CC BY
8ФАРМАКОЛОГИЯ, КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК 615.322:615.012:547.7 DOI: https://doi.Org/10.52540/2074-9457.2022.4.83
О. Г. Сечко
ПОДОСТРАЯ ТОКСИЧНОСТЬ 3-[4-(2-ФТОРБЕНЗОИЛ)ПИПЕРАЗИН-1-КАРБОНИЛ]-Щ3-(ТРИФТОРМЕТИЛ)ФЕНИЛ]БЕГОАМИДА
Белорусский государственный медицинский университет, г. Минск, Республика Беларусь
Представлены результаты токсикологического исследования безопасности противотуберкулезного соединения - производного бензамида - 3-[4-(2-фторбензоил) пиперазин-1-карбонил]-^[3-(трифторметил)фенил]бензамида. Установлено отсутствие статистически значимых изменений в состоянии животных на протяжении 28 дней эксперимента при введении исследуемого соединения в дозах 10 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг внутрижелудочно. Проведен анализ изменений в массе тела, массовых коэффициентах внутренних органов крыс, патологических изменений и нарушений в структурной организации внутренних органов. Исследованы биохимические показатели сыворотки крови, гематологические показатели крови, лабораторные показатели функции почек и суточные метаболические показатели. Массовые коэффициенты органов крыс находились в пределах нормальных значений. Патологических изменений внутренних органов ни в одной из групп не выявлено. Установлено, что прием производного бензамида влияет на некоторые биохимические показатели (общий белок, АЛТ, билирубин, глюкоза и мочевина), на некоторые гематологические показатели (содержание эритроцитов, гемоглобин, гематокрит, содержание тромбоцитов, тромбокрит, средняя концентрация гемоглобина в эритроците и коэффициент больших тромбоцитов) и способствует появлению глюкозы в моче у самок, принимавших дозу 100 мг/кг, у самцов глюкоза не была обнаружена. Исследование суточных метаболических показателей не выявило никаких статистически значимых отклонений по сравнению с контрольной группой. Таким образом, соединение 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]^-[3-(трифторметил) фенил]бензамид не вызывает гибель животных и обнаруживаемых токсических эффектов и поэтому является перспективным для проведения дальнейших доклинических исследований.
Ключевые слова: 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]^-[3-(трифтор-метил)фенил]бензамид, производное бензамида, подострая токсичность, крысы.
ВВЕДЕНИЕ
Множественная лекарственная устойчивость и широкая лекарственная устойчивость возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis H37Rv к противотуберкулезным препаратам с каждым годом возрастает и является основной проблемой в борьбе с туберкулезом [1, 2]. В этой связи актуальным является поиск новых противотуберкулезных соединений, специфичных к новой биомишени и активных как в отношении лекарственно-чувствительных штаммов Mycobacterium
tuberculosis, так и в отношении штаммов с лекарственной устойчивостью.
Перспективным в эксперименте противотуберкулезным соединением является производное бензамида - 3-[4-(2-фтор-бензоил)пиперазин-1-карбонил]-К-[3-(трифторметил)фенил]бензамид [3]. В предыдущих исследованиях нами установлено, что производное бензамида in vitro полностью подавляет рост лабораторного референс-штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv и клинического штамма Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в кон-
центрации 100 мкг/мл. В эксперименте по оценке острой токсичности определено, что производное бензамида является практически нетоксичным соединением [4].
Исследования подострой токсичности являются неотъемлемой частью доклинических исследований и позволяют оценить повреждающее действие исследуемого соединения при его многократном повторном введении, выявить токсические эффекты и определить наиболее чувствительные к действию исследуемого препарата органы и системы организма, так называемые мишени токсических воздействий.
Цель настоящей работы - исследовать подострую токсичность 3-[4-(2-фтор-бензоил)пиперазин-1-карбонил]-К-[3-(трифторметил)фенил]бензамида.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследуемое соединение - 3-[4-(2-фтор-бензоил)пиперазин-1-карбонил]-К-[3-(трифторметил)фенил]бензамид - синтезировано в Государственном научном учреждении «Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси». При работе с животными придерживались
Для идентификации животных каждой особи была присвоена определенная метка пикриновой кислотой. Перед введением необходимой дозировки животных взвешивали и на основании данных массы тела высчитывали точный объем суспензии, который необходимо ввести. Суспензию опытные животные принимали в утреннее время (в 7:30) за 3 часа до приема пищи. Воды животных не лишали. Исследуемое соединение вводили однократно внутри-желудочно в виде суспензии в следующих дозах - 10 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг живой массы с помощью иглы с булавовидным утолщением. Вследствие плохой растворимости в воде производное бензамида исследовали в виде суспензии. Суспензию
принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986) и Директивы 2010/63/Еи Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года о защите животных, используемых в научных целях. Исследование выполняли согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005), по ГОСТ 33215-2014 [5-8].
Токсикометрию осуществляли с учетом половозрастных особенностей животных - на 40 клинически здоровых крысах обоего пола массой 190-210 г линии Wistar с хорошими показателями экстерьера. Грызуны содержались в стандартных условиях вивария при температуре 18-22 °С, влажности воздуха 40-45% и принимали стандартный сбалансированный пищевой рацион. В исследование включали животных, которые прошли карантин на протяжении 14 дней. Для оценки подострой токсичности были сформированы 3 опытные группы и контрольная группа крыс (п = 10) согласно схеме, указанной в таблице 1.
