CC BY
1
БИОАНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ BIOANALYTICAL METHODS
УДК 615.03:543.51+543.54
https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316 Оригинальная статья | Original article
Ц) Check for updates
С«)]
BY 4.0
И.И. Яичков12 Н Е>, А.Л. Хохлов2 Э, М.К. Корсаков1 D, А.А. Шетнев1 ID, Н.Н. Вольхин1 Э, С.С. Петухов12 Э
РЕЗЮМЕ
Изучение фармакокинетики нового производного изоксазола на крысах с применением ВЭЖХ-МС/МС для анализа проб крови
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»,
ул. Республиканская, д. 108/1, г. Ярославль, 150000, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ярославский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ул. Революционная, д. 5, г. Ярославль, 150000, Российская Федерация
Н Яичков Илья Игоревич; i.yaichkov@yspu.org
ВВЕДЕНИЕ. Для изучения системной экспозиции селективного ингибитора карбоангидразы II типа производного изоксазола 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид (TFISA) необходима оценка его фармако-кинетических параметров в цельной крови, поскольку это соединение способно накапливаться в эритроцитах. Ранее биоаналитические методики для решения данной задачи разработаны не были.
ЦЕЛЬ. Разработка биоаналитической методики определения 5-[5-(трифторме-тил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и N-ацетил^-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида в крови лабораторных животных и сравнение фармакокинетики глазной суспензии TFISA после однократной инстилляции и внутрибрюшинного введения крысам. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Количественное определение проводили методом высокоэффективной хроматографии с тандемным масс-спектрометри-ческим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) с использованием образцов крови крыс и кроликов. Хроматографическое разделение осуществляли с помощью колонки Zorbax Eclipse Plus C18 (150*3,0 мм, 3,5 мкм) c применением 0,1% водного раствора муравьиной кислоты и метанола для градиентного элюирования. Масс-спектрометрическое детектирование выполняли в режиме мониторинга множественных реакций. Изучение фармакокинетики проводили на двух группах крыс линии Wistar по 6 особей (по 3 самца и 3 самки). Первой группе животных осуществляли инстилляцию 1% глазной суспензии TFISA в каждый глаз из расчета 3,7 мг/кг. Животным второй группы вводили этот же препарат вну-трибрюшинно в той же дозе. Образцы крови отбирали до введения препарата, а также спустя определенные временные интервалы после введения. РЕЗУЛЬТАТЫ. Разработана ВЭЖХ-МС/МС-методика количественного определения TFISA и его метаболитов в крови лабораторных животных (кроликов и крыс). ВЭЖХ-МС/МС-методика полностью валидирована в соответствии с нормативными актами Евразийского экономического союза и требованиями руководства ICH M10. Аналитический диапазон определения TFISA в крови составил 20-20000, N-гидроксипроизводного - 2-2000, N-ацетилпроизводного -0,1-100,0 нг/мл. Максимальная концентрация TFISA в крови после инстилляции в глаз достигала 8173±1491, N-гидроксипроизводного - 695±271, N-ацетил-производного - 6,33±1,51 нг/мл. Период полувыведения TFISA при данном пути введения составил 58±10, N-гидроксипроизводного - 70±24, N-ацетилпроиз-водного - 14±3 ч. Биодоступность действующего вещества составила 90,18%.
© И.И. Яичков, А.Л. Хохлов, М.К. Корсаков, А.А. Шетнев, Н.Н. Вольхин, С.С. Петухов, 2024
ВЫВОДЫ. Разработанная биоаналитическая методика определения 5-[5-(трифтор-метил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (TFISA) и его метаболитов в крови лабораторных животных была успешно использована для анализа образцов цельной крови крыс. В ходе исследования фармакокинетики глазной суспензии данного соединения выявлен длительный период полувыведения действующего вещества и его метаболитов, а также высокая относительная биодоступность.
Ключевые слова: ВЭЖХ-МС/МС; тандемная масс-спектрометрия; кровь; валидация; фармакокинетика; ингибитор карбоангидразы II, ^гидроксисульфонамид; доклинические исследования; методика определения; период выведения; биодоступность
Для цитирования: Яичков И.И., Хохлов А.Л., Корсаков М.К., Шетнев А.А., Вольхин Н.Н., Петухов С.С. Изучение фармакокинетики нового производного изоксазола на крысах с применением ВЭЖХ-МС/МС для анализа проб крови. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2024;14(3):304-316. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316
Финансирование. Грант Российского научного фонда № 22-13-20085.
Потенциальный конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Ilya I. Yaichkov12 Н Alexander L. Khokhlov2 Э, Mikhail K. Korsakov1 ©, Anton A. Shetnev1 © Nikita N. Volkhin1 E>, Sergey S. Petukhov1,2 О
ABSTRACT
Pharmacokinetics Study of a New Isoxazole Derivative in Rats Using HPLC-MS/MS for Blood Sample Analysis
1 Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky, 108/1 Respublikanskaya St., Yaroslavl 150000, Russian Federation
2 Yaroslavl State Medical University, 5 Revolutsionnaya St., Yaroslavl 150000, Russian Federation
IS Ilya I. Yaichkov; i.yaichkov@yspu.org
INTRODUCTION. Systemic exposure studies of a selective carbonic anhydrase II inhibitor, the isoxazole derivative 5-[5-(trifl.uoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide (TFISA), require evaluating its pharmacokinetics in whole blood because the compound can accumulate in erythrocytes. Currently, no bioanalytical procedures have been developed to achieve this.
AIM. This study aimed to develop a bioanalytical procedure for the determination of TFISA and its metabolites (N-hydroxy-5-[5-(trifl.uoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and N-acetyl-5-[5-(trifl.uoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfon-amide) in the blood of laboratory animals and compare the pharmacokinetics of TFISA ophthalmic suspension in rats after a single ocular or intraperitoneal administration. MATERIALS AND METHODS. The quantitative determination was performed by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) using rat and rabbit blood samples. The chromatographic separation used a Zorbax Eclipse Plus C18 column (150*3.0 mm, 3.5 |m) and a gradient elution system of 0.1% aqueous formic acid and methanol. The multiple reaction monitoring mass spectrometry mode was used for detection. The pharmacokinetics study was conducted in 2 groups of 6 Wistar rats (3 males and 3 females per group). Group 1 received an instillation of 1% TFISA ophthalmic suspension in each eye at a dose of 3.7 mg/kg. Group 2 received an intraperitoneal injection of the same product at the same dose. Blood samples were collected at baseline and at several intervals after administration. RESULTS. The authors developed a bioanalytical procedure for the determination of TFISA and its metabolites in the blood of laboratory animals (rabbits and rats). This HPLC-MS/MS procedure was fully validated in accordance with the requirements of the EAEU legislation and the ICH M10 guideline. The analytical ranges in blood were 20-20000 for TFISA, 2-2000 for the N-hydroxy metabolite, and 0.1-100.0 ng/mL for the N-acetyl metabolite. The maximum blood levels after ocular instillation (mean±SD) were 8173±1491 for TFISA, 694±271 for the N-hydroxy metabolite, and 6.33±1.51 ng/mL for the N-acetyl metabolite. The half-lives for this route of adminis-
tration were 58±10 (TFISA), 70±24 (N-hydroxy metabolite), and 14±3 h (N-acetyl metabolite). The bioavailability of TFISA was 90.18%.
