CC BY
4
ФАРМАКОЛОГИЯ И ФАРМАЦИЯ PHARMACOLOGY AND PHARMACY
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОВЫХ НЕИРОМЕДИАТОРОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В ТКАНЯХ МОЗГА КРЫС С ПОМОЩЬЮ ВЭЖХ-МС/МС
РЕЗЮМЕ
Хохлов А.Л. 1 2, Яичков И.И. 1 2, Корсаков М.К. 1, Каграманян И.Н. Вольхин Н.Н. 1, Петухов С.С. 1 2, Зайкова В.Е. 1 2
1 ФГБОУ ВО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского» (150010, г. Ярославль,
ул. Технопарковая, 11/2, Россия)
2 ФГБОУ ВО «Ярославский государственные медицинский университет» Минздрава России (150000, г. Ярославль,
ул. Революционная, 5, Россия)
3 ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (119991, г. Москва, ул. Большая Пироговская, 2, стр. 4, Россия)
Автор, ответственный за переписку: Яичков Илья Игоревич,
e-mail: ilya_1993_08@mail.ru
Обоснование. Определение изменения содержания моноаминовых нейро-медиаторов и их метаболитов в структурах головного мозга является необходимой частью изучения фармакодинамики противопаркинсонических лекарственных средств. Методика совместного определения норадренали-на, адреналина, допамина, серотонина, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, гомованилиновой кислоты, вани-лилминдальной кислоты в тканях мозга крыс ранее не была разработана. Цель исследования. Разработка и валидация методики количественного определения норадреналина, адреналина, допамина, серотонина, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, гомованилиновой кислоты, ванилилминдальной кислоты в тканях мозга крыс с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Методы. Методика определения моноаминовых медиаторов и их метаболитов разработана c применением метода ВЭЖХ-МС/МС. Гомогенаты тканей мозга готовились с помощью механического ручного гомогенизатора. Изучено влияние различных антиоксидантов на стабильность норадреналина, адреналина, допамина и 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты в испытуемых образцах.
Результаты. Хроматографическое разделение компонентов пробы осуществлялось с помощью двуххроматографических колонок Synergi Max RP (20 х 2,0 мм, 2,5 мкм) и Synergi Fusion RP 80А (250 х 4,6 мм, 4 мкм). Элюирование проводили в градиентном режиме с применением подвижной фазы на основе метанола и 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в воде. Для подготовки проб гомогенатов использовалось разведение образцов раствором внутренних стандартов в метаноле. В качестве стабилизатора-антиоксиданта был выбран 5%-й водный раствор аскорбиновой кислоты. Заключение. Разработанная методика прошла полную валидацию и соответствует требованиям российских и международных руководств. Выбранный способ стабилизации позволяет хранить образцы гомогенатов мозга в течение 30 дней после отбора.
Ключевые слова: ВЭЖХ-МС/МС, моноаминовые нейромедиаторы, ткани мозга, стабилизация образцов
3
Статья поступила: 24.07.2023 Статья принята: 19.01.2024 Статья опубликована: 26.03.2024
Для цитирования: Хохлов А.Л., Яичков И.И., Корсаков М.К., Каграманян И.Н., Воль-хин Н.Н., Петухов С.С., Зайкова В.Е. Разработка и валидация методики количественного определения моноаминовых нейромедиаторов и их метаболитов в тканях мозга крыс с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Acta biomedica scientifica. 2024; 9(1): 177-191. doi: 10.29413/ ABS.2024-9.1.18
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A METHOD FOR THE QUANTITATIVE
DETERMINATION OF MONOAMINE NEUROTRANSMITTERS
AND THEIR METABOLITES IN RAT BRAIN TISSUE USING HPLC-MS/MS
ABSTRACT
Khokhlov A.L. 1 2, Yaichkov I.I. 1 2, Korsakov M.K. 1, Kagramanyan I.N. Volkhin N.N. 1, Petukhov S.S. 1, 2, Zaikova V.E. 1, 2
1 Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky (Tekhnoparkovaya str. 11/2, Yaroslavl 150010, Russian Federation)
2 Yaroslavl State Medical University (Revolutsionnaya str. 5, Yaroslavl 150000, Russian Federation)
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University) (Bolshaya Pirogovskaya str. 2, build. 4, Moscow 119991 Russian Federation)
Corresponding author: Ilya I. Yaichkov,
e-mail: ilya_1993_08@mail.ru
Background. Determining changes in the content of monoamine neurotransmitters and their metabolites in brain structures is a necessary part of studying the pharmacodynamics of antiparkinsonian drugs. A method for the joint determination of norepinephrine, adrenaline, dopamine, serotonin, 5-hydroxyindole-3-acetic acid, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid, homovanillic acid, vanillylmandelic acid in rat brain tissue has not previously been developed.