готовили следующим образом: отвешивали рассчитанное количество производного бензамида и добавляли его в 1/2 части отмеренного объема воды очищенной, полученную суспензию диспергировали и гомогенизировали с помощью лабораторного диспергатора T18 digital ULTRA-TURRAX® (IKA, Германия) сначала со скоростью 8 000 об/мин на протяжении одной минуты, затем со скоростью 16 000 об/мин на протяжении 3 минут. Оставшимся объемом воды очищенной (1/2 часть) смывали остатки производного бензамида с диспергирующей насадки гомогенизатора для избежания потерь, получая однородную суспензию высокой дисперсности. Объем вводимой внутрижелудочной водной
Таблица 1. - Схема внутрижелудочного введения 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-Ы-[3-(трифторметил)фенил]беюамида крысам
№ группы Доза 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-М-[3-(трифторметил) фенил]бензамида, мг/кг
1 10
2 50
3 100
4 (контроль) Равный объем воды очищенной
суспензии рассчитывали исходя из максимально допустимых объемов введения жидкостей для лабораторных животных, в зависимости от массы тела и пути введения [9]. Объем вводимой внутрижелудоч-ной водной суспензии не превышал 5,0 мл
на 200,0 г массы тела.
Экспериментальная программа
исследования подострой токсичности 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-№-[3-(трифторметил)фенил] бензамида представлена в таблице 2.
Таблица 2. - Экспериментальная программа исследования подострой токсичности 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-М-[3-(трифторметил)фенил]бензамида при ежедневном 28-дневном внутрижелудочном введении
Показатель Сутки
Регистрация состояния животных ежедневно
Взвешивание До начала эксперимента, 8-е, 15-е, 22-е и 29-е* сутки
Метаболические исследования 27-е сутки
Анализ мочи 28-е сутки
Гематологические исследования 29-е сутки
Биохимические исследования 29-е сутки
Макроскопические исследования 29-е сутки
Примечание: *На 29-е сутки осуществляли вывод животных из эксперимента.
Самок содержали отдельно от самцов. Осмотр животных проводили 2 раза в сутки. Для оценки картины интоксикации с регулярной периодичностью фиксировали общее состояние животных, поведенческие реакции, положение тела в пространстве, двигательную активность, нервно-мышечное возбуждение, состояние кожи и шерсти, цвет видимых слизистых оболочек, размер зрачка, аппетит, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания, цвет мочи, потребление корма, потребление воды, реакции на раздражители (тактильные, болевые, звуковые и световые), время возникновения и характер интоксикации, ее тяжесть и обратимость. Кроме того, оценивали динамику массы тела. По истечении 28 дней животных подвергли эвтаназии, провели некропсию, после чего осуществляли визуальный осмотр, макроскопический анализ внутренних органов и определяли массу следующих органов: сердце, печень, легкие, селезенка, почки и мозг. Органы взвешивали влажными, сразу же после не-кропсии, чтобы избежать их высыхания, парные органы (почки) взвешивали вместе. Анализ массовых коэффициентов при токсикологических исследованиях дает возможность обнаружить орган-мишень токсиканта, поэтому проводили сравнение показателей массы тела и массовых коэффициентов внутренних органов опытных групп с контрольной группой. Массовый коэффициент (МК) органа рассчитывали
по формуле МК = масса органа (г) / масса тела (г) • 100%.
Для исследования функционального состояния почек крыс помещали на 4-5 часов в индивидуальные клетки, которые предназначены для сбора мочи в стерильную пробирку с градуировкой. Мочу наносили на тест-полоску Uriscan U41 (YD Diagnostics, Южная Корея), тест-полоску помещали в анализатор мочи Uriscan PRO II (YD Diagnostics, Южная Корея) для определения следующих показателей: билирубин, уробилиноген, кетоновые тела, белок, нитриты, глюкоза, лейкоциты, концентрация аскорбиновой кислоты, pH, относительная плотность мочи (удельный вес мочи) и цвет мочи.
Для проведения гематологических и биохимических исследований у животных каждой группы осуществляли забор крови в пробирки с антикоагулянтом К2 ЭДТА. Общий анализ крови осуществляли с помощью автоматического лазерного дифференциального гематологического анализатора Norma iVet 5 и оригинальных расходных материалов (Norma Instruments Zrt., Венгрия). В цельной крови с антикоагулянтом были рассчитаны следующие показатели: абсолютное количество лейкоцитов (WBC), абсолютное количество лимфоцитов (LYM), абсолютное количество моноцитов (MON), абсолютное количество нейтрофилов (NEU), абсолютное количество эозинофилов (EOS), абсолютное количество базофилов (BAS), относитель-
ное количество лимфоцитов, % (LYM, %), относительное количество моноцитов, % (MON, %), относительное количество нейтрофилов, % (NEU, %), относительное количество эозинофилов, % (EOS, %), относительное количество базофилов, % (BAS, %), эритроциты (RBC), гемоглобин (HGB), средний корпускулярный объем эритроцита (MCV), гематокрит (HCT), среднее содержание гемоглобина в эритроците (цветной показатель крови) (MCH), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC), ширина распределения эритроцитов по объему, фл (RDWsd), ширина распределения эритроцитов, % (RDWcv), абсолютное количество тромбоцитов (PLT), средний объем тромбоцитов (MPV), тромбокрит (PCT), ширина распределения тромбоцитов по объёму, % (PDWcv), ширина распределения тромбоцитов по объёму, фл (PDWsd), коэффициент больших тромбоцитов (PLC-R), фракция больших тромбоцитов (PLC-C).
