CC BY
9УДК 619:616.98:578.828.11(470.6)
Абакин С. С., Красовская Т. Л., Суржикова Е. С., Оробец В. А., Чалченко А. Б.
Abakin S. S., Krasovskaya T. L., Surzhikova E. S., Orobets V. A., Chalchenko A. B.
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОТИПИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ЦИРКУЛИРУЮЩЕГО В ПОПУЛЯЦИИ ЖИВОТНЫХ В РЕГИОНЕ СЕВЕРНОГО КАВКАЗА (СТАВРОПОЛЬСКИЙ КРАЙ)
THE STUDY OF GENOTYPIC DIVERSITY OF LEUKEMIA VIRUS IN CATTLE CIRCULATING IN ANIMAL POPULATION IN THE REGION OF THE NORTH CAUCASUS (STAVROPOL TERRITORY)
В представленной статье изложен материал по изучению генотипического разнообразия, определению нуклео-тидных последовательностей ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, апробирована методика типирования про-вируса лейкоза КРС по структуре ДНК-локуса env методом ПЦР и секвенирования.
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, вирус лейкоза, ген env, РИД, ИФА, ПЦР, генотипирование, сек-венирование, мутации.
Summary: In presented article the material on studying of the genotyping diversity, to definition of DNA nucleotide sequences of bovine leukemia is stated, the typing method of leukemia provirus in cattle on the structure of the DNA- env locus by PCR method and sequencing is approved.
Key words: bovine leukemia, leukemia virus, env gene, RIA, ELISA, PCR, genotyping, sequencing, mutations.
Абакин Сергей Стефанович -
кандидат ветеринарных наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционных, незаразных и паразитарных болезней ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства г. Ставрополь Тел.: 89624484335 E-mail: abakins@yandex.ru
Красовская Татьяна Леонидовна -
кандидат биологических наук, научный сотрудник
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский
института овцеводства и козоводства
г. Ставрополь
Тел.: 8-988-708-53-57
E-mail: t.krasovskaya@rambler.ru
Суржикова Евгения Семеновна -
кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский
института овцеводства и козоводства
г. Ставрополь
Тел.: 89054137435
E-mail: ev.surzhikowa 2014@yandex.ru
Оробец Владимир Александрович -
доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой кафедрой терапии и фармакологии Ставропольский государственный аграрный университет Тел.: 89283276016 E-mail: orobets@yandex.ru
Чалченко Андрей Борисович -
главный ветеринарный врач колхоза «им. Ворошилова»,
Труновского района, Ставропольского края
Тел.: 89620073299
E-mail: a.chalchenko@mail.ru
Abakin Sergey Stefanovich -
chief research worker at the laboratory
of infectious, noninfectious and parasitic diseases,
All-Russian Research Institute
of Sheep and Goat Breeding,
Candidate of Veterinary Sciences,
Associate Professor
Тel.: 89624484335
E-mail: abakins@yandex.ru
Krasovskaya Tatiana Leonidovna -
research worker
of All-Russian Research Institute of
Sheep and Goat Breeding,
Stavropol, Candidate of Biological Sciences
Тel.: 8-988-708-53-57
E-mail: t.krasovskaya@rambler.ru
Surgikova Evgenia Semenovna -
research worker
of All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding, Stavropol, Candidate of Agricultural Sciences Тel.: 89054137435
E-mail: ev.surzhikowa 2014@yandex.ru
Orobets Vladimir Alexandrovich -
Head of the Department for Therapy and Fharmacology, Stavropol State Agrarian University, Doctor of Veterinary Sciences, Professor Тel.: 89283276016 E-mail: orobets@yandex.ru
Chalchenko Andrei Borisovich -
Chef animal doctor of the collective farm «Named Voroshilov», Trunovsky district, Stavropol Territory Тel.: 89620073299 E-mail: a.chalchenko@mail.ru
в
:№ 3(19), 2015
Ветеринария
61
Проблема распространения вируса лейкоза крупного рогатого скота в Ставропольском крае, и Российской Федерации в целом, по-прежнему стоит очень остро. По данным мониторинга за 2014 год уровень инфицированности поголовья в животноводческих хозяйствах края в среднем составляет 15%, а в отдельных хозяйствах 30 процентов и выше.
