CC BY
126
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 663.131
Е.М. Панчишина, Н.Л. Корниенко, Е.В. Шадрина
Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет,
690087, г. Владивосток, ул. Луговая, 52б
ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ДРОЖЖЕЙ RHODOTORULA BENTHICA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ
КОРМОВОЙ ДОБАВКИ
Дрожжи способны синтезировать широкий спектр каротиноидов, а также обладают способностью в процессе ферментации накапливать достаточное количество биомассы и расти на относительно дешевых средах, эта группа эукариотных микроорганизмов занимает прочные позиции в современной биотехнологии, в том числе и в области микробиологического синтеза каротиноидов. Отсутствие сведений по вопросу каротиногенеза относительно дрожжей R. benthica предопределило целесообразность создания коллекции штаммов и дальнейшего поиска условий культивирования с целью последующего использования в качестве высокоэффективного биотехнологического агента. Целью настоящей работы стало выделение чистой культуры Rhodotorula benthica и изучение культуральных особенностей роста на плотных питательных средах. Из пробиотической кормовой добавки выделен штамм дрожжей Rhodotorula benthica и охарактеризованы культуральные особенности роста. Установлено, что изучаемый штамм на средах Сабуро и СММ (среда морских микроорганизмов) образует типичные для дрожжей рода Rhodotorula колонии от 1 до 3 мм в диаметре, с выпуклым профилем, округлые, пигментированные светло-розовые, характерные для S-типа. На среде для роста дрожжей (YEPD) колонии R-типа с ярким коралловым пигментом, конусовидной формы с матовой поверхностью. Для получения накопительной культуры оптимальной по составу является среда Лундина. Все исследуемые среды позволили выделить чистую культуру, но среда для роста дрожжей (YEPD) способствовала наилучшему росту выделяемого штамма R. benthica.
Ключевые слова: пробиотик, дрожжи, Rhodotorula benthica, питательные среды, культуральные свойства, культивирование.
E.M. Panchishina, N.L. Kornienko, E.V. Shadrina
STUDY OF THE CULTURE FEATURES OF RHODOTORULA BENTHICA YEAST, OUFLOW FROM PROBIOTIC FEED ADDITIVES
Yeast can synthesize a wide range of carotenoids, they also have the ability to accumulate a sufficient amount of biomass and grow on relatively cheap media during the fermentation process. This eukaryotic microorganisms group occupies a strong position in modern biotechnology as well as in the field of carotenoids microbiological synthesis. Due to lack of information about karatino-genesis regarding R. benthica yeast predetermined the feasibility of creating a collection of strains and further searching for culturing conditions, with a view to their subsequent use as a highly effective biotechnological agent. The purpose of this work is the isolation of a pure culture of R. benthi-
ca and the study of the cultural characteristics of growth in solid nutrient media. A strain of R. ben-thica yeast was isolated from a probiotic feed supplement and cultural characteristics of growth were characterized. It was established that the studied strain on Saburo and SMM media (marine microorganism medium) forms colonies typical for yeast of the genus Rhodotorula from 1 to 3 mm in diameter, with a convex profile, rounded, pigmented, light pink, characteristic for the S type. On yeast growth medium (YEPD), R-type colonies with bright coral pigment, cone-shaped with a matte surface were isolated. To obtain a funded culture, Lundin's medium is optimal in composition. All the studied media allowed us to isolate a pure culture, but the yeast growth medium (YEPD) contributed to the best growth of the isolated strain of R benthica.
Key words: probiotic, yeast, Rhodotorula benthica, media, culture features, cultivation.
Среди дрожжей имеются окрашенные в желтый, розовый, красный цвета, что обусловлено наличием в клетках пигментов - каротиноидов. В настоящее время некоторые из этих дрожжей (виды рода родоторула - Rhodotorula) используют для получения кормовых белко-во-каротиноидных препаратов, которые являются источником витамина А для животных [1].
В условиях недостатка традиционного кормового ресурса на основе микроводорослей представляется целесообразным и востребованным предприятиями аквакультуры использовать препараты на основе пробиотиков, которые представляют собой живые организмы и (или) вещества микробного происхождения, повышающие активность иммунной системы, принимающие активное участие в процессах пищеварения, способствующие восстановлению естественной микрофлоры [2].