The aim of the study. To develop and to validate a method for the quantitative determination of norepinephrine, adrenaline, dopamine, serotonin, 5-hydroxyindole-3-acetic acid, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid, homovanillic acid, vanillylmandelic acid in rat brain tissue using high-performance liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).
Materials and methods. A method for determining monoamine mediators and their metabolites was developed using the HPLC-MS/MS method. Brain tissue homogenates were prepared using a mechanical hand-operated homogenizer. The effect of various antioxidants on the stability of norepinephrine, adrenaline, dopamine and 3,4-dihydroxyphenylacetic acid in the test samples was studied. Results. Chromatographic separation of sample components was carried out using two SynergiMaxRP(20x 2.0mm, 2.5jm) andSynergiFusion RP80A (250x 4.6 mm, 4 jm) chromatographic columns. Elution was carried out in a gradient mode using a mobile phase based on methanol and a 0.1% solution of formic acid in water. To prepare homogenate batches, the samples were diluted with a solution of internal standards in methanol. A 5% aqueous solution of ascorbic acid was chosen as an antioxidant stabilizer.
Conclusion. The developed methodology has been fully validated and meets the requirements of Russian and international guidelines. The chosen stabilization method allows samples of brain homogenates to be stored for 30 days after collection.
Key words: HPLC-MS/MS, monoamine neurotransmitters, brain tissue, sample stabilization
3
For citation: Khokhlov A.L., Yaichkov I.I., Korsakov M.K., Kagramanyan I.N., Volkhin N.N., Petukhov S.S., Zaikova V.E. Development and validation of a method for the quantita-Received: 24.07.2023 tive determination of monoamine neurotransmitters and their metabolites in rat brain
A ted: 1901 2024 tissue using HPLC-MS/MS. Acta biomedica scientifica. 2024; 9(1): 177-191. doi: 10.29413/
ABS.2024-9.1.18
Published: 26.03.2024
ВВЕДЕНИЕ
Болезнь Паркинсона является нейродегенератив-ным заболеванием, при котором происходит снижение численности дофаминергических нейронов в чёрной субстанции, что приводит к уменьшению концентрации допамина (Dop) в стриатуме. Это вызывает классические двигательные симптомы - ригидность, нарушения осанки, акинезию, тремор, брадикинезию. Большинство существующих моделей данного заболевания предполагают использование крыс в качестве подопытных животных [1]. При изучении фар-макодинамики новых противопаркинсонических лекарственных средств (ЛС) требуется количественное определение допамина и его основных метаболитов - 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid) и гомованилиновой кислоты (3-метокси-4-гидроксифенилуксусной кислоты; HVA, homovanillic acid) в стриатуме. Одной из перспективных групп ЛС, применяемых при лечении болезни Паркинсона, являются ингибиторы фермента МАО-Б, который селективно катализирует окисление допамина. С целью исследования влияния данных ЛС на активность МАО-А необходимо измерять концентрацию норадреналина (NA, noradrenaline), се-ротонина (5НТ, 5-hydroxytryptamine) и его метаболита (5-гидроксииндол-3-ил)-уксусной кислоты (5HIAA, 5-hydroxyindoleacetic acid) [1, 2]. Для контроля правильности отбора проб мозга и стриатума и отсутствия контаминации частицами крови и других тканей необходимо контролировать содержание в пробах адреналина (Adr) и ванилилминдальной кислоты (2-гидрокси-2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-уксусной кислоты; VMA, vanillylmandelic acid), которые в норме не должны быть обнаружены в данных образцах [3-7].