Этиологическим агентом данного заболевания является ретровирус, относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae. На начальном этапе инфицирования ВЛКРС внедряется в хромосомную ДНК лимфоцитов в форме провируса в количестве 1-3 копий на диплоидный геном, и животное становится вирусоноси-телем на всю жизнь [1, 6, 9, 12].
В структуре вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС, BLV) обнаружены 6 основных белков, 4 из них - негликолизированные, составляют сердцевину вириона (белок р24 присутствует в наибольшем количестве). Из двух гликопротеидных белков важное значение имеет gp51, расположенный на поверхности ви-риона и ответственный за инфекционность и активность гемагглютининов. Обнаружение специфических противовирусных антител легло в основу серологических методов диагностики лейкоза [2, 17, 18].
Генетическая структура BLV представлена тремя основными генами, которые кодируют вирусные протеины и расположены в следующем порядке: 5'-gag-pol-env-3'. Ген env кодирует 515 аминокислот, составляющих поверхностный гликопротеид gp51 и трансмембранный белок gp30, которые непосредственно участвуют в инфицировании клетки и вызывают сильный иммунный ответ у инфицированных животных [3, 11, 12].
В последние годы изучение генетического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) вызывает значительный научный интерес. Имеются сообщения о возможной роли различных вариантов ВЛКРС в развитии инфекционного процесса. По данным Я.в. Ре!тег (2005), за атипичные формы инфекции ответственны особые варианты ВЛКРС по гену ето др51, которые приобрели способность ограничивать экспрессию собственных белков до крайне низкого уровня в течение длительного периода [4, 12, 13, 14, 16]. Животные, инфицированные такими вариантами вируса, остаются серонегативными на протяжении длительного времени и таким образом являются источником распространения инфекции. Однако, ввиду ограниченного количества публикаций по данной проблеме, многие вопросы остаются не до конца изученными и требуют дальнейших исследований.
Целью нашей исследовательской работы являлось определение генотипической вариабельности ВЛКРС, циркулирующего в популяции животных на территории Ставропольского края. До этого подобные исследования у нас в крае не проводились.
Материалы и методика исследований. Мониторинг эпизоотической обстановки по лейкозу крупного рогатого скота проводился в 15 хозяйствах 4 природно-климатических зон края.
Серологическая диагностика проводилась методами РИД и ИФА с использованием коммерческих диагностических наборов производства ФГУП «Курская биофабрика фирма «Биок» согласно инструкции производителя.
Для изучения мутационной изменчивости ВЛКРС по гену ето были отобраны пробы цельной крови в количестве 29 образцов из числа РИД-положительных животных, принадлежащих 4 животноводческим хозяйствам Ставропольского края.
Таблица 1 - Уровень инфицированности в хозяйствах различных природно-климатических зон
Ставропольского края
Местоположение хозяйства Уровень инфицированности, %
РИД ИФА
КРАЙНЕ ЗАСУШЛИВАЯ ЗОНА (48,2 %)
Левокумский район (3 хоз.) 48,2 49,1
ЗАСУШЛИВАЯ ЗОНА (38,2 %)
Благодарненский район (2 хоз.) 21,5 22,2
Новоселицкий район (1 хоз.) 55,0 55,0
ЗОНА НЕДОСТАТОЧНОГО УВЛАЖНЕНИЯ (68,8 %)
Кочубеевский район (4 хоз.) 70,2 72,3
Новоалександровский район (1 хоз.) 85,0 85,9
Труновский район (2 хоз.) 61,5 61,5
Шпаковский район (1 хоз.) 59,0 60,5
ЗОНА ДОСТАТОЧНОГО УВЛАЖНЕНИЯ (48 %)
Георгиевкий район (1 хоз.) 48,0 49,0
Экстракцию ДНК проводили с использованием коммерческих наборов реагентов «ДНК-сорб-В» (осаждение НК на сорбенте) (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.
При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV применялась модификация «nested» ПЦР с использованием набора внешних (env5032 + env5608) и внутренних (env5099 + env5521) праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию локуса env-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. [15].
В дальнейшем проводилось секвениро-вание полученных ампликонов по Сэнгеру. Анализ нуклеотидных последовательностей осуществлялся с использованием генетического анализатора ABI 3500 Genetic Analyzer. В качестве референса из базы данных Genbank был взят наиболее близкий в генетическом отношении изолят HQ902258.1 из Беларуси (степень сходства 99 %).