CONCLUSIONS. The developed and validated bioanalytical procedure for the determination of TFISA and its metabolites in the blood of laboratory animals has been successfully applied to samples of rat whole blood. According to the study of ophthalmic suspension pharmacokinetics, TFISA and its metabolites have long half-lives and high bioavailability.
Keywords: HPLC-MS/MS; tandem mass spectrometry; blood; validation; pharmacokinetics; carbonic anhydrase II inhibitor; N-hydroxysulfonamide; preclinical studies; assay; excretion period; bioavailability
For citation: Yaichkov I.I., Khokhlov A.L , Korsakov M.K., Shetnev A.A., Volkhin N.N., Petukhov S.S. Pharmacokinetics study of a new isoxazole derivative in rats using HPLC-MS/MS for blood sample analysis. Regulatory Research and Medicine Evaluation. 2024;14(3):304-316. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316
Funding. Russian Science Foundation grant No. 22-13-20085. Disclosure. The authors declare no conflict of interest.
ВВЕДЕНИЕ
Ингибиторы карбоангидразы (КА) - лекарственные средства (ЛС), механизм действия которых основан на связывании с ионом цинка, находящимся в активном центре этого фермента. Такие ЛС широко применяют в офтальмологии для терапии открытоугольной глаукомы, характерным симптомом которой является повышенное внутриглазное давление. Терапевтический эффект при этом вызван уменьшением секреции внутриглазной жидкости в переднюю камеру глаза благодаря снижению активности КА II типа [1].
Первые препараты системного действия (аце-тазоламид, метазоламид и этоксоламид) блокировали все изоформы КА, тем самым вызывая множественные нежелательные лекарственные реакции [1]. В настоящее время широко используют селективные ингибиторы КА II типа брин-золамид и дорзоламид, обладающие местным действием, которые производят, в том числе
в форме глазной суспензии. Это значительно
р
снижает частоту и тяжесть побочных эффектов [2]. Новое соединение данной группы 5-[5-(три-фторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфо-намид (TFISA) (I) в виде 1% суспензии по своей фармакологической активности и продолжительности действия превосходит разработанные ранее ЛС [3]. В процессе биотрансформации данного соединения образуются два метаболита: ^гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (M1) (II) и N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида (M2) (III).
Бринзоламид [4], дорзоламид [5], а также близкий по структуре к изучаемому действующему веществу 4-(2-метил-1,3-оксазол-5-ил)-бензолсульфона-мид [6] при инстилляции в глаз способны попадать в системный кровоток. Поэтому в рамках данного исследования предусмотрено определение относительной биодоступности субстанции TFISA. Все представители группы ингибиторов КА способны накапливаться в эритроцитах [4-6], поэтому
F
H,N
/ S
HO — NH
/Ч
0^° о Sx
■■ 0
НзС
NH
III
O
H2N S^
II
O
F
F
O
II
F
O
при доклиническом изучении суспензии TFISA целесообразно определение фармакокинетических констант действующего вещества и его метаболитов в крови лабораторных животных в дополнение к рекомендованному в нормативной документации исследованию плазмы крови1. Аналогичный подход к проведению фармакокинетических исследований характерен для циклоспорина А [7], такролимуса [8], эверолимуса [9], индапамида [10], финголимода [11]. В качестве биологического объекта для определения концентрации данных аналитов также выбрана цельная кровь.
Биоаналитические методики для измерения концентрации TFISA и его метаболитов ранее разработаны не были. Дополнительной задачей при разработке методики является предотвращение разложения ^гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида, способного окисляться с образованием 5-[5-(трифтор-метил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфоновой кислоты [6, 12]. Так, в исследовании фармакокинетики 4-(2-метил-1,3-оксазол-5-ил)-бензолсульфо-намида, который также метаболизируется путем N-гидроксилирования сульфонамидной группы, для данных целей был использован 10% водный раствор тиосульфата натрия, который добавляли к К3ЭДТА-крови в объемном соотношении 1:1 [6].
Цель работы - разработка биоаналитической методики определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-ок-сазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метабо-литов^гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и ^ацетил-5-[5-(три-фторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфон-амида в крови лабораторных животных и сравнение фармакокинетики глазной суспензии TFISA после однократной инстилляции и внутрибрю-шинного введения крысам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Активная субстанция 5-[5-(трифторметил)-1,2-ок-сазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его глазная суспензия разработаны и произведены в Центре трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова ЯГПУ им. К.Д. Ушинского. Состав исследуемой суспензии: TFISA - 50 мг, карбопол 974 - 20 мг, твин-80 - 2,5 мг, манни-тол - 165 мг, 10% раствор натрия гидроксида до рН 7,5-8,5, 0,9% раствор натрия хлорида -до 5 мл. Данная субстанция находится на стадии доклинического исследования. Изучение фармакокинетики действующего вещества проводили на лабораторной серии суспензии.
В работе использовали метанол (LiChrosoLv hypergrade for LC-MS, Merck KGaA) и муравьиную
кислоту (Optima LC-MS-Grade, Thermo Fisher Scientific), пригодные для ВЭЖХ-МС-анализа для приготовления подвижной фазы. Деионизированную воду получали с помощью установки Arium Mini (Sartorius AG).
В работе использованы субстанции, синтезированные в Центре трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова ЯГПУ им. К.Д. Ушинского: 5-[5-(трифторметил)-1,2-ок-сазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид (99,1%),
1Ч-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид (98,2%) (М1), 1Ч-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид (98,5%) (М2), 5-[2-(мор-фолин-4-карбонил)-1,3-оксазол-5-ил]-тиофен-2-сульфонамид (THSA) (IV) (98,3%) - внутренний стандарт (ВС). Структура и чистота данных соединений охарактеризованы методами ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии, масс-спек-трометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии. Это позволило использовать их в качестве стандартных образцов определяемых веществ.
Исходные растворы аналитов и внутреннего стандарта с концентрацией 1000 мкг/мл готовили в диметилсульфоксиде (х.ч., АО «Ленреактив»), рабочие растворы - в метаноле (режим хранения - не выше +4 °С).