В сыворотке крови животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rаndom Access A-25 (BioSystems, Испания) рассчитаны следующие показатели: ала-нинаминотрансфераза (АЛТ), аспартата-минотрансфераза (АСТ), билирубин, холестерин, креатинин, глюкоза, общий белок и мочевина. Концентрации всех аналитов определяли с помощью биохимического набора реагентов BioSystems (Испания).
Сыворотку крови получали по общепринятой методике. Все этапы отбора биологического материала и пробоподготовки выполняли с соблюдением стандартных операционных процедур.
Для проведения метаболического исследования животных помещали по одному в метаболические клетки (Ugo Basile S.R.L., Model 417ОО-О43, Comerio VA, Италия) для мониторирования аппетита, жажды, суточного диуреза и суточной дефекации. По истечении 24 часов фиксировали следующие показатели: масса потребленного корма, объем выпитой воды, объем мочи и масса фекалий. Результаты, полученные в опытных группах, сравнивали с результатами, полученными в контрольной группе.
Статистический анализ полученных экспериментальных данных и построение диаграмм размаха проводили с использованием компьютерной программы «Statistica 1О.О» («StatSoft, Inc.», США). Для опи-
сания количественного признака в совокупности указаны среднее (М) ± ошибка среднего (т). Для проверки нормальности распределения количественных данных использовали критерии Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса. Для сравнения массы тела животных до начала и по окончании проведения эксперимента использовали непараметрический критерий Уилкоксона. Для сравнения количественных данных животных опытной группы с количественными данными животных контрольной группы использовали непараметрический ранговый и-критерий Манна-Уитни. Данные о массе внутренних органов анализировали с использованием непараметрического Н-критерия Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически значимыми с вероятностью не менее 95% (р < 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ежедневное однократное введение 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-К-[3-(трифторметил)фенил] бензамида в дозах 10 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг на протяжении 28 дней не вызывало гибели животных. Во всех группах животные были клинически здоровы. Признаки токсического действия производного бен-замида отсутствовали. Клиническое состояние крыс опытных групп не отличалось от состояния крыс контрольной группы: все животные реагировали на раздражители извне (тактильные, болевые, звуковые и световые), охотно поедали корм, кал был всегда сформированный, кожный покров целостный, без видимых повреждений, покраснения, алопеция и раздражения отсутствовали, тургор кожи был в норме. Конъюнктива, слизистая оболочка носовой и ротовой полости, половых органов и анального отверстия не имели видимых повреждений. Отклонений в работе дыхательной системы обнаружено не было.
Динамика массы тела крыс опытных групп и контрольной группы представлена на рисунке 1.
Установлено статистически значимое увеличение массы тела крыс обоего пола на протяжении эксперимента во всех опытных группах и в контрольной группе (критерий Уилкоксона, р = 0,043). Масса тела крыс на протяжении эксперимента увеличилась следующим образом: у крыс группы № 1 (доза
Рисунок 1. - Динамика массы тела крыс опытных групп и контрольной группы
10 мг/кг) в среднем на 41,6 ± 0,8 г; у крыс группы № 2 (доза 50 мг/кг) в среднем на 45,8 ± 0,7 г; у крыс группы № 3 (доза 100 мг/кг) в среднем на 43,7 ± 0,6 г; у крыс группы № 4 (контрольная) в среднем на 44,3 ± 0,2 г.
В опытных группах № 1 и № 2 на 8-ой, 15-ый, 22-ой и 29-ый день эксперимента наблюдалось статистически незначимое увеличение массы тела по сравнению с контрольной группой (таблица 3) (р > 0,05). В опытной группе № 3 на 8-ой, 15-ый, 22-ой и 29-ый день эксперимента наблюдалось статистически значимое увеличение массы тела по сравнению с контрольной группой (таблица 3) (р < 0,05), однако масса всех животных находилась в пределах физиологической нормы.
В ходе макроскопического исследования внутренних органов животных всех групп
не обнаружено проявлений воспалительных патологических процессов (таблица 4).
Результаты расчета массовых коэффициентов стресс-компетентных органов представлены в таблице 5. Статистически значимые отличия (р < 0,05) у крыс всех опытных групп по сравнению с контрольной группой выявлены в массе сердца, печени, селезенки, почек и мозга, при этом все величины во всех опытных группах находятся в пределах нормы. В массе легких у крыс всех групп отличия были статистически незначимы (р > 0,05).