Результаты исследований. Согласно полученным данным серологических исследований (РИД и ИФА) эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в обследуемых животноводческих хозяйствах общественного сектора Ставропольского края достаточно сложная, уровень инфицированности поголовья в среднем по хозяйствам составляет 15 %, а по районам - 56,1% (табл. 1).
При сравнении данных серологических и молекулярно-генетических исследований выявлено, что в 80 % случаев результаты РИД, ИФА и ПЦР совпадают, в 2,5 % случаев удалось дополнительно выявить вирусоносителей из числа РИД-отрицательных животных, в 17,5% случаев серопозитивные коровы реагируют отрицательно в ПЦР. Полученные данные согласовываются с результатами ряда других ученых [5, 8, 12]. Такой факт может быть связан с тем, что животные либо находятся в стойкой алимфатической стадии, либо в начальной стадии персистирующего лимфоцитоза, чем и обусловлено низкое содер-
жание провирусной ДНК в их крови. Хронически персистирующий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности и преодоление более эффективных защитных механизмов хозяина.
Полученные данные послужили основанием для изучения генетической вариабельности ВЛКРС, и в частности мутационной изменчивости генотипов вируса лейкоза, обнаруженных на территории Ставропольского края.
При секвенировании участка гена ето прови-руса ВЛКРС установлено наличие 31 точковой мутации, из них 11 значимых: 2 транверсии и 9 транзиций (табл. 2).
При сравнении нуклеотидных последовательностей изолятов из Ставропольского края и референсных выявлены наиболее частые замены следующих видов: транзиции в позиции 61 с заменой в^А и в позиции 401 с заменой О^Т, не приводящие к изменению аминокислотной последовательности (65,5 % случаев), а также замены А^в и Т^О. Кроме того, установлены трансверсии в позиции 167 в нуклеотидных последовательностях изолятов Кочубеевского района вида О^в с аминокислотной заменой лейцина на валин. В 6,90% изолятов (Трунов-ский район) - трансверсия А^О, которая привела к замене лизина на глутамин.
Следует отметить, что в нуклеотидных последовательностях данного гена всех изолятов Ставропольского края в позиции 104 произошла мутация А^в, что привело к аминокислотной замене аспарагина на аспарагиновую кислоту (N^0).
Таким образом, высокая мутационная изменчивость изолятов провируса ВЛКРС, циркулирующих на территории Ставропольского края, приводит к необходимости продолжения исследований, выяснения возможного влияния частных мутаций на вирулентные свойства вируса, восприимчивость животных к определенному генотипу вируса лейкоза и формирование устойчивости к данному заболеванию.
Таблица 2 - Характеристика олигонуклеотидных полиморфизмов, установленных
в локусе гена env провируса ВЛКРС
№ п/п Позиция Вид мутации Частота встречаемости, % Амино-кислотная замена Тип мутации на уровне ДНК Тип мутации на уровне белка
1 30 G^ A 6,90 R^K транзиция миссенс-мутация
2 84 A^G 6,90 H^R транзиция миссенс-мутация
3 104 A^G 100,00 N^D транзиция миссенс-мутация
4 143 A^G 6,90 N^D транзиция миссенс-мутация
5 153 T^C 10,34 I^T транзиция миссенс-мутация
6 167 C^G 6,90 L^V трансверсия миссенс-мутация
7 170 A^C 6,90 K^Q трансверсия миссенс-мутация
8 171 A^G 27,59 K^R транзиция миссенс-мутация
9 278 A^G 3,45 Q^R транзиция миссенс-мутация
10 338 G^A 3,45 A^T транзиция миссенс-мутация
11 342 G ^A 3,45 R^Q транзиция миссенс-мутация
в
:№ 3(19), 2015
Ветеринария
63
Результаты исследований по изучению генетической вариабельности провируса лейкоза КРС по структуре ДНК-локуса env позволят систематизировать выделенные изоляты в соответствии с существующим таксономическим положением (классификация, пред-
ложенная М. Ро1а^ив2С2ак, 2013), что может стать эффективным инструментом для решения задач молекулярной эпизоотологии лейкоза КРС в связи с соответствием этого метода современным критериям генетического типирования.
Литература
1. Абакин С. С., Красовская Т. Л. О защите племенного поголовья крупного рогатого скота от инфекционных болезней в хозяйствах Ставропольского края // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2014. Т. 2. № 7. С. 335340.
