CC BY
6в
УДК 619:616.98:578.828.11
:№ 1(21), 2016
Ветеринария
55
Абакин С. С., Красовская Т. Л., Пономаренко Д. Г., Оробец В. А. Abakin S. S., Krasovskaya T. L., Ponomarenko D. G., Orobets V. A.
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ КЛИНИКО-ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МУТАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ГЕНОТИПЕ BLV
STUDY OF THE PECULIARITIES OF THE CLINICAL-HEMATOLOGICAL MANIFESTATIONS OF BOVINE LEUKEMIA DEPENDING ON MUTATIONAL CHANGES IN THE GENOTYPE BLV
Развитие энзоотического лейкоза КРС сопряжено со злокачественной прогрессирующей пролиферацией клеток крови с нарушением их дифференцировки и созревания. По патогенетическому механизму болезнь сходна с истинными опухолевыми процессами, что и позволяет отнести данную нозологию к группе неопластических заболеваний.
В настоящее время большой интерес вызывает проблема причинно-следственной связи генотипических характеристик возбудителя и особенностей эпизоотологии и морфогенеза болезни. Подобных сведений относительно ВЦУ и энзоотического лейкоза крупного рогато скота в доступной литературе не найдено.
При анализе полученных результатов установлено, что у животных, инфицированных BLV, относящегося к генотипу 4, особо показательные специфические признаки клинико-гематологической конверсии лейкоза КРС (моно-морфность лимфоцитов на фоне лимфоцитарного лейкоцитоза, образование клеток Ридера) выявлены у 5,9-32,3 % больных особей. При этом среди КРС носителей BLV с мутационными изменениями в локусе епу-гена у большего количества животных (38,5-53,8 %) были выявлены явные признаки клинико-гематологической фазы болезни. Обращает на себя внимание то факт, что у 100 % животных группы № 2 наблюдали явление лимфоцитолизиса, что также является характерным признаком болезни, указывая на повреждение цитоскелета, преимущественно клеточной стенки.
Проведенные исследования указывают на то, что BLV-инфекция, вызванная вирусом с измененным генотипом в структуре изучаемого высококонсервативного фрагмента локуса епу-гена, может обусловливать значительный риск ранней манифестации энзоотического лейкоза с высоким процентом (53,8 %) перехода болезни из латентной фазы в гематологическую стадию с более выраженными патологическими изменениями.
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, вирус лейкоза (BLV), ген епу, РИД, ИФА, ПЦР, генотип, эпизоотия, мутации, гематология, клетки крови.
Development of enzootic bovine leukemia is associated with progressive malignant proliferation of blood cells with the violation of their differentiation and maturation. According to the pathogenic mechanism the disease is similar to that of true neoplastic processes that allows us to attribute the given nosology to the group of neoplastic diseases.
Currently, of the great interest is the problem of cause and effect connection of the pathogen genotypic characteristics and features of disease epizootology and morphogenesis. It is not found such information concerning the BLV and enzootic bovine leukemia in the available literature.
In the analysis of the results it is revealed that in animals infected with the BLV related to the genotype 4 especially significant specific features of clinical and hematological bovine leucosis conversion (monomorphic lymphocytes against lymphocytic leukocytosis, formation of the Reader cells) were observed in 5.9-32.3 % of sick individuals. Moreover, among the cattle-BLV carriers with mutation al changes in the locus of ENV gene in the greater number of animals there were identified clear signs of clinical and hematological disease phase. That fact gives attention that at 100 % of animals in the group № 2 we observed the phenomenon of lymph cytolysis, which is also a characteristic feature of the disease pointing to the damage of the cytoskeleton, mainly of the cell wall.
The conducted studies have indicated that the BLV infection caused by a virus with altered genotype in the structure of the studied highly conserved frag-ment in the locus of ENV gene may cause a significant risk of early manifestation of enzootic bovine leukemia with a high percentage (53.8 %) of the disease transi-tion from latent phase in hematological stage with more pronounced pathological changes.
Key words: bovine leukemia virus, Stavropol region, polymerase chain reaction, sequencing, phylogenetic analysis, genotype, hematology, blood cells.