Для количественного определения перечисленных выше аналитов в биологических объектах применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию со спектрофотометрическим (ВЭЖХ-УФ) [8], электрохимическим (ВЭЖХ-ЭД) [9-12] и тандемным масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС) [2, 5-7, 13-20]. Однако методика совместного анализа всех восьми изучаемых веществ в структурах головного мозга ранее не была опубликована. Процесс разработки данной методики осложнён тем, что норадре-налин, адреналин, допамин и DOPAC содержат в своей структуре пирокатехиновый фрагмент, что способствует их быстрому окислению в образцах за счёт взаимодействия с эндогенными веществами и кислородом воздуха [4, 21]. Для предотвращения деградации этих соединений требуется добавление к пробам растворов антиоксидантов. На необходимость применения стабилизатора указано только в работах J. Lu и со-авт. [2], J. Thomas и соавт. [8], G. Cannazza и соавт. [12], C. Ji и соавт. [15], A. Kovac и соавт. [17]. Поэтому выбор оптимальных условий стабилизации и хранения отобранных тканей головного мозга крыс также является актуальным для обеспечения достоверности результатов доклинических исследований.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Разработка и валидация методики совместного количественного определения норадреналина, адреналина, до-памина, серотонина, 5-гидроксииндол-3-уксусной кислоты, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты, гомованилиновой кислоты, ванилилминдальной кислоты в тканях мозга крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дизайн исследования
На первом этапе исследования осуществлялся выбор оптимальных условий подготовки проб гомогената, а также параметров хромато-масс-спектрометрического определения. Затем производился подбор стабилизато-ра-антиоксиданта для предотвращения деградации но-радреналина, адреналина, допамина и DOPAC. Далее оценивались матричные эффекты методики. На основании полученных результатов была выполнена коррекция объёмного соотношения растворителя и ткани при приготовлении гомогенатов. На следующем этапе проводилась полная валидация биоаналитической методики. Затем осуществлялась её апробация путём анализа проб стриатума шести интактных линейных крыс-самцов породы Wistar массой 362 ± 25 г (среднее значение ± стандартное отклонение (SD, standard deviation)). Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол № 2 от 23.03.2023).
Оборудование
Разработка и валидация методики проводилась на ВЭЖХ-МС/МС-системе, включающей в себя гибридный тандемный масс-спектрометр QTRAP5500 (SCIEX, Канада) и хроматограф 1260 Infinity (Agilent, США) (насос G1312B, автосемплер G1329B с термостатом G1330B, термостат колонок G1316A).
Реактивы
Метанол (кат. № 1060352500; Merck KGaA, Германия) и муравьиная кислота (кат. № А117-50; Thermo Fisher Scientific, США) качества «HPLC-MS-Grade» применяли для приготовления подвижной фазы. Субстанции аскорбиновой кислоты (х. ч.; кат. № 160003; АО «Ленреактив», Россия), натрия сульфита (ч. д. а.; кат. № 130231; АО «Лен-реактив», Россия), натрия тиосульфата пентагидрата (кат. № S007270500; Scharlau, Испания), натрия пиросульфи-та (ч.; кат. № 8.06.00804; АО «Химреактивснаб», США) были апробированы в качестве антиоксидантов. В качестве стандартных образцов определяемых веществ использовались вторичные стандартные образцы производства Sigma Aldrich (США): норадреналин (кат. № A7257-1G), адреналина гидрохлорид (кат. № E4642-5G), серотонин (кат. № 14927-25MG), допамина гидрохлорид (кат. № H8502-5G), (5-гидроксииндол-3-ил)-уксусная кислота (кат. № H8876-1G), 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота (кат. № 850217-1G), гомованилиновая кислота (кат. № H1252-1G), ванилил-миндальная кислота (кат. № H0131-1G). Для приготовле-
ния раствора внутренних стандартов (ВС) применяли суб- DHBA) (кат. № 858781-^) и фармакопейный стандартный станцию 3,4-дигидроксибензиламина гидробромида (3,4- образец соталола (USP; кат. № 1617408) (рис. 1).
HO
OH
O
O
O
O
,O
H3C
ж
H3C
Z/S O
O
//
HO
OH
РИС. 1.
Структурные формулы адреналина (а), норадреналина (б), допамина (в), серотонина (г), (5-гидроксииндол-3-ил)-уксусной кислоты (д), 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (е), гомованилиновой кислоты (ж), ванилилминдальной кислоты (з) и внутренних стандартов соталола (и) и 3,4-диги-дроксибензиламина (к)
FIG. 1.