2. Абакин С. С., Криворучко С. В. Новые подходы в диагностике и оздоровлении стад от вирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота // Ветеринарная патология. 2013.№ 1. С. 36-39.
3. Батенева Н. В., Смирнов П. Н., Михно-вич И. В. Изучение распространения условных генотипов вируса лейкоза крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. 2012. № 4. С. 69-72.
4. Белов Д. Е., Чижова Л. Н. Влияние лейкоза на молочную продуктивность коров // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2006. Т. 2. № 2-2. С. 152-156.
5. Геногеографические исследования вируса лейкоза крупного рогатого скота / И. В. Виноградова, Е. А. Гладырь, Н. В. Ко-валюк, М. В. Петропавловский, И. М. Донник, Л. К. Эрнст, Н. А. Зиновьева // Достижения науки и техники АПК. 2011. № 10. С. 34-37.
6. Генджиева О. Б., Моисейкина Л. Г Анализ генетических исследований крупного рогатого скота калмыцкой породы // Вестник Калмыцкого университета. 2012. № 1 (13). С. 10-14.
7. Генджиева О. Б. Филогенетическое сравнение вируса лейкоза крупного рогатого скота // Вестник Калмыцкого университета. 2012. № 2 (14). С. 10-16.
8. Генотипирование изолятов ВЛКРС, распространенных на территории республики Калмыкия / М. И. Гулюкин, Н. Г. Козырева, О. Б. Генджиева, Л. А. Иванова // Ветеринария Кубани. 2012. № 4. С.4-7.
9. Генотипическое разнообразие вирусалей-коза крупного рогатого скота разной породной принадлежности / П. Н. Смирнов, Н. В. Грачева, В. А. Белявская, В. А. Ря-бинина // Аграрный вестник Урала. 2009. № 7 (61). С. 89-91.
10. Практическое пособие по мониторингу бруцеллеза, туберкулеза, парату-беркулеза и лейкоза крупного рогатого
References
1. Abakin S.S., Krasovskaya T.L. On the protection of breeding cattle population from infectious diseases in the farms of the Stavropol Territory // Collection of scientific works of All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding. 2014. Vol. 2. № 7. P. 331-336.
2. Abakin S.S., Krivoruchko S.V. Newapproaches to the diagnostics and recovery of herds from bovine leukemia and immunodeficiency // Veterinary Pathology. 2013. № 1. P. 36-39.
3. Bateneva N.V., Smornov P.N., Mihnovich I.V. The study of the spread of bovine leukemia conventional genotypes // Agricultural Biology. 2012. № 4. P. 69-72.
4. Belov D.E., Chizhova L.N. Influence of leukemia on dairy productivity of cows // Collection of scientific works of All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding. 2006. Vol. 2-2. P. 152-156.
5. Donnik I.M., Ernest L.K., Zinovieva N.A. Gene geographic studies of the bovine leukemia virus // Advances in science and technology of APC. 2011. № 10. P. 34-37.
6. Gendzhieva O.B., Moiseykina L.G. Analysis of genetic studies in cattle of Kalmyk breed // Bulletin of the University of Kalmykia. 2012. № 1 (13). P. 10-14.
7. Gendzhieva O.B. Phylogenetic comparison of the bovine leukemia virus // Bulletin of the University of Kalmykia. 2012. № 2 (14). P. 10-16.
8. Genotyping of bovine leukemia isolates distributed on the territory of the Republic of Kalmykia / M.I. Gulyukin, N.G. Kozyreva, O.B. Gendzhieva, L.A. Ivanova // Veterinary of Kuban. 2012. № 4. P. 4-7.
9. Genotypic diversity of leukemia virus in cattle of different breeds / P.N. Smirnov, N.V. Gracheva, V.A. Belyavskaya, V.A. Ryabinina // Agrarian bulletin of the Urals. 2009. № 7 (61). P. 89-91.
10. A practical guide to monitoring of brucellosis, tuberculosis, paratuberculosis and bovine leukemia: organizational and economic, veterinary and sanitary and also zootechnic aspects of prevention and elimination of these infections / M.I. Gulyukin, A.H. Naimanov, M.P. Albertyan, G.A. Simonyan, S.S. Abakin // Methodical recommendations. -RAAS. - Moscow, 2014. - 74 p. (reviewed and approved at the NTS of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation).