Биохимические показатели крови. Исследование биохимических показателей сыворотки крови показало, что прием производного бензамида во всех исследуемых дозах сопровождается статистически значимым (р < 0,05) увеличением содержания
Таблица 3. - Уровень статистической значимости (р) сравнения массы тела крыс опытных групп с массой тела крыс контрольной группы (непараметрический
и-критерий Манна-Уитни)
День эксперимента Уровень статистической значимости (р)
Группа № 1 Группа № 2 Группа № 3
8-й 0,4274 0,7055 0,0233
15-й 0,7624 0,6232 0,0140
22-й 0,1736 0,6232 0,0102
29-й 0,0757 0,5454 0,0284
Таблица 5. - Массовые коэффициенты внутренних органов крыс опытных групп
и контрольной группы
Таблица 4. - Результаты макроскопического исследования внутренних органов крыс
Сердце У всех животных не было увеличено в размере, имело овоидную форму, гладкую и блестящую поверхность, темно-вишневый цвет, эпикард гладкий и блестящий, висцеральная пластинка (серозный перикард) ярко-розового цвета, гладкая.
Легкие Не были увеличены в размере, розового цвета, с гладкой поверхностью, без кровоизлияний, без пятен и вкраплений, легочная плевра (серозная оболочка) розового цвета, гладкая, без видимых пятен и изменений.
Печень Не была увеличена в размере, округлая, с неправильными очертаниями, красно-коричневого цвета, капсула гладкая, без пятен и вкраплений.
Селезенка Не была увеличена в размере, имела вытянутую форму, слегка уплощенная, края слегка заострены, темно-вишневого цвета. Капсула селезенки гладкая, бело-серого цвета, достаточно плотная, покрыта серозной оболочкой, которая является гладкой.
Почки Не были увеличены в размере, бобовидной формы, темно-вишневого цвета, покрыты гладкой фиброзной капсулой, которая достаточно легко снимается. На поперечном и продольном разрезе почки хорошо различимы корковое вещество - светлая зона, находится на периферии, и мозговое вещество - более темная зона, находится в центре. Слизистая лоханки светло-розового цвета, гладкая и блестящая.
Желудок Имел форму крючка, дно желудка - крупное и широкое, пилорическая часть - более узкая. В кардиальной части желудка слизистая оболочка более прозрачная, имеет бледно-белесоватый цвет, в пилорической части - слизистая оболочка не прозрачная, красновато-серая, васкуляризованная. Кардиальное отверстие находилось по середине малой кривизны желудка, складчатый край извилистый. Серозная оболочка желудка гладкая и слегка серого цвета. Слизистая оболочка желудка гладкая и блестящая.
Орган Массовый коэффициент %, М ± т Н-критерий Краскела-Уоллиса
Группа 1 (10 мг/кг) Группа 2 (50 мг/кг) Группа 3 (100 мг/кг) Группа 4 (контроль)
Сердце 0,342 ± 0,003 0,355 ± 0,007 0,399 ± 0,011 0,384 ± 0,016 Н = 15,596; df = 3, р = 0,001
Печень 4,054 ± 0,032 4,336 ± 0,039 4,157 ± 0,035 4,154 ± 0,046 Н = 16,412; df = 3, р = 0,001
Легкие 0,762 ± 0,013 0,796 ± 0,014 0,794 ± 0,010 0,784 ± 0,009 Н = 5,615; df = 3, р = 0,132
Селезенка 0,556 ± 0,032 0,742 ± 0,013 0,717 ± 0,015 0,756 ± 0,015 Н = 16,655; df = 3, р = 0,001
Почки 0,747 ± 0,011 0,764 ± 0,009 0,758 ± 0,013 0,797 ± 0,013 Н = 7,898; df = 3, р = 0,048
Мозг 0,754 ± 0,015 0,810 ± 0,018 0,828 ± 0,016 0,808 ± 0,013 Н = 9,954; df = 3, р = 0,019
общего белка по сравнению с контрольной группой. При приеме производного бенза-мида в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг наблюдали статистически значимое (р < 0,05) снижение содержания АЛТ и увеличение содержания билирубина по сравнению с контрольной группой. При приеме производного бензамида в дозе 100 мг/кг наблюдали статистически значимое (р < 0,05) увеличение содержания глюкозы и снижение содержания мочевины по сравнению с контрольной группой. По другим изученным биохимическим показателям статистически значимых изменений выявлено не было (таблица 6).
Гематологические показатели крови. Исследование гематологических показателей крови крыс показало, что прием производного бензамида во всех исследуемых дозах сопровождается статистически значимым (р < 0,05) увеличением содержания эритроцитов, гемоглобина и увеличением показателя «гематокрит» в опытных группах по сравнению с контрольной группой. При приеме производного бензамида в дозе 10 мг/кг наблюдали статистически значимое (р < 0,05) увеличение содержания тромбоцитов и показателя «тромбо-крит». При приеме производного бензами-да в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг наблюдали
статистически значимое (р < 0,05) снижение средней концентрации гемоглобина в эритроците. При приеме производного бензамида в дозе 50 мг/кг наблюдали статистически значимое (р < 0,05) увеличение коэффициента больших тромбоцитов, при
приеме в дозе 100 мг/кг - статистически значимое (р < 0,05) уменьшение коэффициента больших тромбоцитов. По другим изученным гематологическим показателям крови статистически значимых изменений выявлено не было (таблица 7).