В отличие от традиционных хлебопекарных и пивных, красные дрожжи Rhodotorula в своем составе имеют высокую концентрацию астаксантина и каротина, которые повышают иммунитет и выживаемость трепанга как на личиночных стадиях, так и после оседания [3].
В связи с тем, что дрожжи способны синтезировать широкий спектр каротиноидов, а также обладают способностью в процессе ферментации накапливать достаточное количество биомассы и расти на относительно дешевых средах, эта группа эукариотных микроорганизмов занимает прочные позиции в современной биотехнологии, в том числе и в области микробиологического синтеза каротиноидов [4]. В литературе описаны результаты научных исследований по изучению направленного синтеза каротиноидных пигментов красными дрожжами Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula acheniorum и Rhodotorula graminis. Эти дрожжи, широко распространенные в природе, могут биосинтезировать определенные каротиноиды, такие как Р-каротин, торулен и торулародин, в разных пропорциях [5].
Японскими учеными проводились исследования по распределению дрожжей в глубоководной среде в северо-западной части Тихого океана, в ходе которых обнаружены новые штаммы Rhodotorula benthica («ben'thi.ca» из бентоса, флоры и фауны глубокого моря), выделенные из донных организмов. На агаре Сабуро при 25 °C культура имеет светло-розовый цвет, блестящая, мягкая со слизистой поверхностью и имеет ровный край [6].
Как показывает практика, в Китае уже давно успешно применяют морские дрожжи родов Rhodotorula benthica в качестве кормовой пробиотической добавки для культивируемых гид-робионтов [3].
Однако отсутствие сведений по вопросу каротиногенеза относительно дрожжей R. benthica предопределяет целесообразность создания коллекции штаммов и дальнейшего поиска условий культивирования с целью последующего использования в качестве высокоэффективного биотехнологического агента.
Целью настоящей работы являлось выделение чистой культуры Rhodotorula benthica и изучение культуральных особенностей роста на плотных питательных средах.
Для реализации цели поставлены следующие задачи:
- провести анализ научной литературы в области культивирования дрожжей Rhodotorula $рр., выбор на его основе питательных сред;
- выделить чистую культуру Rhodotorula ЪвпШеа;
- дать сравнительную оценку питательных сред по ростовым качествам. Источником выделения культуры дрожжей Rhodotorula ЪвпШеа стала кормовая добавка
(Китай).
Культуральные свойства микроорганизмов исследуют, как правило, при работе с чистой культурой. Выделение чистой культуры состоит из нескольких этапов: получение накопительной культуры, выделение чистой культуры и определение чистоты выделенной культуры.
В лабораторных условиях проделано два экспериментальных опыта, общие схемы которых приведены на рис. 1, 2.
Рис. 1. Схема экспериментальных исследований по реактивации и выделению культуры дрожжей Rhodotorula benthica Fig. 1. Scheme of experimental studies of the yeast culture Rhodotorula benthica
reactivation and isolation
И
1 этап -
ткоучеяве нокопгтегыюй лптллры
2 тгап -
s adeiefi j чистой jn:тьтры методом истощающего Лосева
Зтгап -учет результатов
Рис. 2. Схема выделения чистой культуры Rhodotorula benthica на плотные среды Fig. 2. Scheme of isolation of pure yeast culture Rhodotorula benthica on solid media
Согласно схеме (рис. 1) опыт определен как реактивация, поскольку исходный материал -пробиотик, предполагающий наличие живых клеток продуцента.
В ходе эксперимента применяли стандартные методы, получившие наибольшее распространение в микробиологической практике - метод Дригальского, метод истощающего посева. Определение чистоты выделенной культуры осуществляли визуально, при этом отмечались культуральные особенности роста на плотных питательных средах [7].
В табл. 1 приведен рецептурный состав стандартных и экспериментальных питательных сред, растворов, выбранных путем анализа научной литературы.
