.1007/978-1-61779-080-5_9.
8. Bébéar C.M., Pereyre S., Peuchant O. Mycoplasma pneumoniae: Susceptibility and resistance to antibiotics. Future Microbiol., 2011, vol. 6, no. 4. - P. 423-431. doi: 10.2217/fmb.11.18.
9. Uphoff C.C., Drexler H.G. Detection of mycoplasma contaminations. Methods Mol. Biol., 2013, vol. 946, pp. 1-13. doi: 10.1007/978-1-62703-128-8_1.
10. Chernov V.M., Chernova O.A., Gorshkov O.V., Baranova N.B., Mouzykantov A.A., Nesterova T.N., Ponomareva A.A. Interaction between mycoplasmas and plants: Extracellular membrane vesicles and phytopathogenicity of Acholeplasma laidlawii PG8. Dokl. Biochem. Biophys., 2013, vol. 450, no. 1, pp. 155-159. doi: 10.1134/S1607672913030083.
11. Windsor H.M., Windsor G.D., Noordergraaf J.H. The growth and long term survival of Acholeplasma laidlawii in media products used in biopharmaceutical manufacturing. Biologicals, 2010, vol. 38, no. 2, pp. 204-210. doi: 10.1016/j.biologicals.2009.11.009.
12. Kulp A., Kuehn M.J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Rev. Microbiol., 2010, vol. 64, pp. 163-184. doi: 10.1146/annurev.micro.091208.073413.
13. Manning A.J., Kuehn M.J. Contribution of bacterial outer membrane vesicles to innate bacterial defense. BMC Microbiol., 2011, vol. 11, art. 258, pp. 1-14. doi: 10.1186/1471-2180-11-258.
14. Medvedeva E.S., Baranova N.B., Mouzykantov A.A., Grigorieva (Malygina) T.Y., Davydova M.N., Trushin M.V., Chernova O.A., Chernov V.M. Adaptation of mycoplasmas to antimicrobial agents: Acholeplasma laidlawii extracellular vesicles mediate the export of ciprofloxacin and a mutant gene related to the antibiotic target. Sci. World J., 2014, vol. 2014, art. 150615, pp. 1-7. doi: 10.1155/2014/150615.
15. Chernov V.M., Chernova O.A., Medvedeva E.S., Sorvina A.I., Davydova M.N., Rogova M.A., Serebryakova M.V. Responses of Acholeplasma laidlawii PG8 cells to cold shock and oxidative stress: Proteomic analysis and stress-reactive mycoplasma proteins. Dokl. Biochem. Biophys., 2010, vol. 432, pp. 126-130. doi: 10.1134/S1607672910030099.
16. Chernov V.M., Chernova O.A., Medvedeva E.S., Davydova M.N. Adaptation of mycoplasmas to environmental conditions: Features of the proteome shift in Acholeplasma laidlawii PG8 at persistent exposure to stressors. Dokl. Biochem. Biophys., 2011, vol. 438, no. 1, pp. 134-137. doi: 10.1134/S1607672911030057.
17. Medvedeva E.S., Baranova N.B., Mouzykantov A.A., Grigoreva T.Y., Davydova M.N., Chernova O.A., Chernov V.M. Extracellular vesicles of mycoplasmas and development of resistance to quinolones in bacteria. Dokl. Biochem. Biophys., 2014, vol. 454, no. 1, pp. 34-37. doi: 10.1134/S1607672914010104.
18. Chernov V.M., Chernova O.A., Mouzykantov A.A., Efimova I.R., Shaymardanova G.F., Medvedeva E.S., Trushin M.V. Extracellular vesicles derived from Acholeplasma laidlawii PG8. Sci. World J., 2011, vol. 11, pp. 1120-1130. doi: 10.1100/tsw.2011.109.
19. Chernov V.M., Chernova O.A., Medvedeva E.S., Mouzykantov A.A., Ponomareva A.A., Shay-mardanova G.F., Gorshkov O.V., Trushin M.V. Unadapted and adapted to starvation Acholeplasma laidlawii cells induce different responses of Oryza sativa, as determined by proteome analysis. J. Proteomics, 2011, vol. 74, no. 12, pp. 2920-2936. doi: 10.1016/j.jprot.2011.07.016.
20. Mouzykantov A.A., Baranova N.B., Medvedeva E.S., Grigor'eva T.Y., Chernova O.A., Chernov V.M. Exported mycoplasmal proteins: Proteome of extracellular membrane vesicles ofAcholeplasma laidlawii PG8. Dokl. Biochem. Biophys., 2014, vol. 455, no. 1, pp. 43-48. doi: 10.1134/S160767291402001X.
21. Medvedeva E.S., Davydova M.N., Mouzykantov A.A., Baranova N.B., Grigoreva T.Y., Siniagina M.N., Boulygina E.A., Chernova O.A., Chernov V.M. Genomic and proteomic profiles of Acholeplasma laidlawii strains differing in sensitivity to ciprofloxacin. Dokl. Biochem. Biophys., 2016, vol. 466, no. 1, pp. 23-27. doi: 10.1134/S1607672916010075.