Таблица 6. - Биохимические показатели сыворотки крови у крыс опытных групп
и контрольной группы (М ± т)
Показатели, единицы измерения Группа 1 (10 мг/кг) Группа 2 (50 мг/кг) Группа 3 (100 мг/кг) Группа 4 (контроль)
АЛТ, ед/л 73,4000 ± 6,1918 45,7000 ± 2,0873 46,2000 ± 3,3987 85,3000 ± 5,6824
АСТ, ед/л 159,6000 ± 8,6077 150,0000 ± 13,4965 124,2000 ± 6,3889 148,3000 ± 8,9257
Билирубин, мг/дл 1,9600 ± 0,3452 2,1100 ± 0,1748 2,2900 ± 0,2321 1,3800 ± 0,2175
Холестерол, мг/дл 2,0000 ± 0,1491 2,2000 ± 0,2000 2,4000 ± 0,1633 2,5000 ± 0,1667
Креатинин, мг/дл 90,0090 ± 3,2334 101,5240 ± 3,6441 87,5020 ± 3,1471 126,5390 ± 39,3037
Глюкоза, мг/дл 12,1000 ± 1,7854 10,3000 ± 0,8307 10,6000 ± 0,4761 9,1000 ± 0,3786
Белок общий, г/л 75,4000 ± 2,6424 69,0000 ± 1,4220 68,5000 ± 1,0980 63,1000 ± 0,9000
Мочевина, мг/дл 17,8000 ± 0,6110 17,2000 ± 1,6111 12,5000 ± 1,1212 18,7000 ± 1,8682
Непараметрический U-критерий Манна-Уитни, р
АЛТ, ед/л 0,1405 0,0003 0,0006
АСТ, ед/л 0,2730 0,4963 0,0757
Билирубин, мг/дл 0,1509 0,0257 0,0140
Холестерол, мг/дл 0,0963 0,3643 0,7337
Креатинин, мг/дл 0,9097 0,0756 0,5708
Глюкоза, мг/дл 0,2413 0,2413 0,0343
Белок общий, г/л 0,0004 0,0058 0,0052
Мочевина, мг/дл 0,0757 0,2730 0,0263
Показатели, единицы измерения Группа 1 (10 мг/кг) Группа 2 (50 мг/кг) Группа 3 (100 мг/кг) Группа 4 (контроль)
Лейкоциты (WBC), 109/л (клеток/л) 8,6600 ± 0,9046 10,7700 ± 1,5426 8,5444 ± 0,7820 8,2700 ± 1,0621
Лимфоциты (LYM), 109/л (клеток/л) 7,2900 ± 0,7024 9,1700 ± 1,6711 7,4444 ± 0,7706 7,0100 ± 1,0081
Моноциты (MON), 109/л (клеток/л) 0,0800 ± 0,0389 0,1500 ± 0,0860 0,0444 ± 0,0321 0,0800 ± 0,0389
Нейтрофилы (NEU), 109/л (клеток/л) 1,1900 ± 0,2896 1,3400 ± 0,3337 0,9889 ± 0,3318 1,1000 ± 0,1719
Эозинофилы (EOS), 109/л (клеток/л) 0,0600 ± 0,0163 0,0700 ± 0,0153 0,0778 ± 0,0211 0,0700 ± 0,0213
Базофилы (BAS), 109/л (клеток/л) 0,0000 ± 0,0000 0,0100 ± 0,0100 0,0100 ± 0,0100 0,0000 ± 0,0000
Лимфоциты (LYM), % 84,7600 ± 2,2810 81,8700 ± 6,0555 87,0667 ± 3,7405 82,5000 ± 3,3374
Моноциты (MON), % 0,9000 ± 0,2206 1,8700 ± 1,1612 0,5667 ± 0,2650 0,8900 ± 0,3171
Нейтрофилы (NEU), % 13,2800 ± 1,9343 15,3900 ± 4,9526 11,3222 ± 3,3650 15,6400± 3,2748
Эозинофилы (EOS), % 1,0500 ± 0,2051 0,8000 ± 0,1713 1,0111 ± 0,1965 0,9500 ± 0,1493
Базофилы (BAS), % 0,0100 ± 0,0100 0,0700 ± 0,0700 0,0333 ± 0,0316 0,0200 ± 0,0133
Таблица 7. - Гематологические показатели крови у крыс опытных и контрольной групп (М ± т)
Продолжение таблицы 7.