Chemical structure of adrenaline (a), noradrenaline (6), dopamine (b), serotonin (¿), (5-hydroxyindol-3-yl)-acetic acid (d), 3,4-dihy-droxyphenylacetic acid (e), homovanilinic acid (m), vanillylmandel-ic acid (3) and internal standards of sotalol (u) and 3,4-dihydroxy-benzylamine (k)
2
3
б
а
2
2
в
г
д
е
з
2
3
и
к
Методика хромато-масс-спектрометрического определения
Хроматографическое разделение проводили при градиентном режиме на двух колонках Synergi Max RP (20 х 2,0 мм, 2,5 мкм) и Synergi Fusion RP 80Ä (250 х 4,6 мм, 4 мкм), используя в качестве компонентов подвижной фазы 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты и метанол (табл. 1). Данные обращённо-фазовые колонки имели дополнительные гидрофильные функциональные группы, необходимые для удерживания полярных катехола-минов. Температура термостата колонок составляла 40 °С.
ТАБЛИЦА 1
ПАРАМЕТРЫ ГРАДИЕНТНОГО ЭЛЮИРОВАНИЯ TABLE 1
THE PARAMETERS OF GRADIENT ELUTION
Время, мин Скорость потока, мкл/мин А, % В, %
0,0 650 98 2
2,0 650 98 2
9,0 650 20 80
14,1 650 20 80
14,5 1000 20 80
15,0 1000 20 80
15,1 1000 98 2
19,0 1000 98 2
19,2 650 98 2
21,0 650 98 2
Примечание. Подвижная фаза: А - 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты; В - метанол.
Детектирование проводилось в режиме MRM (multiple reaction monitoring) (табл. 2) с применением электрораспылительной ионизации (ESI, electrospray ionization). Определение NA, Adr, Dop, 5HT, 5HIAA, а также 3,4-DHBA осуществлялось в положительной полярности; DOPAC, HVA, VMA - в отрицательной полярности. Соталол детектировался в обоих полярностях: в положительной - для расчёта концентрации 5HT и 5HIAA; в отрицательной - для расчёта концентрации DOPAC, HVA и VMA. Данное соединение было использовано из-за структурного сходства с катехоламинами и близости его времени удерживания (10,4 мин) к временам удерживания 5HT (10,1 мин), 5HIAA (12,4 мин), DOPAC (11,9 мин), HVA (12,9 мин) и VMA (10,8 мин). В качестве внутреннего стандарта для определения норадреналина, адреналина и допамина применялся 3,4-DHBA. Его выбор основан на ранее опубликованных методиках количественного определения данных аналитов [9-12].
Параметры валидации методики
Полная валидация методики проводилась согласно требованиям руководства по валидации биоаналитических методов (M10) Международного совета по гармонизации (ICH, International Council on Harmonisation) [22], руководства Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA, Food and Drug Administration) [23], руководства (том 1) ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (НЦЭСМП) [24] и Решения Совета Евразийской экономической комиссии (ЕАК) № 85 (приложение 5) [25] к хроматографическим методикам. Модельные смеси гомогенатов готовились из образцов цельного мозга и образцов стриатума крыс породы Wistar. Данные объекты помещались в пред-
ТАБЛИЦА 2 TABLE 2
ПАРАМЕТРЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО THE PARAMETERS OF MASS SPECTROMETRY DETECTION
ДЕТЕКТИРОВАНИЯ
№ Аналит Полярность Напряжение ESI, В MRM-переход DP EP CE CXP
Q1 Q3
1 Adr + 4500 184,0 77,0 60 10 45 25
2 NA + 4500 170,0 77,0 60 10 40 25
3 Dop + 4500 154,0 119,0 60 10 35 25
4 5HT + 4500 177,0 160,0 60 10 30 25
5 5HTAA + 4500 192,0 146,0 60 10 20 13
6 DOPAC - -4500 167,0 123,0 -60 -10 -10 -30
7 HVA - -4500 181,0 122,0 -60 -10 -20 -25
8 VMA - -4500 197,0 137,0 -60 -10 -25 -30
9 3,4-DHBA + 4500 140,0 77,0 60 10 25 25
+ 4500 273,0 133,0 60 10 80 13
10 Sot
- -4500 271,0 174,0 -60 -10 -40 -16
Примечание. Sot - соталол; DP - потенциал декластеризации (declustering potential); EP - входной потенциал (entrance potential); CE - энергия соударения (collision energy); CXP - потенциал на выходе из ячейки соударения (collision cell exit potential).