Абакин Сергей Стефанович -
кандидат ветеринарных наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционных, незаразных и паразитарных болезней ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства» г. Ставрополь Тел.: 8-962-448-43-35 E-mail: abakins@yandex.ru
Красовская Татьяна Леонидовна -
кандидат биологических наук, научный сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский
институт овцеводства и козоводства»
г. Ставрополь
Тел.: 8-988-708-53-57
E-mail: t.krasovskaya@rambler.ru
Пономаренко Дмитрий Григорьевич -
кандидат биологических наук,
Abakin Sergey Stefanovich -
chief research worker at the laboratory of infectious, noninfectious and parasitic diseases, All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor Stavropol
Тel.: 8-962-448-43-35 E-mail: abakins@yandex.ru
Krasovskaya Tatiana Leonidovna -
research worker of All-Russian
Research Institute of Sheep and Goat Breeding,
Candidate of Biological Sciences
Stavropol
Тel.: 8-988-708-53-57 E-mail: t.krasovskaya@rambler.ru
Ponomarenko Dmitriy Grygorievich -
Federal Governmental Health Agency Stavropol
56
,,„ „„„„, Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
ФКУЗ «Ставропольский противочумный
институт Роспотребнадзора»
г. Ставрополь
Тел.: 8-918-747-21-56
E-mail: ponomarenko.dg@gmail.com
Оробец Владимир Александрович -
доктор ветеринарных наук, профессор,
заведующий кафедрой терапии и фармакологии
ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный
аграрный университет»
г. Ставрополь
Тел.: 8-928-327-60-16
E-mail: orobets@yandex.ru
anti plague institute of Rospotrebnadzor Stavropol
Tel.: 8-918-747-21-56
E-mail: ponomarenko.dg@gmail.com
Orobets Vladimir Alexandrovich -
Head of the Department for Therapy and Fharmacology,
Doctor of Veterinary Sciences, Professor FSBEI HE «Stavropol State Agrarian University» Stavropol
Tel.: 8-928-327-60-16 E-mail: orobets@yandex.ru
Развитие энзоотического лейкоза КРС сопряжено со злокачественной прогрессирующей пролиферацией клеток крови с нарушением их дифференци-ровки и созревания. По патогенетическому механизму болезнь сходна с истинными опухолевыми процессами, что и позволяет отнести данную нозологию к группе неопластических заболеваний[2].
При манифестации болезни формируются клоны патологически измененных клеток, преимущественно лимфоцитов. В результате про-грессирования лейкоза в тканях, в том числе «неиммунных», образуются очаговые или диффузные разрастания новообразованной лим-фоидной ткани. Подобное явление инициирует изменения структуры органов, их функции, способствует извращению метаболизма серосодержащих аминокислот и сложных белков, накоплению онкогенных, токсических продуктов (индол, скатол), нарушению других видов обмена в организме, угнетению эритроцитар-ного и гранулоцитарного ростков гемопоэза, формированию вторичного иммунодефицит-ного состояния [3,4,5,6].
Хронологические особенности латентного периода болезни и степень выраженности патологических процессов при манифестации лейкоза КРС, вероятно, связаны, с одной стороны, с факторами макроорганизма, в частности, особенностями реагирования и состоянием иммунной системы, с другой - с факторами самого возбудителя BLV, которые позволяют ему противостоять механизмам иммунитета, выживать в организме хозяина, обусловливать длительность инкубационного периода и характер клинического проявления болезни [7,8,9,10,11].
В настоящее время большой интерес вызывает проблема причинно-следственной связи генотипических характеристик возбудителя и особенностей эпизоотологии и морфогенеза болезни. Подобных сведений относительно BLV и энзоотического лейкоза крупного рогато скота в доступной литературе не найдено [12,13,14].
Целью нашей исследовательской работы являлось проведение сравнительной оценки клинико-гематологических изменений у животных-носителей ВЛКРС с мутационными изменениями по выявленным генотипам.
До этого подобные исследования у нас в крае не проводились.
Материалы и методика исследований
В качестве клинического материала были использованы образцы цельной крови 47 голов крупного рогатого скота черно-пестрой голштинизированной и красной степной пород в возрасте старше четырех лет из 3 неблагополучных в отношении лейкоза хозяйств Ставропольского края.
Больной скот был разделен на 2 группы: первую группу составили инфицированные BLV коровы из двух хозяйств Кочубеевского района в количестве 34 гол., на основании филогенетического анализа относящиеся к генотипу 4, без мутационных изменений. Во вторую группу вошли 13 животных из хозяйства Труновского района, у которых выделен возбудитель лейкоза с мутационными изменениями в локусе ето-гена. Взятие проб крови для проведения гематологических исследований осуществляли в утренние часы, до кор мления, из каудальной вены. В крови определяли общее число лейкоцитов, абсолютное и относительное количество лимфоцитов, подсчитывали лейкоцитарную формулу по общепринятой методике [1]. Все обследуемые животные РИД- и ПЦР - позитивны на энзоотический лейкоз.