Таблица 1
Рецептуры питательных сред и растворов
Table 1
Recipes of media and solutions
Компоненты, г/л Физ. раствор [8] Среда Лундина [8] Глюкозо-аммонийная среда [10] Сабуро [8] Среда морских микроорганизмов (СММ) [11] Среда для роста дрожжей (YEPD) [12]
1 2 3 4 5 6 7
NaCI 8,5 0,5 0,1 - - -
(NH4)2SO4 - 1,0 5,0 - - -
Окончание табл. 1
1 2 3 4 5 6 7
KH2PO4 - 1,0 1,0 - - -
MgSO4-7H2O - 1,0 0,5 - 1,0 -
FeCI3 7H2O -1% р-р - 1 см3 - - - 1 см3
CaCO3 - - - - 1,0 -
CaCI2 - - 0,1 - - -
K2HPO4 - - 0,15 - 0,2 -
Сахароза - 40,0 - - - -
Глюкоза - - 40 40,0 1,0 20,0
Дрожжевой экстракт - - 0,5 - 5,0 10,0
Пептон - - - 10,0 5,0 20,0
Агар - - - 20,0 15,0 15,0
На рис. 3 приведены результаты рассева шпателем Дригальского на плотную среду Са-буро, произведенные согласно схеме (см. рис. 1).
Рис. 3. Результаты выделения культуры дрожжей Rhodotorula benthica методом Дригальского (на фото демонстрация 3-й чашки): I - физ. раствор; II - среда Лундина; III - глюкозоаммонийная среда Fig. 3. The results of the isolation of Rhodotorula benthica yeast culture by the Drigalski method (photo shows a 3rd cup): I - physical solution; II - Lundin's medium; III - glucoseammonium medium
После реактивации и выделения культуры дрожжей при визуальном контроле на среде Сабуро через 72 ч культивирования просматривался рост микроорганизмов с типичными для Rhodotorula benthica колониями: пигментация светло-розовая, форма колоний округлая, поверхность гладкая, выпуклая, блестящая, края ровные, структура однородная, консистенция слизистая, размер 1-3 мм в диаметре. Отмечено также присутствие посторонней споровой микрофлоры в виде белых, точечных колоний с шероховатой поверхностью, что свидетельствует о зараженности исходного материала. Преобладание роста посторонних микроорганизмов наблюдалось при использовании для реактивации физиологического раствора и глю-козоаммонийной среды. Состав среды Лундина оказался наиболее элективным, обеспечивающим преимущественное развитие выделяемых микроорганизмов.
Поэтому второй этап экспериментальной работы по выделению чистой культуры продолжен с выросшими изолированными колониями образца II.
На рис. 4 представлены результаты посевов штрихами, произведенных согласно схеме (см. рис. 2).
Рис. 4. Результаты выделения чистой культуры дрожжей Rhodotorula benthica на плотные среды: а - Сабуро; б - СММ; в - YEPD Fig. 4. Results of isolation of pure yeast culture Rhodotorula benthica on solid media:
a - Saburo; б - CMM; в - YEPD
К культуральным свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных или жидких питательных средах. По результатам исследования составлена карта (табл. 2) выявленных признаков выделенных штаммов культуры дрожжей Rhodotorula benthica на плотных стандартных и экспериментальных средах.
Таблица 2
Культуральные свойства выделенной чистой культуры дрожжей Rhodotorula benthica
Table 2
Cultural properties of the selected pure culture of Rhodotorula benthica yeast
Наименование питательной среды Характеристика колоний
Размер Форма, профиль Поверхность Цвет Край Консистенция
Сабуро Мелкие 1-2 мм Округлая, выпуклая Блестящая Светло-розовый Ровный Однородная
СММ Средние 3-4 мм Округлая, выпуклая Блестящая Светло-розовый Ровный Однородная
YEPD Крупные 5-6 мм Округлая, конусовидная Матовая Коралловый Ровный Однородная
Из данных рис. 4 и табл. 2 следует, что выделенная культура дает обильный рост на экспериментальной питательной среде YEPD и обеспечивает наилучшие условия для биосинтеза каратиноидов, о чем свидетельствует выраженная пигментация. При этом стоит отметить, что при культивировании на плотных средах Сабуро и СММ образуются колонии S-типа, тогда как изменение поверхности, профиля и размера колоний на среде YEPD свидетельствует о явлении диссоциации.