Эритроциты (RBC), 1012/л (клеток/л) 7,5750 ± 0,3587 7,8550 ± 0,2963 7,5500 ± 0,1944 6,5240 ± 0,1871
Гемоглобин (HGB), г/л 125,0000 ± 5,6016 127,9000 ± 4,4733 123,1111 ± 2,7361 109,5000 ± 2,6677
Средний объем эритроцита (MCV), фл 52,0000 ± 0,6992 51,4000 ± 1,2220 50,6000 ± 0,8718 51,7000 ± 0,5588
Гематокрит (HCT), % 39,5000 ± 2,1409 40,4000 ± 1,7397 38,3000 ± 1,0116 33,5000 ± 1,0028
Среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH), пг 16,5300 ± 0,2186 16,3300 ± 0,2543 16,3667 ± 0,2074 16,8100 ± 0,1741
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC), г/л 318,0000 ± 3,8759 317,6000 ± 3,0375 319,6667 ± 1,9685 326,4000 ± 1,6680
Ширина распределения эритроцитов по объему (RDWsd), фл 25,6500 ± 1,1404 26,0100 ± 0,7281 23,9420 ± 0,5873 25,9200 ± 1,4685
Ширина распределения эритроцитов по объему (RDWcv), % 17,9700 ± 0,8094 18,3900 ± 0,3805 17,2600 ± 0,6258 18,2900 ± 1,0380
Тромбоциты (PLT), 109/л (клеток/л) 391,7000 ± 26,5849 404,6000 ± 49,8570 376,2000 ± 62,0279 286,3000 ± 50,8263
Средний объем тромбоцита (MPV), фл 5,8500 ± 0,0992 5,8500 ± 0,0749 5,7700 ± 0,1407 5,8700± 0,1055
Тромбокрит (PCT), % 0,2330 ± 0,0189 0,2370 ± 0,0291 0,2170 ± 0,0385 0,1700 ± 0,0304
Ширина распределения тромбоцитов по объему (PDWcv), % 40,5500 ± 1,1230 40,4200 ± 1,1315 40,1100 ± 1,6543 41,9400 ± 1,0588
Ширина распределения тромбоцитов по объему (PDWsd), фл 6,3400 ± 0,2583 6,3100 ± 0,2369 6,2300 ± 0,3969 6,5800 ± 0,2323
Коэффициент больших тромбоцитов (PLC-R), % 8,7000 ± 0,3958 29,9000 ± 4,8430 8,4000 ± 0,5617 9,8000 ± 0,5121
Фракция больших тромбоцитов (PLC-C), 109/л (клеток/л) 34,6000 ± 3,7094 35,9000 ± 4,0344 29,9000 ± 4,8430 27,7000 ± 4,7283
Непараметрический U-критерий Манна-Уитни, р
WBC 0,9397 0,3258 0,9025
LYM 0,8798 0,4497 0,8703
MON 1,0000 0,6232 0,3691
NEU 0,9699 0,5967 0,3477
EOS 0,8501 0,9397 0,8383
BAS 1,0000 0,7337 1,0000
LYM% 0,8501 0,3847 0,1530
MON% 0,5454 0,4274 0,1416
NEU% 0,8798 0,4727 0,1779
EOS% 0,8798 0,4727 0,9674
BAS% 0,7337 0,7913 0,8383
RBC 0,0312 0,0017 0,0025
HGB 0,0233 0,0022 0,0055
MCV 0,8798 0,5454 0,3847
HCT 0,0156 0,0036 0,0065
MCH 0,3075 0,1736 0,1416
MCHC 0,1212 0,0126 0,0247
RDWsd 0,8501 0,7337 0,5205
RDWcv 0,7913 0,7055 0,5708
PLT 0,0140 0,0640 0,1988
MPV 0,7055 0,7624 0,4057
PCT 0,0257 0,0696 0,3075
PDWcv 0,4274 0,3075 0,0640
PDWsd 0,3643 0,2568 0,1306
PLC-R 0,1212 0,0007 0,0494
PLC-C 0,1041 0,1041 0,5708
Функциональное состояние почек.
Исследование лабораторных показателей функции почек показало, что у 4 самок при приеме производного бензамида в дозе 100 мг/кг была обнаружена глюкоза, а у самцов глюкозы обнаружено не было. Цвет мочи укладывался в физиологические нормы у животных всех групп. По другим изученным показателям статистически значимых изменений выявлено
не было (таблица 8).
Метаболические показатели. Исследование суточных метаболических показателей показало, что прием производного бензамида во всех исследуемых дозах не вызывает статистически значимых изменений в количестве потребляемого корма, выпитой воды, в объеме мочи и в массе фекалий по сравнению с контрольной группой (таблица 9).