Исследование проводили с помощью ВЭЖХ-МС/МС-системы, включающей в себя тандемный масс-спектрометрический детектор OTRAP 5500 (AB Sciex) и хроматограф 1260 Infinity (Agilent Technologies) с бинарным насосом G1312B, автодозатором G1329B с внешним термостатом G1330B, термостатом колонок G1316A. Для управления прибором использовано программное обеспечение Analyst 1.6.2, для интегрирования полученных хромато-грамм - MultiOuant 3.0.5 (AB Sciex).
Хроматографическое разделение осуществляли в градиентном режиме на колонке Zorbax Eclipse Plus C18 (150*3,0 мм, 3,5 мкм) с предколонкой Zorbax Eclipse Plus C18 (12,5*2,1 мм, 5,0 мкм) (Agilent Technologies) при скорости потока 0,6 мл/мин и температуре термостата 40 °С. Динамика изменения соотношения компонентов подвижной фазы: 0,1% водного раствора муравьиной кислоты (А) и метанола (В), представлена в таблице 1.
Масс-спектрометрическое детектирование проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) (табл. 2). Количественные MRM-переходы использовали для количественного определения аналитов, контрольные
1 Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М.: Гриф и К; 2012.
MRM-переходы - для дополнительного подтверждения правильности идентификации. MRM-переход внутреннего стандарта THSA 342—78 m/z с более интенсивным сигналом применяли для расчета концентрации TFISA, MRM-переход 342—410 m/z с менее интенсивным сигналом - для расчета концентрации М1 и М2. Для ионизации элюата использовалось электрораспыление: полярность отрицательная, напряжение -4500 В; температура источника ионов - 700 °С.
Для подготовки проб крови применяли осаждение белков и форменных элементов: к 20 мкл крови лабораторного животного добавляли 200 мкл метанольного раствора THSA c концентрацией 500 нг/мл, смесь перемешивали, добавляли 10 мкл 1% водного раствора муравьиной кислоты и снова перемешивали. Пробу центрифугировали (Heraeus MuLtifuge X3R, Thermo Fisher Scientific) 5 мин при 10000 об./мин. Надосадочная жидкость вводилась в хромато-графическую систему.
Калибровочные образцы (K1-K8), образцы контроля качества (нижний предел количественного определения (НПКО), нижний, средний и верхний
уровни концентрации) и образцы для теста разведения (DiL) готовили путем добавления к 95 мкл крови лабораторного животного 5 мкл комбинированного рабочего раствора аналитов соответствующего уровня концентрации. Концентрация аналитов в комбинированном рабочем растворе аналитов в 20 раз превышала их концентрацию в соответствующем образце (табл. 3).
Валидацию разработанной методики проводили согласно требованиям Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов2 и руководства ICH M103 по следующим показателям:
• селективность;
• градуировочная кривая;
• правильность и прецизионность внутри серии (по 2 серии на образцах биоматериала крысы и кролика) и между сериями;
• эффект разведения образца (двухкратное разведение);
• эффект матрицы (расчет относительного стандартного отклонения (RSD), нормализованного фактора матрицы и правильности и прецизионности измерений на нижнем (LOC) и верхнем (HOC) уровнях концентрации);
Таблица 1. Условия градиентного элюирования Table 1. Gradient elution conditions
Время, мин Time, min 0,1% водный раствор муравьиной кислоты (А), % 0.1% aqueous formic acid (A), % Метанол (В), % Methanol (B), %
0,0-0,5 65 35
2,0-5,0 65^35 35—65
5,0-5,1 35^10 65—90
5,1-7,0 10 90
7,0-7,1 10^65 90—35
7,1-8,0 65 35
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Таблица 2. Параметры масс-спектрометрического детектирования в режиме мониторинга множественных реакций
Table 2. Parameters of mass spectrometric detection in the multiple reaction monitoring mode
MRM-переходы, m/z MRM-transitions, m/z
TFISA M1 M2 THSA
количественный quantitative контрольный control количественный quantitative контрольный control количественный quantitative контрольный control ВС для TFISA IS for TFISA ВС для M1, M2 IS for Ml and M2
281—136 281—66 297—136 297—66 323—136 323—66 342—78 342—110
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. MRM - мониторинг множественных реакций, TFISA - 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; Ml - ^гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; М2 - N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; THSA - 5-[2-(морфолин-4-карбонил)-1,3-оксазол-5-ил]-тиофен-2-сульфонамид; ВС - внутренний стандарт. Note. MRM, multiple reaction monitoring; TFISA, 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; Ml, N-hydroxy-5-[5-(tri-fluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; M2, N-acetyl-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; THSA, 5-[2-(morpholine-4-carnonyl)-1,3-oxazole-5-yl]-thiophene-2-sulfonamide; IS, internal standard.
2 Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 85 «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза».
3 ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis. EMA/CHMP/ICH/172948/2019. EMA; 2022.
• перенос аналитов и ВС из предыдущей пробы;
• стабильность (краткосрочная стабильность (STS) (цельная кровь); долгосрочная стабильность (LTS) (цельная кровь); стабильность после 3 циклов заморозки/разморозки (FTS) (цельная кровь); стабильность приготовленных проб в автодозаторе (ASS);
• воспроизводимость при повторном введении аналитической серии.
Образцы НПКО, нижнего, среднего и верхнего уровня концентраций, а также Dil готовили в 6 повторностях для каждого испытания, калибровочные образцы - в одной повторности.
Для первоначальной оценки фармакокинетиче-ских параметров в крови в рамках данного исследовании выбраны крысы, так как этот вид является наиболее доступной экспериментальной моделью [13, 14]. При выявлении высоких концентраций TFISA и его метаболитов в крови эксперимент может быть проведен также на втором виде животных-негрызунов - кроликах, поэтому методику разрабатывали для измерения концентрации аналитов в крови обоих видов животных.
Холостые образцы крови крыс линии Wistar массой более 500 г отбирали из яремной вены, холостые образцы крови кроликов породы Советская шиншилла массой более
3 кг - из ушной вены (все животные - питомник ООО «СМК Стезар»). Для данных целей использовали пробирки Improvacuter объемом 3 мл (Guangzhou Improve Medical Instruments Co.).
Оценку селективности и матричных эффектов проводили отдельно для каждого вида животных. Образцы контроля качества и холостые образцы готовили с применением крови, полученной от 6 разных животных, включая цельную и размороженную кровь. На основании результатов проведенных испытаний дизайн валидации был оптимизирован и количество серий по определению правильности и прецизионности сокращено до 2 для каждого биологического вида (крысы и кролики). Стабильность аналитов изучали только на образцах крови крыс, так как в ходе предварительного подбора антикоагулянта различий между матрицами не установлено.