11. Problems and prospects of polymerase
скота: организационно-хозяйственные, ветеринарно-санитарные и зоотехнические аспекты профилактики и ликвидации этих инфекций / М. И. Гулюкин, А. Х. Най-манов, М. П. Альбертян, Г А. Симонян, С. С. Абакин [и др.] // Методические рекомендации./-РАСХН. М., 2014. 74 с.
11. Проблемы и перспективы применения по-лимеразной цепной реакции в диагностике лейкоза КРС / Н. Г Козырева, Н. Ф. Ломакина, Л. А. Иванова, М. И. Гулюкин // Ветеринария и кормление. 2009. № 3. С. 8-12.
12. Филогенетический анализ участка гена pol изолятов провируса лейкоза КРС, обнаруженных у животных из различных хозяйств регионов Российской Федерации /
H. Г. Козырева, М. И. Гулюкин, Л. А. Иванова, А. С. Малоголовкин, А. И. Клименко,
B. В. Разумовская // Доклады Российской Академии с.- х. наук. 2011. № 6. С. 48-51.
13. Чижова Л. Н., Белов Д. Е. Использование полимеразной цепной реакции в диагностике лейкоза КРС // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2004. Т. 2. № 2-2.
C. 65-69.
14. Distribution and superinfection of bovine leukemia virus genotypes in Japan / Y. Asfaw, S. Tsuduku, M. Konishi [et al.] // Arch. Virol. 2005. V. 150. P. 493-505.
15. Identification of different BLV provirus isolates byPCR, RFLPA and DNA sequencing /D. Beier, P. Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2001. Vol. 114, № 7-8. P. 252-256.
16. Felmer R. G. Molecular analysis of a 444 bp fragment of the BLV gp51 env gene reveals a high frequency of non-silent point mutations and suggest the presence of two subgroups of BLV in Chile // Vet. Microbiology . 2005. 108. Р. 39-47.
17. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E.T Gonzales, H. Sentsui. // Virus Research. 2002. 86: Р. 101-110.
18. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impaction phylogeny / M. Rola-Luszczak, A. Pluta, M. Olech,
I. Donnik, M. Petropavlovskiy, A. Gerilovych, I. Vinogradova, B. Choudhury, J. Kuzmak // PLoS One. 2013. Vol. 8. № 3. Available at: http://dx.plos.org/10.1371 /journal. pone.0058705.
chain reaction application in the diagnostics of bovine leukemia / N.G. Kozyreva, N.F Lomakina, L.A. Ivanova, M.I. Gulyukin // Veterinary and Feeding. 2009. № 3. P. 8-12.
12. Phylogenetic analysis of the pol gene region of bovine leukemia isolates found in animals from different farms in regions of the Russian Federation / N.G. Kozyreva, M.I. Gulyukin, L.A. Ivanova, A.S. Malogolovkin, A.I. Klimenko, V.V. Razumovskaya // Reports of the RAAS. 2011. № 6. P. 48-51.
13. Chizhova L.N., Belov D.E. Use of polymerase chain reaction in the diagnostics of bovine leukemia // Collection of scientific works of All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding. 2004. Vol. 2. № 2-2. P. 6569.
14. Asfaw Y., Tsuduku S., Konishi M. et al. Distribution and superinfection of bovine leukemia virus genotypes in Japan. // Arch. Virol. - 2005. - V. 150. - P. 493-505.
15. Beier D. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing / D. Beier, P. Blankenstein,
0. Marquardt, J. Kuzmak // Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2001. Vol. 114, № 7-8. P. 252-256.
16. Felmer R.G. Molecular analysis of a 444 bp fragment of the BLV gp51 env gene reveals a high frequency of non-silent point mutations and suggest the presence of two subgroups of BLV in Chile // Vet.Microbiology 108(2005)39-47.
17. Licursi M. 2002. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, Wu D, T. Yokoyama, E.T. Gonzales, H. Sentsui // Virus Research. 86: 101-110.
18. Rola-Luszczak M. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impaction phylogeny / M. Rola-Luszczak, A. Pluta, M. Olech, I. Donnik, M. Petropavlovskiy, A. Gerilovych,
1. Vinogradova, B. Choudhury, J. Kuzmak // PLoS One. - 2013. - Vol. 8. - № 3. Available at: http://dx.plos.org/10.1371/journal. pone.0058705.