Результаты исследований
При гематологическом исследовании крови КРС группы № 1 установлено, что у более 41 % (14 жив.) обследуемых животных выявлено достоверное увеличение количества лейкоцитов (13,9 - 35,7х109/л), у больше половины особей (26,5 % - 9 жив.)наблюдали лимфоци-тоз (10,2 - 18,2х109/л) (рис.1).
Установлено явление усиленного разрушения лимфоцитов - лимфоцитолиз у 61,7 % (21 жив.) больных лейкозом коров, у 2-х голов (5,9 %) визуализировали амитотические формы лимфоцитов - клетки Ридера (рис. 2).
В 32,3 % случаев (11 жив.) выявляли изменения, характерные для хронического лим-фолейкоза - мономорфность лимфоцитов (рис. 3).
При микроскопии мазков крови у 14,7 % (5 жив.) обнаруживали бластные или бластопо-добные формы лимфатических клеток, у одной особи (2,9 %) - двуядерные лимфоциты и у 11,8 % (4 жив.) - апоптотические формы клеток (табл. 1.).
в
естник АПК
Ветеринария -: № 1(21), 2016 " "
57
70 60 50 40 30 20 10 0
61,7
п
41,1
32,3
26,5
11,8
■ Лейкоцитоз I Лимфоцитоз
Кл. Боткина-Гумпрехта I Кл. Ридера I Мономорф. лимф. Властные лимф. Двуядерн. лимф. Апоптоз лимф. Цитомегалия лимф. IПлазмоциты
Рисунок 1 - Количественные и морфологические изменения лимфоцитов периферической крови
у животных группы №1
Рисунок 2 - Клетка Ридера. Рисунок 3 - Мономорфность лимфоцитов.
Таблица 1 - Количественные и морфологические изменения лимфоцитов периферической крови
у обследованных животных в группах сравнения
Выявленные изменения Группа №1 (п=34) % / абс. Группа №2 (п=13) % / абс.
Лейкоцитоз 41,1 / 14 53,8 / 7
Лимфоцитоз 26,5 / 9 53,8 / 7
Лимфоцитолиз (клетки Боткина-Гумпрехта) 61,7 / 21 100/ 13
Клетки Ридера 5,9 / 2 38,5 / 5
Мономорфность лимфоцитов 32,3 / 11 53,8 / 7
Бластные (бластоподобные) формы лимфоцитов 14,7 / 5 23,1 / 3
Двуядерные лимфоциты 2,9 / 1 23,1 / 3
Апоптотические формы лимфоцитов 11,8 / 4 38,5 / 5
Цитомегалия лимфоцитов - 7,7 / 1
Плазмоциты и плазмоцитоподобные клетки - 7,7 / 1
При обследовании больного лейкозом крупного рогатого скота группы № 2 выявлен лейкоцитоз, увеличение абсолютного и относительного количества лимфоцитов у 53,8 % (7 жив.) животных. Уровень лейкоцитов
у указанных особей находился в пределах от 16,8х109/л до 53,6х109/л. Относительное количество лимфоцитов составляло от 49 до 87 %, абсолютное - от 8,43х109/л до 41,2х109/л соответственно.
58
Ежеквартальный
научно-практический
журнал
В
При изучении морфологической картины крови коров, инфицированных возбудителем лейкоза с мутационными изменениями в локусе
впу-гена, у всех животных установлен лимфоци-толиз от умеренной до резко выраженной степени (рис. 4).
100
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
¡Лейкоцитоз I Лимфоцитоз
Кл. Боткина-Гумпрехта I Кл. Ридера I Мономорф. лимф. Властные лимф. Двуядерн. лимф. Апоптоз лимф. I Цитомегалия лимф. I Плазмоциты
Рисунок 4 - Количественные и морфологические изменения лимфоцитов периферической
крови у животных группы № 2
У 38,5 % (5 жив.) выявлены клетки с неправильным, часто полиморфным ядром - «Ри-деровские» формы лимфоцитов, которые образуются в результате аномального деления и нарушения дифференцировки (рис. 5).
У 53,8 %(7 гол.) животных визуализировали значительное количество мономорфных однотипных лимфоцитов с гиперхромным ядром,
что характерно для хронического лимфолейко-за, бластные и двуядерные лимфоциты (рис. 6) выявляли у 23,1 % (3 жив.) обследуемых особей группы № 2. У 38,5 % (5 гол.) коров наблюдали активный апоптоз лимфоцитов. Цитомегалию лимфоцитов и плазматические клетки в периферической крови регистрировали у одного животного (7,7 %).