Исследование фармакокинетики 1% суспензии 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида проводили на двух группах крыс линии Wistar по 6 особей (по 3 самца и 3 самки, питомник ООО «СМК Стезар»). Первой группе животных (масса 216±26 г (M±SD)) проводили инстилляцию лекарственного препарата из расчета 40 мкл в каждый глаз, что соответствовало дозе 3,7 мг/кг (в расчете на среднюю массу животных в группе):
Таблица 3. Концентрации 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в модельных образцах крови крысы
Table 3. Concentrations of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and its metabolites in spiked samples of rat blood
Аналит Analyte Содержание в калибровочных образцах, нг/мл Analyte concentration in calibration samples, ng/mL
K1 (НПКО) (LLOQ) K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8
TFISA 20 100 500 2000 5000 10000 15000 20000
M1 2 10 50 200 500 1000 1500 2000
M2 0,1 0,5 2,5 10,0 25,0 50,0 75,0 100,0
Аналит Analyte Содержание в образцах контроля качества, нг/мл Analyte concentration in quality control samples, ng/mL
Нижний уровень концентрации LQC Средний уровень концентрации MQC Верхний уровень концентрации HQC Dil
TFISA 60 7500 17500 35000
M1 6 750 1750 3500
M2 0,3 37,5 87,5 175
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. TFISA - 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; Ml - N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; М2 - N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; НПКО - нижний предел количественного определения; Dil - образцы для теста разведения.
Note. TFISA, 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; M1, N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; M2, N-acetyl-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; LLOQ, lower limit of quantification; LQC, low concentration quality control sample; MQC, middle concentration quality control sample; HQC, high concentration quality control sample; Dil, samples for the dilution integrity test.
Второй группе (масса 230±32 г (M±SD)) вводили изучаемую суспензию внутрибрюшинно в дозе 3,7 мг/кг. Данный способ выбран для оценки относительной биодоступности ввиду нерастворимости действующего вещества в воде. Использование двух параллельных групп животных обосновано длительным периодом полувыведения TFISA и его основного метаболита M1. Рандомизацию испытуемых не проводили. Отбор проб крови выполняли до введения препарата, а также через 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 6; 8; 12; 24; 48; 72; 144; 216 ч после введения в объеме 0,2 мл. Для данных целей использовали капиллярные пробирки Impromini (Guangzhou Improve Medical Instruments Co.), содержащие смесь натрия фторида и калия оксалата. Затем аликвоту цельной крови объемом 50 мкл замораживали до температуры не выше -70 °С (морозильная камера MELING DV-HL218).
Исследование одобрено этическим комитетом ЯГПУ им. К.Д. Ушинского (протокол № 2 от 10.10.2023).
Фармакокинетические параметры изучаемых соединений рассчитывали с применением программного пакета R v. 3.3.2 (модуль Bear v. 2.7.7) (R-Project): оценены максимальная концентрация аналита в крови (Cmax), время наступления максимальной концентрации аналита в крови (Tmax), площадь под фармакокинетической кривой начиная с момента приема препарата до времени последнего отбора крови (AUC0-t), площадь под фармакокинетической кривой начиная c момента приема препарата до бесконечности (AUC0-J, константа элиминации (KJ, период полувыведения аналита (Т ), среднее время удержания аналита в крови (MRT); использован некомпартментный подход.
Программное обеспечение Statsoft Statistica 10.0.1011 использовано для расчета показателей описательной статистики: среднего арифметического (M), стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD), стандартной ошибки среднего (SEM).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Подобранные условия хроматомасс-спектро-метрического определения позволили достичь высокого уровня чувствительности для определения каждого аналита. Выбранная программа градиентного элюирования (табл. 1) позволила надежно разделить TFISA и его ацетилиро-ванный метаболит M2 (разрешение между пиками >5), который подвержен фрагментации
в процессе ионизации до исходного иона действующего вещества. Это обеспечило требуемую селективность разработанной методики.
На следующей стадии исследования осуществляли выбор антикоагулянта путем оценки краткосрочной стабильности (24 ч на хладо-элементе со льдом), стабильности приготовленных проб в автосэмплере (24 ч при +4 °С), стабильности после 3 циклов заморозки/размо-розки (FTS) основного метаболита N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида. При этом использовали свежую цельную кровь и размороженную кровь, хранившуюся в течение 1 месяца в морозильной камере при температуре не выше -70 °С. Необходимость такого эксперимента обусловлена возможным снижением активности антиоксидантных систем эритроцитов в процессе хранения. В качестве антикоагулянтов применяли К3ЭДТА, гепарин лития и натрия фторид / калия оксалат (NaF/K2C2O4). На начальном этапе анализировали по 2 пробы цельной и гемолизированной крови с добавлением каждого антикоагулянта и комбинированного рабочего раствора аналитов с концентрацией на уровне HOC: 1 проба - из крови крысы, 1 проба - из крови кролика. Для осаждения белков и форменных элементов применяли только ме-танольный раствор THSA. Расчеты осуществляли методом внешнего стандарта относительно свежеприготовленного образца.
Результаты определения STS и FTS c использованием гепарина лития и смеси NaF/K2C2O4 соответствовали допустимому диапазону 85-115%4 от номинального значения концентрации М1. При хранении проб в автосэмплере наблюдали разложение N-гидроксиметаболита при применении всех антикоагулянтов, но при применении комбинации NaF/K2C2O4 оно было наименьшим. Данный антикоагулянт был выбран для дальнейшего подтверждающего исследования, в ходе которого анализировали по 6 проб цельной и гемолизированной крови с добавкой аналитов: 3 пробы - из крови крысы, 3 пробы -из крови кролика. Для стабилизации М1 к пробам после осаждения компонентов матрицы метанолом добавляли 1% водный раствор муравьиной кислоты, как и в работе [6] для стабилизации близкого по структуре ^гидрокси-4-(2-метил-1,3-оксазол-5-ил)-бензолсульфонамида. Полученные результаты соответствовали установленным требованиям5 (рис. 1 «Результаты изучения стабильности Ы-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-
4 Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 85 «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза». ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis. 2022.
5 Там же.
оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида в крови с применением различных антикоагулянтов», опубликован на сайте журнала6).
После выбора антикоагулянта и условий пробо-подготовки проведена полная валидация разработанной методики (табл. 4, 5). Оценка селективности определения изучаемых соединений и внутреннего стандарта выполнена совместно с испытанием внутрисерийной прецизионности и правильности (табл. 6 «Результаты оценки внутрисерийной правильности и прецизионности методики определения 5-[5-(трифторме-тил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в крови лабораторных животных», опубликована на сайте журнала7). Площадь хро-матографических пиков TFISA, М1 и М2 на хро-матограммах холостых образцов крови крыс и кроликов не превышала 20%, площадь хро-матографического пика THSA - 5% от площади хроматографических пиков данных веществ в соответствующих образцах с концентрацией НПКО (рис. 2 «Примеры хроматограмм холостого образца крови крысы и образца на уровне нижнего предела количественного применения», опубликован на сайте журнала8). Калибровочные зависимости, которые строили по соотношениям площадей хроматографических пиков «аналит/THSA», носили линейный характер. Угловые и свободные коэффициенты градуировочных кривых были близки для образцов крови обоих видов животных.