Таблица 8. - Показатели мочи у крыс опытных и контрольной групп (М ± т)
Показатели, единицы измерения Группа 1 (10 мг/кг) Группа 2 (50 мг/кг) Группа 3 (100 мг/кг) Группа 4 (контроль)
Билирубин, мг/100 мл 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000
Уробилиноген, мг/100 мл 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000
Кетоновые тела, мг/100 т1 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000
Белок, мг/100 мл 0,3200 ± 0,1191 0,3900 ± 0,2923 0,3000 ± 0,1183 0,3500 ± 0,1138
Нитриты, мг/100 мл 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000
Глюкоза, мг/100 мл 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 3,9000 ± 1,8270 0,0000 ± 0,0000
рН 5,4000 ± 0,2333 6,7500 ± 0,2267 7,2500 ± 0,2267 6,4000 ± 0,5153
Удельный вес, г/л 1,0130 ± 0,0011 1,0065 ± 0,0011 1,0065 ± 0,0011 1,0110 ± 0,0016
Лейкоциты, в 1 мкл 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000 0,0000 ± 0,0000
Аскорбиновая кислота, мг/100 мл 0,2400 ± 0,0980 0,3400 ± 0,2798 0,0000 ± 0,0000 0,3800 ± 0,1417
Непараметрический и-критерий Манна-Уитни, р
Белок, мг/100 мл 0,7055 0,1736 0,5454
Глюкоза, мг/100 мл 1,0000 1,0000 0,1684
рН 0,1124 0,2730 0,1041
Удельный вес, г/л 0,5205 0,0890 0,0890
Аскорбиновая кислота, мг/100 мл 0,6232 0,3447 0,0640
Показатели, единицы измерения Группа 1 (10 мг/кг) Группа 2 (50 мг/кг) Группа 3 (100 мг/кг) Группа 4 (контроль)
Суточная масса корма, г 26,0000 ± 1,0646 26,4000 ± 0,9214 26,2000 ± 1,2806 26,5000 ± 1,0138
Суточный объем воды, мл 38,5000 ± 1,1279 34,8000 ± 1,1279 38,0000 ± 1,1832 37,5000 ± 0,9916
Суточный объем мочи, мл 20,4000 ± 1,1662 22,8000 ± 1,0414 21,5000 ± 1,2671 21,8000 ± 1,4126
Суточная масса фекалий, г 14,2000 ± 0,4899 13,9000 ± 0,8226 15,2000 ± 0,6633 15,7000± 0,5783
Непараметрический и-критерий Манна-Уитни, р
Суточная масса корма, г 0,8206 0,9699 0,9097
Суточный объем воды, мл 0,5205 0,0890 0,8501
Суточный объем мочи, мл 0,4497 0,5454 0,9097
Суточная масса фекалий, г 0,0696 0,1124 0,6501
Таблица 9. - Метаболические показатели у крыс опытных и контрольной групп (М ± т)
Вестник фармации №4 (98), 2022 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате исследования токсичности 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]^-[3-(трифторметил)фе-нил]бензамида при ежедневном внутри-желудочном введении крысам обоего пола линии Wistar в дозах 10 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг на протяжении 28 дней не выявлено никаких отклонений в состоянии животных на протяжении всего эксперимента и гибели животных не наступало. Максимальная прибавка массы тела была отмечена у группы крыс, принимавших дозу 50 мг/кг, минимальная - у группы крыс, принимавших дозу 10 мг/кг. Массовые коэффициенты внутренних органов крыс, несмотря на наличие статистически значимых отличий в сравнении с контрольной группой, находились в пределах нормальных значений. Патологических изменений и нарушений в структурной организации внутренних органов ни в одной из групп исследуемых животных не выявлено. Исследование биохимических показателей сыворотки крови показало, что прием производного бензамида влияет на следующие показатели: общий белок, АЛТ, билирубин, глюкоза и мочевина. Исследование гематологических показателей крови показало, что прием производного бензамида влияет на следующие показатели: содержание эритроцитов, гемоглобин, гематокрит, содержание тромбоцитов, тромбокрит, средняя концентрация гемоглобина в эритроците и коэффициент больших тромбоцитов. Исследование лабораторных показателей функции почек показало, что прием производного бензамида способствует появлению глюкозы в моче, так как у 4 самок из 5, принимавших вещество в дозе 100 мг/кг, обнаружена глюкоза в моче; у самцов глюкозы обнаружено не было. Исследование суточных метаболических показателей не выявило никаких статистически значимых отклонений по сравнению с контрольной группой. Таким образом, производное бенза-мида 3-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбонил]-№-[3-(трифторметил)фенил] бензамид является перспективным соединением для проведения дальнейших доклинических исследований.
Научные публикации SUMMARY
O. G. Sechko SUBACUTE TOXICITY OF 3-[4-(2-FLUOROBENZOYL)PIPERAZINE-1-CARBONYL)-N-(3-(TRIFLUOROMETHYL)PHENYL]
BENZAMIDE The results of the toxicological study on antituberculous compound safety, a benzamide derivative, 3-[4-(2-fluorobenzoyl) piperazine-1-carbonyl)-N-(3-(trifluoro-methyl)phenyl]benzamide are presented. Absence of statistically significant changes in the condition of animals during the 28-day experiment is established with the introduction of the compound being tested at doses of 10 mg/kg, 50 mg/kg and 100 mg/kg intragastrically. Analysis of changes in body weight, mass coefficients of internal organs in rats, pathological changes and disturbances in the structural organization of internal organs was carried out. Biochemical parameters of blood serum, hematological parameters of blood, laboratory indicators of kidney function and daily metabolic parameters were studied. The mass coefficients of rat organs were within the normal range. No pathological changes in the internal organs were found in any of the groups. It has been established that taking a benzamide derivative effects some biochemical parameters (total protein, ALT, bilirubin, glucose and urea), some hematological parameters (red blood cells count, hemoglobin, hematocrit, platelets count, thrombocrit, mean corpuscular hemoglobin concentration and platelet-large-cell ratio) and contributes to the appearance of glucose in the urine in females taking a dose of 100 mg/kg, in males glucose was not detected. The study of daily metabolic parameters did not reveal any statistically significant deviations compared with the control group. Thus, the compound 3-[4-(2-fluorobenzoyl)piperazine-1-carbonyl)-N-(3-(trifluoromethyl)phenyl] benzamide does not cause the death of animals and detectable toxic effects and therefore is promising for further preclinical studies.