Рисунок 5 - Онкотрансформация лимфоцитов, клетки Ридера, клетка-тень Боткина-Гумпрехта (стрелка).
При анализе полученных результатов установлено, что у животных, инфицированных BLV, относящимся к генотипу 4, особо показательные специфические признаки клинико-гематологической конверсии лейкоза КРС (мономорфность лимфоцитов на фоне лимфо-цитарного лейкоцитоза, образование клеток
Рисунок 6 - Двуядерный лимфоцит.
Ридера) выявлены у 5,9 - 32,3 % больных особей. При этом среди КРС - носителей BLV с мутационными изменениями в локусе впу-гена у большего количества животных (38,5 - 53,8 %) были выявлены явные признаки клинико-гематологической фазы болезни. Обращает на себя внимание тот факт, что у 100 % животных
в
:№ 1(21), 2016
группы № 2 наблюдали явление лимфоцитоли-зиса, что также является характерным признаком болезни, указывая на повреждение цито-скелета, преимущественно клеточной стенки.
Анализ вышеизложенного и полученных результатов исследований позволяет предпо-
Ветеринария
59
ложить, что формирование гемобластоза у больных энзоотическим лейкозом КРС связано с повышением онкогенности (патогенно-сти) ВЛКРС, которое, вероятно, ассоциировано с мутационными изменениями в локусе епу-гена.
Литература
1. Пономаренко Д. Г., Aбакин С. С. Руководство по гематологической и гистологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота : метод. пособие-атлас. Ставрополь : ГНУ СНИИЖК, 2010. 79 с.
2. Пономаренко Д. Г, Aбакин С. С., Лапина Т. И. Патоморфологическое проявление иммунодефицита у крупного рогатого скота при лейкозе II Ветеринарный врач. 2009.№ 1. С. 19-22.
3. Aбакин С. С., Пономаренко Д. Г., Бор-щев Е. A. Гистологическая архитектоника органов иммуногенеза крупного рогатого скота в клинико-гематологическую стадию лейкоза II Таврмський науковий вюник. 2009. Вип. 64. С. 176-181.
4. Aбакин С. С. Лейкоз крупного рогатого скота и овец на Ставрополье : моногр. Ставрополь : ГНУ СНИИЖК, 2014. 312 с.
5. Aбакин С. С., Пономаренко Д. Г., Бор-щев Е. A. Противоэпизоотические мероприятия по лейкозу крупного рогатого скота в стационарно неблагополучном хозяйстве II Современные научные тенденции в животноводстве : сб. науч. тр. по материалам Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения П. ГГ Петского I Вятская ГСМ. Киров, 2009. С. 27-30.
6. Aбакин С. С., Красовская Т. Л. О защите племенного поголовья крупного рогатого скота от инфекционных болезней в хозяйствах Ставропольского края II Сб. науч. тр. ВНИИОК I Ставрополь, 2014. Т. 2. С. 335-340.
7. Aбакин С. С., Криворучко С. В. Новые подходы в диагностике и оздоровлении стад от вирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота II Ветеринарная патология. 2013. № 1. С. 36-39.
8. Mechanisms of pathogenesis in duced by bovine leukemia virusas a model for human T-cell leukemia virus I Y. Aida, H. Murakami, M. Takahashi, S. N. Takeshima II Front. Microbiol. 2013. Vol. 4. P. 328.
9. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing I D. Beier, P. Blankenstein, O. Marquardt, J. Kuzmak II Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2001. Vol. 114, № 7-8. P. 252-256.
10. Braoudaki M., Tzortzatou-Stathopoulou F. Tumorigenesis related to retroviral infections II J. Infect. Dev. Ctries. 2011. № 5 (11). P. 751-758.
References
1. Ponomarenko D. G., Abakin S. S. Guide to hematological and histological diagnostics of bovine leukemia: methodical textbook (atlas). The publication of GNU SNIIZHK,
2010. 79 p.
2. Ponomarenko D. G., Abakin S. S., Lapina T. I. Pathological manifestation of immunodeficiency at leukemia // J. Animal Doctor. 2009. №1. P. 19-22.
3. Abakin S. S.,Ponomarenko D. G., Borschev E. A. Histological architectonic of immune organs genesis at cattle in clinical and hematological stage of leukemia // Tavria Scientific Bulletin. 2009. Vol. 64. P. 176-181.