Изучение матричных эффектов проводили двумя способами. По первому способу осуществляли расчет коэффициента вариации нормализованного фактора матрицы (NMF)2. Его величина составляла 1,91-8,75% для каждого изучаемого соединения в крови крыс и кроликов и не превышала максимально допустимые 15%. Значение NMF аналитов в крови у обоих видов животных при этом близкие: 0,872-0,908 - для TFISA, 0,836-0,884 -для М1, 0,887-0,922 - для М2. Максимальная разница между NMF составляла 5,43% (для М1), что значительно меньше 15%. Это позволяет объединить результаты аналитических серий, выполненных на образцах крови крысы и кролика, при оценке межсерийной прецизионности и правильности. Оценку матричных эффектов вторым способом проводили путем расчета относительной погрешности (5) и RSD на нижнем и верхнем уровнях концентраций (табл. 6, опубликована
на сайте журнала9). Величина 5 в случае каждого аналита укладывалась в диапазон -9,83^-10,36%, RSD не превышало 9,30%, что соответствовало установленным требованиям10.
Правильность и прецизионность методики изучали путем анализа 4 аналитических серий: по 2 серии на образцах крови крыс и кроликов (табл. 5, 6). Средние значения 5 каждого аналита входили в установленный диапазон ±15% в образцах нижнего, среднего и верхнего уровней концентрации, значения RSD для каждого уровня не превышала 15%. Для НПКО-проб величина 5 для TFISA, M1 и M2 составляла ±20%, величина RSD была менее 20% (табл. 6, опубликована на сайте журнала11). Результаты межсерийного сравнения также входили в указанные выше допустимые диапазоны (табл. 5). При двукратном разведении проб крови с концентрацией Dil относительная погрешность определения для TFISA составила 7,95%, для M1 - 6,48%, для M2 - 6,87%, что соответствовало критериям приемлемости. Перенос TFISA из предыдущей пробы в холостой образец не превышал 20% от уровня образца НПКО, перенос остальных аналитов и внутреннего стандарта из предыдущей пробы отсутствовал.
В ходе валидации подтверждена краткосрочная стабильность, стабильность после 3 циклов за-морозки/разморозки, долгосрочная стабильность при температуре не выше минус 70 °С в течение 30 сут, стабильность приготовленных проб в автодозаторе (табл. 7): отклонение рассчитанных концентраций аналитов от номинальных значений не превышало ±15%. Для испытаний использовали только образцы крови крыс ввиду отсутствия различий в матричных эффектах и приемлемых результатов предварительных испытаний, выполненных на биологических объектах обоих видов. При повторном анализе серии спустя 7 2 ч величина относительной погрешности измерений аналитов входила в диапазон -0,49^9,09%, а величина RSD на каждом уровне концентраций -2,09^12,95% (табл. 5). Таким образом, выбранный антикоагулянт предотвратил разложение M1 при хранении образцов крови, а добавление 1% раствора муравьиной кислоты обеспечило стабильность приготовленных проб в автодозаторе.
Исследование фармакокинетики 5-[5-(трифтор-метил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида
6 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-fig1
7 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-table6
8 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-fig2
9 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-table6
10 Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 85 «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза».
ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis. 2022.
11 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-table6
Таблица 4. Результаты оценки правильности и прецизионности методики определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-окса-зол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в крови лабораторных животных (основные параметры валидации) Table 4. Accuracy and precision evaluation results for the method for the determination of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and its metabolites in the blood of laboratory animals (main validation parameters)
Испытание Test TFISA Ml M2
Калибровочная зависимость Calibration function Линейная Linear Линейная Linear Линейная Linear
Весовой коэффициент Weighting factor 1/x2 1/x 1/x
Аналитический диапазон, нг/мл Analytical range, ng/mL 20-20000 2-2000 0,1-100
Угловые коэффициенты калибровочных кривых (мин.-макс.) Slopes of calibration curves (min.-max.) Крыса Rat 0,00062-0,00070 0,0085-0,0010 0,0395-0,0464
Кролик Rabbit 0,00063-0,00069 0,0086-0,0010 0,0410-0,0452
Свободные коэффициенты калибровочных кривых (мин.-макс.) Intercepts of calibration curves (min.-max.) Крыса Rat 0,0016-0,0019 0,0012-0,0018 0,099-0,0151
Кролик Rabbit 0,0015-0,0018 0,0010-0,0015 0,0102-0,0140
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. TFISA - 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; Ml - N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; М2 - N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; x - концентрация.
Note. TFISA, 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; Ml, N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; M2, N-acetyl-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; x, concentration.
в форме 1% глазной суспензии проводили с использованием валидированной методики. Рассчитанные значения фармакокинетических параметров TFISA, М1 и М2 после инстилляции лекарственного препарата в глаз и его внутри-брюшинного введения представлены в таблице 8, их фармакокинетические профили - на рисунке 3.
Величина максимальной концентрации TFISA в крови составила ~8 мкг/мл после глазной инстилляции (01) и ~11,6 мкг/мл после внутри-брюшинной инъекции (1Р). Значения АиС0-1 данного соединения при обоих способах введения достаточно близкие, величина относительной биодоступности действующего вещества - 9 0,2% (табл. 8). Период полувыведения TFISA достаточно длительный - около 58 ч (01) и 61 ч (1Р) и сопоставимый при двух изученных путях введения.
Фармакокинетический профиль основного метаболита М1 после закапывания суспензии в глаз характеризовался медленным нарастанием концентрации данного аналита до величины ~0,7 мкг/мл к ~7,7 ч после введения и медленным ее снижением (рис. 3). При внутрибрюшинном способе введения детектирован более высокий
уровень Стах данного метаболита--1,6 мкг/мл,
достигнутый значительно быстрее - через 1,8 ч после введения. Длительность периода полувыведения М1 после инстилляции составила ~70 ч,
а после инъекции в брюшную полость--93 ч.
^гидроксипроизводное имело близкие значения
АиС01 при обоих способах введения (табл. 8). Это может быть связано с более медленным перераспределением действующего вещества из эритроцитов в плазму после закапывания в глаз, что привело к более продолжительному образованию и элиминации М1. При инъекции, вероятно, TFISA сразу в большом количестве проникает в плазму, из которой легче попадает в гепатоциты, поэтому в первые часы после внутрибрюшинного введения TFISA подвергается более интенсивной биотрансформации.