Keywords: 3-[4-(2-fluorobenzoyl)pipe-razine-1-carbonyl]-N-[3-(trifluoromethyl) phenyl]benzamide, benzamide derivative, subacute toxicity, rats.
ЛИТЕРАТУРА
1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant
infections globally: final report and recommendations / J. O'Neill. - London: Review on Antimicrobial Resistance, 2016. - 80 p.
2. Николенко, Н. Ю. Фармакоэпидемио-логия и фармакоэкономика туберкулеза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя / Н. Ю. Николенко, Д. А. Кудлай, Н. П. Докторова // Фармакоэ-кономика. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. - 2021. - Т. 14, № 2. -С.235-248.
3. Сечко, О. Г. Противотуберкулезная активность производных бензамида и бензойной кислоты / О. Г. Сечко, И. Н. Слабко, В. М. Царенков // БГМУ в авангарде медицинской науки и практики: рецензир. ежегод. сб. науч. трудов / редкол.: С. П. Рубникович, В. А. Филонюк. - Минск: Бел. гос. мед. ун-т, 2021. -Вып. 11. - C. 540-546.
4. Сечко, О. Г. Оценка острой токсичности 3-[4-(2-фторбензоил) пиперазин-1-карбонил]-^[3-(трифторметил)-фенил] бензамида / О. Г. Сечко, В. М. Царенков // Вестн. Витебского гос. мед. ун-та. - 2022. - Т. 21, № 4. -С.89-99.
5. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes [Electronic resource] / Council of Europe. - Strasbourg, 1986. - Mode of access: https://rm.coe.int/168007a67b. - Date of access: 14.06.2022.
6. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. - Санкт-Петербург: Объединение специалистов по работе с лабораторными животными, 2012. - 48 с.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / отв. ред. Р. У. Хабриев. -Москва: Медицина, 2005. - 832 с.
8. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур : ГОСТ 33215-2014. - Введ. 01.07.16. - Москва: Стандартинформ, 2019. - 13 с.
9. Существующие требования и подходы к дозированию лекарственных средств лабораторным животным / А. В. Рыбакова [и др.] // Ведомости Науч. центра экспертизы средств мед. применения. - 2018. - Т. 8, № 4 - С. 207-217.
REFERENCES
1. O'Neill J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London, England: Review on Antimicrobial Resistance; 2016. 80 p
2. Nikolenko Nlu, Kudlai DA, Doktorova NP.
Pharmacoepidemiology and pharmacoeconomics ofmultidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis. Farmakoekonomika. Sovremennaia farmakoekonomika i farmakoepidemiologiia. 2021;14(2):235-48. doi: 10.17749/2070-4909/ farmakoekonomika.2021.089. (In Russ.)
3. Sechko OG, Slabko IN, Tsarenkov VM. Antituberculous activity of benzamide and benzoic acid derivatives. V: Rubnikovich SP, Filoniuk VA, redaktsionnaia kollegiia. BGMU v avangarde meditsinskoi nauki i praktiki: retsenzir ezhegod sb nauch trudov. Minsk, RB: Bel gos med un-t; 2021. Vyp. 11. s. 540-6. (In Russ.)
4. Sechko OG, Tsarenkov VM. Assessment of the acute toxicity of 3-[4-(2-fluorobenzoyl) piperazine-1-carbonyl]-N-[3-(trifluoromethyl)-phenyl]benzamide. Vestn Vitebskogo gos med un-ta. 2022;21(4):89-99. doi: 10.22263/23124156.2022.4.89. (In Russ.)
5. Council of Europe. European Convention for the protection of vertebrate animals for experimental and other scientific purposes [Electronic resource]. Strasbourg, France; 1986. Mode of access: https://rm.coe.int/168007a67b. Date of access: 14.06.2022
6. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of the European Union of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Sankt-Peterburg, RF: Ob»edinenie spetsialistov po rabote s laboratornymi zhivotnymi; 2012. 48 s. (In Russ.)
7. Khabriev RU, redaktor. Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. Moskva, RF: Meditsina; 2005. 832 s. (In Russ.)
8. Gosudarstvennye standarty Rossii. GOST 33215-2014. Guidelines for the maintenance and care of laboratory animals. Rules for equipping premises and organizing procedures. Vved 2016 Iiul' 1. Moskva, RF: Standartinform; 2019. 13 s. (In Russ.)
9. Rybakova AV, Makarova MN, Kukharenko AE, VichareAS, Riuffer FR. Existing requirements and approaches to the dosing of drugs in laboratory animals. Vedomosti Nauch tsentra ekspertizy sredstv med primeneniia. 2018;8(4):207-17. doi: 10.30895/1991-2919-2018-8-4-207-217. (In Russ.)
Адрес для корреспонденции:
220116, Республика Беларусь, г. Минск, пр. Дзержинского, 83, УО «Белорусский государственный медицинский университет», кафедра фармацевтической технологии, e-mail: SechkoOG@bsmu.by, Сечко О. Г.
Поступила 14.12.2022 г.