ТАБЛИЦА 3 TABLE 3
КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛИБРОВОЧНЫХ ОБРАЗЦОВ CONCENTRATION OF CALIBRATION AND QUALITY
И ОБРАЗЦОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА CONTROL SAMPLES
Обозначение Концентрация, нг/г
NA Adr Dop 5HT DOPAC 5HTAA HVA VMA
K1 (LLOQ) 50 50 1250 75 200,0 150 80 67,50
K2 100 100 2500 150 400,0 300 160 135,00
K3 200 200 5000 300 800,0 600 320 270,00
K4 300 300 7500 450 1200,0 900 480 405,00
K5 400 400 10000 600 1600,0 1200 640 540,00
K6 600 600 15000 900 2400,0 1800 960 810,00
K7 900 900 22500 1350 3600,0 2700 1440 1215,00
K8 1200 1200 30000 1800,0 4800 3600 1920 1620,00
LQC 150 150 3750 225,0 600 450 240 202,50
MQC 500 500 12500 750,0 2000 1500 800 675,00
HQC 975 975 24375 1462,5 3900 2925 1560 1316,25
Dil 1800 1800 45000 2700,0 7200 5400 2880 2430
Примечание. Dil - концентрация для оценки эффекта разведения; K - калибровочная концентрация.
варительно тарированную пробирку ручного гомогенизатора и после добавления растворителя в нужном объёме гомогенизировались. После центрифугирования к надосадочной жидкости добавляли стандартный раствор смеси аналитов из расчёта 10 мкл стандартного раствора на 190 мкл супернатанта. Для изучения селективности методики (см. серию 1 в таблице 6), а также эффекта разведения проб использовались образцы мозга, хранившиеся в течение 2 лет при температуре не выше -20 °С, в которых аналитический сигнал аналитов отсутствовал. Оценка линейности проводилась на 8 уровнях концентраций (K1-K8), правильности и прецизионности - на 4 уровнях концентрации (на нижнем пределе количественного определения (LLOQ, lower limit of quantitation), нижнем (LQC, lower quality control), среднем (MQC, middle quality control) и верхнем (HQC, higher quality control) уровнях контроля качества), эффекта разведения - на одном уровне (Dil) (табл. 3).
РЕЗУЛЬТАТЫ
На начальном этапе разработки в качестве растворителя для приготовления гомогенатов был выбран метанол, т. к. при использовании воды на хро-матограммах отсутствовал пик NA (время удерживания tR = 4,7 мин), а при использовании ацетонитрила его соотношение «сигнал/шум» (S/N, signal/noise) было в 10 раз ниже (106/1). Образцы готовились с помощью ручного гомогенизатора путём добавления растворите-
ля из расчёта 3 мкл растворителя на 1 мг тканей мозга1. Затем гомогенаты центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об./мин и к 190 мкл супернатанта добавляли 10 мкл метанольного стандартного раствора с концентрацией К4 (табл. 3). К 50 мкл полученной пробы добавляли 120 мкл метанольного раствора смеси внутренних стандартов соталола и 3,4-DHBA. Смесь перемешивали на шейкере в течение 30 с, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об./мин.
На следующем этапе осуществлялся подбор раствора антиоксиданта (АО) путём изучения краткосрочной стабильности (STS, short-term stability) NA, Adr, Dop и DOPAC в образцах гомогенатов мозга, а также стабильности данных аналитов в приготовленных образцах в ав-тосемплере (ASS, autosampler stability). В качестве стабилизатора применяли водные растворы аскорбиновой кислоты, натрия сульфита, натрия метабисульфита, натрия тиосульфата в концентрациях 5 и 10 % [21]. Раствор антиоксиданта добавлялся из расчёта 10 мкл раствора на 50 мкл гомогената. Результаты испытания приведены в таблице 4.