Концентрации ^ацетилпроизводного в крови значительно ниже концентраций TFISA, ^гидроксипроизводного. Так, при инстилляции ЛС в глаз Стах достигает ~6,4 нг/мл, а при внутри-
брюшинной инъекции--19,0 нг/мл. Величина
Ттах М2 (2,4 ч (01) и 1,7 ч (1Р)) при обоих способах вве дения близка к Ттах TFISA (2,8 ч (01) и 1,3 ч (1Р)). Период полувыведения М2 меньше, чем TFISA и М1. При этом его величина после закапывания изучаемого препарата в глаз меньше, чем после инъекции в брюшную полость: ~14,5 ч (01) и ~17,6 ч (1Р). При внутрибрюшинном введении также получено более высокое значение АиС0-1, которое приблизительно в 2 раза превосходит АиС0л (01) (табл. 7). Удлинения фазы снижения концентрации на фармакокинетическом профиле М2 за счет его накопления после инстилляции суспензии TFISA также не наблюдали (рис. 3). Это свидетельствует о более быстром выводе данного метаболита из системного кровотока.
Таблица 5. Результаты оценки правильности и прецизионности методики определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-окса-зол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в крови лабораторных животных (дополнительные параметры валидации) Table 5. Accuracy and precision evaluation results for the method for the determination of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and its metabolites in the blood of laboratory animals (additional validation parameters)
Испытание Концентрация TFISA Ml M2
Test Concentration 6,% RSD,% 6,% RSD, % 6,% RSD, %
Межсерийная правильность и прецизионность НПКО (LLOQ) 3,89 8,90 -5,87 9,78 1,66 12,84
LQC 4,88 5,75 5,06 10,86 0,54 6,91
Between-run accuracy and precision MQC 2,89 4,37 -6,32 7,13 1,19 6,29
HQC 0,64 7,42 -9,09 3,17 2,07 7,04
Воспроизводимость при повторном вводе серии (72 ч) НПКО (LLOQ) 1,08 6,42 3,00 6,54 7,77 8,02
LQC 4,10 4,12 8,14 12,95 4,80 8,26
Reinjection reproducibility (72 h) MQC 9,09 4,40 3,51 2,09 0,03 3,32
HQC 1,44 3,56 2,61 4,25 -0,49 3,26
Эффект разведения образца (двухкратное разведение) Dilution integrity (two-fold dilution) Dil 7,95 3,06 6,48 3,37 6,87 4,14
Концентрация Concentration NMF RSD (NMF), % NMF RSD (NMF), % NMF RSD (NMF), %
Эффект матрицы Matrix effect Крыса LQC 0,875 1,93 0,836 1,83 0,907 3,57
Rat HQC 0,908 5,14 0,884 4,70 0,887 8,75
Кролик LQC 0,872 1,91 0,874 4,60 0,922 2,73
Rabbit HQC 0,886 3,71 0,863 4,73 0,920 2,64
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. НПКО - нижний предел количественного определения; LQC, MQC, HOC - образцы контроля качества нижнего, среднего и верхнего уровней; Dil - концентрация для оценки эффекта разведения; TFISA - 5-[5-(трифторметил)-1,2-окса-зол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; M1 - N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; М2 - N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид, S - относительная погрешность, NMF - коэффициент вариации нормализованного фактора матрицы, RSD - относительное стандартное отклонение.
Note. LLOQ, lower limit of quantification; LQC, low concentration quality control sample; MQC, middle concentration quality control sample; HQC, high concentration quality control sample; Dil, concentration for the dilution integrity test; TFISA, 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; Ml, N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; M2, N-acetyl-5-[5-(tri-fluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; S, relative error; NMF, coefficient of variation of the normalised matrix factor; RSD, relative standard deviation.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Биоаналитическая методика количественного определения 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфаниламида и его ^гидрокси-и ^ацетилпроизводного в крови лабораторных животных была валидирована согласно актуальным регуляторным требованиям. В ходе испытаний были доказаны селективность, линейность калибровочной зависимости, правильность, прецизионность и отсутствие влияния разведения пробы на данные характеристики методики, отсутствие переноса аналитов и внутреннего стандарта из предыдущей пробы, эффекта матрицы, а также воспроизводимость при повторном введении аналитической серии. Использование смеси натрия фторида и калия оксалата в качестве антикоагулянта обеспечило стабильность ^гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфаниламида и других аналитов в пробах в процессе их обработки и хранения в морозиль-
ной камере. Широкий аналитический диапазон методики позволил измерить как высокие концентрации аналитов на начальных временных точках (без дополнительного разведения), так и их следовые количества в поздних точках отбора.
В результате исследования фармакокинети-ки глазной суспензии изучаемого ЛС зафиксированы высокие концентрации действующего вещества и ^гидроксиметаболита в крови крыс, а также длительный период их выведения как при инстилляции в глаз, так и при внутри-брюшинной инъекции. Содержание метаболита ^-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфаниламида) в крови значительно ниже, чем неизменного действующего вещества и его ^гидроксипроизводного, и его элиминация происходит значительно быстрее. Также установлено, что 5-[5-(трифторметил)-1,2-окса-зол-3-ил]-фуран-2-сульфаниламид при использовании в данной лекарственной форме имеет высокую величину относительной биодоступности.
Таблица 7. Испытание стабильности 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамида и его метаболитов в крови крыс
Table 7. Stability testing of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and its metabolites in rat blood
Испытание Test Температурный режим Temperature mode Отклонение от номинального значения, % Deviation from the nominal value, %
TFISA Ml M2
LQC HOC LQC HOC LQC HOC
Краткосрочная стабильность Short-term stability Хладоэлемент со льдом (24 ч) Ice pack (24 h) 5,72 -8,78 -3,92 -9,57 0,22 -4,69
Стабильность после 3 циклов заморозки и разморозки Stability after 3 freeze-thaw cycles Не выше -70 °С (12 ч) / Хладоэлемент со льдом (4 ч) No higher than -70 °С (12 h) / Ice pack (4 h) 6,76 -0,94 -0,89 -4,57 1,33 -1,84
Стабильность приготовленных проб в автосэмплере Autosampler stability Не выше +4 °С (48 ч) No higher than +4 °С (48 h) 7,92 1,23 -3,33 -12,84 1,24 2,82
Долгосрочная стабильность Long-term stability Не выше -70 °С (30 сут) No higher than -70 °С (30 days) 1,91 -4,57 -3,5 -7,76 2,33 -4,57
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. LQC - нижний уровень концентраций; HQC - верхний уровень концентраций; TFISA - 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; M1 - N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; М2 -N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид.
Note. LQC, low concentration quality control sample; HQC, high concentration quality control sample; TFISA, 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; Ml, N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-il]-furan-2-sulfonamide; M2, N-acetyl-5-[5-(tri-fluoromethyl)-1,2-oxazole-3-il]-furan-2-sulfonamide.