22. Chernov V.M., Mouzykantov A.A,, Baranova N.B., Medvedeva E.S., Grygorieva T.Y., Trushin M.V., Vishnyakov I.E., Sabantsev A.V., Borchsenius S.N., Chernova O.A. Extracellular membrane vesicles secreted by mycoplasma Acholeplasma laidlawii PG8 are enriched in virulence proteins. J. Proteomics, 2014, vol. 110, pp. 117-128. doi: 10.1016/j.jprot.2014.07.020.
23. Lee E.Y., Choi D.Y., Kim D.K. Gram-positive bacteria produce membrane vesicles: Proteomics-based characterization of Staphylococcus aureus-derived membrane vesicles. Proteomics, 2009, vol. 9, no. 24, pp. 5425-5436. doi: 10.1002/pmic.200900338.
24. Prokhorova I.M., Fomicheva P.N., Kovaleva M.I. Estimation of Mitotoxic and Mutagenic Effects of Environmental Factors. Yaroslavl, Yarosl. Gos. Univ., 2003. 32 p. (In Russian)
25. Lazarev V.N., Levitskii S.A., Basovskii Y.I., Chukin M.M., Akopian T.A., Vereshchagin V.V., Kostrjukova E.S., Kovaleva G.Y., Kazanov M.D., Malko D.B., Vitreschak A.G., Sernova N.V., Gelfand M.S., Demina I.A., Serebryakova M.V., Galyamina M.A., Vtyurin N.N., Rogov S.I., Alexeev D.G., Ladygina V.G., Govorun V.M. Complete genome and proteome of Acholeplasma laidlawii. J. Bacteriol., 2011, vol. 193, no. 18, pp. 4943-4953. doi: 10.1128/JB.05059-11.
26. Clements M.O., Eriksson S., Thompson A., Lucchini S., Hinton J.C., Normark S., Rhen M. Poly-nucleotide phosphorylase is a global regulator of virulence and persistency in Salmonella enterica. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2002, vol. 99, no. 13, pp. 8784-8789.
27. Henderson B., Martin A. Bacterial moonlighting proteins and bacterial virulence. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2013, vol. 358, pp. 155-213. doi: 10.1007/82_2011_188.
28. Thomas C.M., Jacobs E., Dumke R. Characterization of pyruvate dehydrogenase subunit B and eno-lase as plasminogen-binding proteins in Mycoplasma pneumoniae. Microbiology, 2013, vol. 159, pt. 2, pp. 352-365. doi: 10.1099/mic.0.061184-0.
29. Goulhen F., Hafezi A., Uitto V.J., Hinode D., Nakamura R., Grenier D., Mayrand D. Subcellular localization and cytotoxic activity of the GroEL-like protein isolated from Actinobacillus actino-mycetemcomitans. Infect. Immun., 1998, vol. 66, no. 11, pp. 5307-5313.
30. De Rycke J., Ducommun B. Bacterial cyclostatin, or how do bacteria manipulate the eukaryotic cell cycle. Med. Sci. (Paris), 2003, vol. 19, no. 11, pp. 1128-1136. (in French)
31. Smitherman L.S., Minnick M.F. Bartonella bacilliformis GroEL: Effect on growth of human vascular endothelial cells in infected cocultures. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2005, vol. 1063, pp. 286-298.
32. Li Z.T., Zhang R.L., Bi X.G., Xu L., Fan M., Xie D., Xian Y., Wang Y., Li X.J., Wu Z.D., Zhang K.X. Outer membrane vesicles isolated from two clinical Acinetobacter baumannii strains exhibit different toxicity and proteome characteristics. Microb. Pathog., 2015, vol. 81, pp. 46-52. doi: 10.1016/j.micpath.2015.03.009.
33. Jeon H., Oh M.H., Jun S.H., Kim S.I., Choi C.W., Kwon H.I., Na S.H., Kim Y.J., Nicholas A., Selasi G.N., Lee J.C. Variation among Staphylococcus aureus membrane vesicle proteomes affects cytotoxicity of host cells. Microb. Pathog., 2016, vol. 93, pp. 185-193. doi: 10.1016/j.micpath.2016.02.014.
Для цитирования: Медведева Е.С., Малыгина Т.Ю., Баранова Н.Б., Музыкантов А.А., Давыдова М.Н., Чернова О.А., Чернов В.М. Адаптация микоплазм к фторхинолонам: модуляция протеома и генотоксичность внеклеточных везикул Acholeplasma laidlawii // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2017. - Т. 159, кн. 2. - С. 248-261.
For citation: Medvedeva E.S., Malygina T.Y., Baranova N.B., Mouzykantov А.А., Davy-dova M.N., Chernova O.A., Chernov V.M. Adaptation of mycoplasmas to fluoroquinolones: Modulation of proteome and genotoxicity of extracellular vesicles of Acholeplasma laidlawii. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2017, vol. 159, no. 2, pp. 248-261. (In Russian)