При добавлении растворов натрия сульфита и натрия тиосульфата не удалось предотвратить окисление всех аналитов (табл. 4). Так, при применении растворов Na2S03 только концентрация DOPAC укладывалась в требуемый диапазон 85-115 %> от исходного значения. Использование раствора Na2S2O3 в концентрации 5 %
1 Пробу ткани взвешивали в предварительно тарированной пробирке гомогенизатора, а затем добавляли к ней метанол в нужном количестве: например, при массе ткани 100 мг к ней добавляли 300 мкл метанола.
ТАБЛИЦА 4 TABLE 4
РЕЗУЛЬТАТЫ ПОДБОРА THE RESULTS OF THE ANTIOXIDANT STABILIZER
СТАБИЛИЗАТОРА-АНТИОКСИДАНТА SELECTION
Антиоксидант
Без АО Аскорбиновая кислота Na2S2O3 Na2SO3
(n = 2) 5 % (n = 2) 10 % (n = 2) 5 % (n = 2) 10 % (n = 2) 5 % (n = 2) 10 % (n = 2)
ASS (+4 °C, 24 ч) 56,24 109,55 100,12 87,24 96,82 74,82 71,43
ю о га и NA STS (комнатная температура, 24 ч) 49,02 91,02 114,71 100,48 103,19 78,18 77,61
и та ^ ASS (+4 °C, 24 ч) 62,01 97,66 101,95 74,99 79,85 71,44 48,92
?! Ф с; о Adr STS (комнатная температура, 24 ч) 59,52 102,19 112,68 34,19 62,90 22,20 38,45
X га н Ф ASS (+4 °C, 24 ч) 39,28 105,03 96,62 92,53 N/A 83,01 N/A
S ш н га х ф Dop STS (комнатная температура, 24 ч) 35,21 101,39 95,96 54,65 N/A 48,12 N/A
|_ О S ASS (+4 °C, 24 ч) 78,26 107,21 97,88 93,37 87,44 94,24 90,94
0 1_ DOPAC STS (комнатная температура, 24 ч) 72,42 107,52 100,55 78,27 87,18 92,37 94,51
ASS (+4 °C, 24 ч) 90,00 90,15 - -- - -
ю о га и NA STS (комнатная температура, 24 ч) 75,45 97,35 - -- - -
и га ^ ASS (+4 °C, 24 ч) 70,73 95,98 - -- - -
Ф с; о Adr STS (комнатная температура, 24 ч) 23,17 100,57 - -- - -
X га н Ф ASS (+4 °C, 24 ч) 88,31 103,93 - -- - -
S ш н га X Ф Dop STS (комнатная температура, 24 ч) 49,93 98,61 - -- - -
|_ о S ASS (+4 °C, 24 ч) 95,55 97,28 - -- - -
0 1_ DOPAC STS (комнатная температура, 24 ч) 90,24 95,10 - -- - -
Примечание. N/A - отсутствие хроматографического пика аналита.
позволило предупредить окисление норадреналина, а также допамина и DOPAC в приготовленных образцах в автосемплере. В образцах с добавкой 10%-х растворов Na2S2O3 и Na2SO3 хроматографический пик Dop не был обнаружен. При добавлении растворов натрия метабисульфита к метанольным гомогенатам данная соль выпадала в осадок, поэтому эти образцы не анализировались. Только при применении аскорбиновой кислоты концентрация всех аналитов при испытаниях краткосрочной стабильности и стабильности в автосем-плере соответствовала установленным требованиям. Для дальнейших испытаний был выбран водный раствор аскорбиновой кислоты наименьшей концентрации 5 %, чтобы минимизировать риск загрязнения хро-матографической колонки, источника ионов и ионной оптики масс-спектрометра избыточным количеством данного вещества.
На следующем этапе исследования проводилось изучение матричных эффектов. Для приготовления модельных смесей использовали гомогенаты све-жеотобранного мозга крысы, гомогенаты свежеото-бранного стриатума и гомогенаты мозга, хранившиеся в течение 2 лет при температуре не выше -20 °С, полученные от 6 разных животных. Согласно требованиям российских и зарубежных руководств по ва-лидации биоаналитических методик [23-25], анализировалась по 6 образцов на уровне концентраций LQC и HQC (см. табл. 3), а также проба каждого гомогената без добавки стандарта для вычитания сигнала эндогенных веществ (табл. 5).