Таблица 8. Фармакокинетические параметры 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфаниламида и его метаболитов в крови крысы
Table 8. Pharmacokinetic parameters of 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide and its metabolites in rat blood
Параметр Parameter C , нг/мл max' ' (ng /mL) T ч max, (h) AUC0 нг*ч/мл (ng'h/mL) AUC0^ нг*ч/мл (ng'h/mL) Т1/2, 4 (h) К* ч -1 (h-1) MRT, ч (h)
TFISA Инстилляция в глаз M 8173 2,8 394313 440507 58,2 0,0122 68,7
Ocular instillation SD 1491 2,6 85096 114764 10,3 0,0023 6,0
RSD 18.3 92,5 21.6 26.1 17,7 18.87 8,7
SEM 609 1,1 34740 46852 4,2 0,0009 2,4
Внутрибрюшинное M 11638 1,3 437248 463706 60,9 0,0130 61,1
введение Intraperitoneal SD 3098 0,3 105972 103362 29,5 0,0042 5,1
administration RSD 26.6 21,9 24.2 22.3 48,5 32,26 8,4
SEM 1265 0,1 43263 42197 12,0 0,0017 2,1
M1 Инстилляция в глаз M 695 7,7 18795 20477 70,5 0,0107 47,9
Ocular instillation SD 271 0,8 5575 6185 24,0 0,0031 4,2
RSD 39.0 10,7 29.7 30.2 34,0 28,93 8,8
SEM 111 0,3 2276 2525 9,8 0,0013 1,7
Внутрибрюшинное M 1624 1,8 18826 20734 93,0 0,0083 35,5
введение Intraperitoneal SD 168 0,6 5139 6755 33,9 0,0031 7,3
administration RSD 10.4 33,0 27.3 32.6 36,5 36,89 20,5
SEM 69 0,3 2098 2758 13,8 0,0013 3,0
M2 Инстилляция в глаз M 6,4 2,4 70,3 73,9 14,5 0,0499 15,4
Ocular instillation SD 1,5 0,9 23,9 24,0 3,3 0,0119 3,4
RSD 23,74 38,0 34,0 32,5 22,5 23,77 21,9
SEM 0,6 0,4 9,8 9,8 1,3 0,0048 1,4
M2 Внутрибрюшинное введение M 19,0 1,7 141,5 142,7 17,6 0,0546 16,0
Intraperitoneal administration SD 4,7 0,3 64,4 70,3 10,3 0,0336 9,7
Продолжение таблицы 8 Table 8 (continued)
Параметр Parameter C , нг/мл max' ' (ng /mL) T ч max, (h) AUCo t нг*ч/мл (ng'h/mL) AUC0 x нг*ч/мл (ng'h/mL) Т1/2, 4 (h) K« ч -1 (h-1) MRT, ч (h)
M2 Внутрибрюшинное введение RSD 24,59 15,5 45,6 49,3 58,6 61,48 60,3
Intraperitoneal administration SEM 1,9 0,1 26,3 28,7 4,2 0,0137 4,0
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
Примечание. TFISA - 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; Ml - N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-окса-зол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; М2 - ^ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; M - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение; RSD -относительное стандартное отклонение; SEM - стандартная ошибка среднего. Cmax - максимальная концентрация аналита в крови, Tmax - время наступления максимальной концентрации аналита в крови, AUC0-l - площадь под фармакокинетической кривой начиная с момента приема препарата до времени отбора последнего отбора крови, AUC0-oi - площадь под фармакокинетической кривой начиная с момента приема препарата до бесконечности, Kel -константа элиминации, Т1Д - период полувыведения аналита, MRT - среднее время удержания аналита в крови крысы. Note. TFISA, 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; Ml, N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-il]-furan-2-sulfonamide; M2, N-acetyl-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-il]-furan-2-sulfonamide; M, mean; SD, standard deviation; RSD, relative standard deviation; SEM, standard error of the mean.
C , maximum analyte concentration in blood, T time to maximum analyte concentration in blood; AUC„, area under the pharmacokinetic
max ' ' max, ' ' 0-t, r
curve from the time of administration to the last blood sampling; AUCg_m, area under the pharmacokinetic curve from the time of administration to infinity; K,, elimination rate constant; Т1 half-life period of the analyte; MRT, mean residence time of the analyte in rat blood.
16000
innn
24
s?-20 M * £?16
I c
CD ^ 12
I- й X С
8
x с
13 Л
M2
• Ol A IP
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Время, ч Time, h
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Время, ч Time, h
0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Время, ч Time, h
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 3. Фармакокинетические кривые 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфаниламида и его метаболитов в
крови крысы (M±SD). Красный интервал SD-IP, черный интервал SD-OI
TFISA - 5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; Ml - N-гидрокси-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фу-ран-2-сульфонамид; М2 - N-ацетил-5-[5-(трифторметил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфонамид; OI - инстилляция в глаз; IP -внутрибрюшинное введение; M - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение.
Fig. 3. Pharmacokinetic curves for 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfanilamide and its metabolites in rat blood (M±SD). The red SD interval is for the intraperitoneal injection (IP), and the black SD interval is for the ocular instillation (OI) TFISA, 5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-yl]-furan-2-sulfonamide; Ml, N-hydroxy-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-il]-furan-2-sul-fonamide; M2, N-acetyl-5-[5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole-3-il]-furan-2-sulfonamide; M, mean; SD, standard deviation.
Показано, что валидированная методика применима для анализа целевых аналитов в крови как крыс, так и кроликов (установлено сходство ряда валидационных параметров (селективность, эффект матрицы, коэффициенты уравнений регрессии). В дальнейшем
с ее применением планируется осуществить изучение фармакокинетики 5-[5-(трифторме-тил)-1,2-оксазол-3-ил]-фуран-2-сульфаниламида на кроликах для проверки влияния межвидовых различий в строении глаза на биодоступность данного ЛС.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Popovic MM, Schlenker MB, Thiruchelvam D, Redelmeier DA. Serious adverse events of oral and topical carbonic anhy-drase inhibitors. JAMA Ophthalmol. 2022;140(3):235-42. https://doi.org/10.1001/jamaophthalmol.2021.5977
2. Курышева НИ. Ингибиторы карбоангидразы в лечении глаукомы. Обзор. Часть 2. Офтальмология. 2020;17(4): 676-82.
Kurysheva NI. Carbonic anhydrase inhibitors in the treat-
ment of glaucoma. Review. Part II. Ophthalmology in Russia. 2020;17(4):676-82 (In Russ.).
https://doi.org/10.18008/1816-5095-2020-4-676-682 Хохлов АЛ, Шетнев АА, Корсаков МК, Федоров ВН, Тю-шина АН, Вольхин НН, Вдовиченко ВП. Фармакологические свойства производных сульфонамидов - новых ингибиторов карбоангидразы. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2023;175(2):166-70.