4. Abakin S. S. Bovine leukemia in the Stavropol region : monograph. Stavropol: GNU SNIIGK. 2014. 312 p.
5. Abakin S. S., Ponomarenko D. G., Borschev T. A. Anti-epizootic measures on bovine leukemia in permanently disadvantaged economy //Modern scientific tendencies in the animal husbandry : Collection of articles of the international scientific and practical conference devoted to the 100 th anniversary of P. G. Petsky. Kirov, 2009. P. 27-30.
6. Abakin S. S., Krasovskaya T. L. On the protection of breeding cattle from infectious diseases inh the farms of Stavropol Territory / S. S. Abakin // Proceedings of the All-Russian Institute for Sheep and Goat Breeding. 2014. Vol. 2. № 7. P. 335-340.
7. Abakin S. S., Krivoruchko S. V. New approaches in diagnosis and recovery stages from leukemia and immunodeficiency viruses in cattle / S. S. // Veterinary pathlogy. 2013. № 1. P. 36-39.
8. Aida Y., Murakami H., Takahashi M., Takeshima SN. Mechanisms of pathogenesis induced by bovine leukemia virus as a model for human T-cell leukemia virus // Front. Microbiol. 2013. Vol.4. P.328.
9. BeierD., BlankensteinP., Marquardt O., Kuzmak J. Identification of different BLV provirus isolates by PCR, RFLPA and DNA sequencing // Berl. Munch.Tierarztl.Wochenschr. 2001. Vol. 114. № 7-8. P. 252-256.
10. Braoudaki M., Tzortzatou-Stathopoulou F. Tumorigenesis related to retroviral infections // J. Infect. Dev. Ctries.
2011. № 5 (11). P. 751-758.
11. Frie M. C., Coussens P. M. Bovine leukemia virus: a major silent threat to proper immune
60
,,„ „„„„, Jj Ставрополья
научно-практическии журнал
11. Frie M. C., Coussens P. M. Bovine leukemia virus: a major silent threat to proper immune responses in cattle // Vet. Immunol. Immunopathol. 2015. 163(3-4). P. 103-114.
12. Aida BLV-CoCoMo-qPCR : a useful tool for evaluating bovine leukemia virus infection status / M. I. Jimba, S. N. Takeshima, H. Murakami, J. Kohara, N. Kobayashi, T. Matsuhashi, T. Ohmori, T. Nunoya // BMC Vet. Res. 2012. № 8. P. 167.
13. Cell surface expression of the bovine leukemia virus-binding receptor on B and T lymphocytes is induced by receptor engagement / M. Lavanya, S. Kinet, A. Montel-Hagen, C. Mongellaz, J. L. Battini, M. Sitbon, N. Taylor // J. Immunol. 2008. № 181 (2). P. 891-898.
14. Estimation of bovine leukemia virus (BLV) proviral load harbored by lymphocyte subpopulations in BLV-infected cattle at the subclinical stage of enzootic bovine leucosis using BLV-CoCoMo-qPCR / C. J. Panei, S. N. Takeshima, T. Omori, T. Nunoya, W. C. Davis, H. Ishizaki, K. Matoba, Y. Aida // BMC Vet. Res. 2013. № 9. P. 95.
responses in cattle // Vet. Immunol. Immunopathol. 2015. 163(3-4). P. 103-14.
12. Jimba M. I., Takeshima S. N., Murakami H., Kohara J., Kobayashi N., Matsuhashi T., Ohmori T., Nunoya T., Aida Y. BLV-CoCoMo-qPCR: a useful tool for evaluating bovine leukemia virus infection status // BMC Vet. Res. 2012. № 8. P. 167.
13. Lavanya M., Kinet S., Montel-Hagen A., Mongellaz C., Battini J. L., Sitbon M., Taylor N. Cell surface expression of the bovine leukemia virus-binding receptor on B and T lymphocytes is induced by receptor engagement // J. Immunol. 2008. N.181(2). P. 891-898.
14. Panei C. J., Takeshima S. N., Omori T., Nunoya T., Davis W. C., Ishizaki H., Matoba K., Aida Y. Estimation of bovine leukemia virus (BLV) proviral load harbored by lymphocyte subpopulations in BLV-infected cattle at the subclinical stage of enzootic bovine leucosis using BLV-CoCoMo-qPCR // BMC Vet. Res. 2013. № 9. P. 95.