Ионы и соли металлов (Ва, Fe, Mg, Са, Zn и Со) являются стимуляторами каротиногенеза дрожжами Якойо^гыШ £рр. [13]. Данным фактом можно объяснить наилучшие результаты при реактивации и выделении чистой культуры Яко($оЮгы1а ЬвпШеа на средах Лундина и YEPD, поскольку в их состав входит 1% р-р FeCIз•7H2O.
Таким образом, в ходе проделанной экспериментальной работы выделена чистая культура Rhodotorula benthica и изучены ее культуральные особенности на плотных стандартных и экспериментальных средах. На основе полученных результатов предполагается ведение дальнейших разработок по регулированию биотехнологических параметров штамма дрожжей Rhodotorula benthica.
Список литературы
1. Мудрецова-Висс К.А., Дедюхина В.П. Микробиология, санитария и гигиена. 4-е изд., испр. и доп. М.: Форум: ИНФРА-М, 2009. 399 с.
2. Перспективные пробиотики для осетровых рыб / И.В. Бурлаченко, Н.В. Судакова, Е.И. Балакирев, Д.А. Мордовцев, Е.В. Малик // Рыб. хоз-во. 2006. № 3. С. 12-16.
3. Effect of potential probiotic Rhodotorula benthica D30 on the growth performance, digestive enzyme activity and immunity in juvenile sea cucumber Apostichopus japonicas / Ji-hui Wang, Liu-qun Zhao, Jin-feng Liu, Han Wang, Shan Xiao // Fish & Shellfish Immunology. 2015. Vol. 43, Issue 2. P. 330-336. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2014.12.028.
4. Sandman G. Carotenoid biosynthesis and biotechnological application // Arch.Biochem. and Biophys. 2001. Vol. 385. P. 4-12.
5. Mata-Gómez, L.C, Montañez, J.C, Méndez-Zavala, A.et al. Биотехнологическое производство каротиноидов дрожжами: обзор. Microb Cell Fact 13, 12. 2014. https://doi.org/10.1186/ 1475-2859-13-12.
6. Distribution and identification of red yeasts in deep-sea environments around the northwest Pacific Ocean / T.Nagahama, M. Hamamoto, T.Nakase, H.Takami, K. Horikoshi // Antonie van Leeuwenhoek. 2001а. 80. P. 101-110.
7. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: практ. пособие / под ред. Н.С. Егорова. 2-е изд. М.: Изд-во Моск. гос. ун-та, 1983. 215 с.
8. ГОСТ 10444.1-84. Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе. М.: Стандартинформ, 2010. 17 с.
9. Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования: дис. ... доктора биол. наук по спец. 03.00.23-биотехнология. Кишинев, 2005. 128 с.
10. Фараджева Е.Д., Болотов Н.А. Производство хлебопекарных дрожжей: практ. руководство. СПб.: Изд-во «Профессия», 2002. 167 с.
11. Youchimizu M., Kimura T. Stady of intestinal microflora of Salmonids // Fish Pathol. 1976. Vol. 10, № 2. Р. 243-259.
12. Formation of self-organized periodic patterns around yeasts secreting a precursor of a red pigment / Vytautas Melvydas, Ramune Staneviciene, Algima Balynaite, Jurate Vaiciuniene, Rasa Garjonyte // Microbiological Research. 2016. Vol. 193. P. 87-93. https://doi.org/10.1016/j.micres. 2016.09.007.
13. Effect of barium and other metals on the growth of a D-lactic acid assimilating yeast Rhodotorula glutinis N 21 / Komemushi S, Sakaki H, Yokoyama H, Fujita T // J Antibact Antifung Agt. 1994. P. 583-587.
Сведения об авторах: Панчишина Екатерина Мироновна, кандидат технических наук, доцент, e-mail: [email protected];
Корниенко Надежда Леонидовна, младший научный сотрудник, e-mail: KornienkoNL@ mail.ru;
Шадрина Екатерина Васильевна, кандидат технических наук, e-mail: [email protected].