3.
Khokhlov AL, Shetnev AA, Korsakov MK, Fedorov VN, Tyu-shina AN, Volkhin NN, Vdovichenko VP. Pharmacological properties of sulfonamide derivatives - new inhibitors of carbonic anhydrase. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2023;175(2):166-70 (In Russ.). https://doi.org/10.47056/0365-9615-2023-175-2-166-170
4. Madrewar AB, Deshpande AS, Bhattacharya S. Mini-review on bioanalytical estimation of brinzolamide. Curr Pharm Anal. 2022;18(3):265-72.
https://doi.org/10.2174/1573412917666210812103414
5. Lo Faro AF, Tini A, Gottardi M, Pirani F, Sirignano A, Gior-getti R, et al. Development and validation of a fast ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determining carbonic an-hydrase inhibitors and their metabolites in urine and hair. Drug Test Anal. 2021;13(8):1552-60. https://doi.org/10.1002/dta.3055
6. Khokhlov AL, Yaichkov II, Korsakov MK, Shetnev AA, Volkhin NN, Petukhov SS. Development of quantification methods of a new selective carbonic anhydrase II inhibitor in plasma and blood and study of the pharmacokinetics of its ophthalmic suspension in rats. Res Results Pharmacol. 2023;9(4):53-64. https://doi.org /10.18413/rrpharmacology.9.10056
7. Yuan Y-S, Liao J-M, Kang C-M, Li B-L, Lei X-R, Yu K-W, et al. A simple and accurate LC-MS/MS method for monitoring cyclosporin A that is suitable for high throughput analysis. Exp TherMed. 2023;26(1):342. https://doi.org/10.3892/etm.2023.12041
8. Yu K-W, Li B-L, Yuan Y-S, Liao J-M, Li W-K, Dong H, Ke P-F, et al. A modified LC-MS/MS method for the detection of whole blood tacrolimus and its clinical value in Chinese kidney transplant patients. Heliyon. 2022;8(8):e10214. https://doi.org /10.1016/j.heliyon.2022.e10214
9. Verheijen RB, Thijssen B, Atrafi F, Schellens JHM, Rosing H,
de Vries N, et al. Validation and clinical application of an LC-MS/MS method for the quantification of everolimus using volumetric absorptive microsampling. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2019;1104:234-9. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.11.030
10. Rajput AP, Edlabadkar AP. A coherent analytical review of indapamide. J Pharm Tech Res Manag. 2022;10(1):21-35. https://doi.org/10.15415/jptrm.2022.101004
11. Gopinath R, Narenderan St, Kumar M. A sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for quantitative bioanalysis of fingolimod in human blood: application to pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr. 2022;34(6):e4822. https://doi.org/10.1002/bmc.4822
12. Raghuvanshi DS, Verma N. An iodine-mediated new avenue to sulfonylation employing N-hydroxy aryl sulfonamide as a sulfonylating agent. Org Biomol Chem. 2021;19:4760-7. https://doi.org/10.1039/d1ob00036e
13. Аладышева ЖИ, Беляев ВВ, Береговых ВВ, Бркич ГЭ, Грейбо СВ, Демина НБ и др. Промышленная фармация. Путь создания продукта. М.: Российская академия наук; 2019. Aladysheva ZhI, Belyaev VV, Beregovykh VV, Brkich GE, Greibo SV, Demina NB, et al. Industrial pharmacy: the way to create a product. Moscow: Russian Academy of Sciences; 2019 (In Russ.).
EDN: KWJJUK
14. Гайдай ЕА, Гайдай ДС. Генетическое разнообразие экспериментальных мышей и крыс: история возникновения, способы получения и контроля. Лабораторные животные для научных исследований. 2019;(4).
Gajdaj ЕА, Gajdaj DS. Genetic variety of laboratory mice and rats: history of occurrence, methods of obtaining and control. Laboratory Animals for Science. 2019;(4) (In Russ.). https://doi.org/10.29296/2618723X-2019-04-09
Соответствие принципам этики. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ЯГПУ им. К.Д. Ушинского (протокол № 2 от 10.10.2023).
Дополнительная информация. На сайте журнала «Ре-гуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств» размещены: таблица 6, рисунок 1, рисунок 2. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-table6 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-fig1 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-fig2 Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: И.И. Яичков - разработка и валидация биоаналитической методики, анализ образцов биоматериала животных, написание текста рукописи; А.Л. Хохлов -критическое обсуждение и окончательное утверждение текста рукописи; М.К. Корсаков, А.А. Шет-нев - критическое обсуждение и редактирование текста рукописи; Н.Н. Вольхин, С.С. Петухов - выполнение работ с лабораторными животными.
Ethics approval. The study was approved by the Ethics Committee at the Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky (Approval No. 2 of 10.10.2023).
Additional information. The following additional materials are posted on the website of Regulatory Research and Medicine Evaluation: Table 6, Figure 1, and Figure 2. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-table6 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-fig1 https://doi.org/10.30895/1991-2919-2024-14-3-304-316-fig2 Authors' contributions. All the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. Ilya I. Yaichkov developed and validated the bioanalytical procedure, analysed samples of animal biological material, and drafted the manuscript. Alexander L. Khokhlov participated in the critical discussion of the manuscript and approved the final version for publication. Mikhail K. Korsakov and Anton A. Shetnev participated in the critical discussion and editing of the manuscript. Nikita N. Volkhin and Sergey S. Petukhov handled laboratory animals.
ОБ АВТОРАХ/AUTHORS
Яичков Илья Игоревич, канд. фарм. наук / Ilya I. Yaichkov, Cand. Sci. (Pharm.) ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0066-7388
Хохлов Александр Леонидович, академик РАН, д-р мед. наук, профессор / Alexander L. Khokhlov, Academician of the Russian Academy of Sciences, Dr. Sci. (Med.), Professor ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0032-0341
Корсаков Михаил Константинович, д-р хим. наук, доцент / Mikhail K. Korsakov, Dr. Sci. (Chem.), Associate Professor ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0913-2571
Шетнев Антон Андреевич, канд. хим. наук / Anton A. Shetnev, Cand. Sci. (Chem.)
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4389-461X
Вольхин Никита Николаевич / Nikita N. Volkhin
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4275-9037
Петухов Сергей Станиславович / Sergey S. Petukhov
ORCID: https://orcid.org/0009-0007-8435-7689
Поступила 01.04.2024 Received 1 April 2024
После доработки 23.04.2024 Revised 23 April 2024
Принята к публикации 18.06.2024 Accepted 18 June 2024