При первоначальных условиях подготовки проб величина коэффициент вариации (CV, coefficient of variation) нормализованного фактора матрицы (NMF, normal matrix factorization) при определении 5HT
ТАБЛИЦА 5
ОЦЕНКА ЭФФЕКТА МАТРИЦЫ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ АНАЛИТОВ В ГОМОГЕНАТАХ МОЗГА
TABLE 5
ASSESSING THE MATRIX EFFECT WHEN DETERMINING THE ANALYTES IN BRAIN HOMOGENATES
Аналиты Гомогенат Гомогенат
в соотношении 1:3 в соотношении 1:7
LQC 13,48 11,39
NA
HQC 14,09 4,80
LQC 13,94 7,46
Adr
HQC 12,76 10,56
LQC 8,95 6,07
Dop
HQC 5,15 7,29
LQC 13,98 5,93
5HT
HQC 17,69 4,37
СУ (N1^), %
LQC 11,14 9,77
5HIAA
HQC 6,25 5,23
LQC 26,82 7,89
DOPAC
HQC 21,38 7,49
LQC 11,10 5,37
HVA
HQC 11,95 8,65
LQC 10,90 8,37
VMA
HQC 10,31 5,07
5HT (гомогенат мозга) LQC 0,183 0,135
П = 4) HQC 1,464 0,956
5HT (гомогенат стриатума) LQC 0,142 0,132
Соотношение площадей пиков (п = 2) HQC 1,021 0,940
«аналит/ внутренний стандарт»
(среднее значение) DOPAC (гомогенат мозга) LQC 4,635 2,223
(п = 4) HQC 33,255 15,538
DOPAC (гомогенат стриатума) LQC 2,701 2,115
(п = 2) HQC 22,502 15,327
Примечание. CV (NMF) - коэффициент вариации нормализованного фактора матрицы (coefficient of variation for normal matrix factorization).
и DOPAC превышала допустимый предел в 15 % (табл. 5). Для снижения матричных эффектов было изменено соотношение метанола и тканей мозга при приготовлении гомогенатов: проба готовилась из расчёта 7 мкл растворителя на 1 мг ткани. При данных условиях подготовки проб результат CV (NMF) отвечал установленным требованиям для всех аналитов. Далее была повторно проверена стабильность NA, Adr, Dop и DOPAC в образцах метанольного гомогената, приготовленного в соотношении 1:7, с применением выбранного ранее 5%-го водного раствора аскорбиновой кислоты (см. табл. 4). Концентрации всех аналитов при испытаниях ASS и STS укладывались в допустимый диапазон 85,0-115,0 % от исходного значения.
Таким образом, для количественного определения концентрации изучаемых веществ в тканях мозга гомо-генат готовился вручную в соотношении 1:7 (масса ткани/ объём метанола). Далее пробу центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об./мин. И стабилизировали водным раствором аскорбиновой кислоты в концентрации 5 % из расчёта 10 мкл раствора на 50 мкл супернатанта. Затем к 60 мкл смеси добавляли 120 мкл метанольного раствора внутренних стандартов, перемешивали в течение 30 с и центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об./мин. Надосадочную жидкость переносили в микровставку и анализировали с помощью ВЭЖХ-МС/МС.
После выбора окончательных условий подготовки проб и хромато-масс-спектрометрического определе-
ния проводилась полная валидация методики. Аналитический диапазон для Adr и NA составил 50-1200 нг/г, для Dop - 1,25-30,00 мкг/г, для 5HT - 75-1800 нг/г, для DOPAC - 200-4800 нг/г, для 5HIAA - 150-3600 нг/г, для HVA - 80-1920 нг/г, для VMA - 67,5-1620 нг/г. Зависимость соотношения площадей пиков «аналит/внутрен-ний стандарт» от концентрации каждого соединения носила линейный характер. При оценке селективности методики на образцах гомогенатов мозга, хранившихся при температуре не выше -20 °С в течение 2 лет, пло-
щадь хроматографических пиков в холостых образцах у аналитов не превышала 20 % от площади пиков в образцах НОО, для внутренних стандартов соталола, для внутренних стандартов 3,4^НВА площадь хроматогра-фических пиков не превышала 5 % от площади пиков в образцах НОО (рис. 2, 3).
Средние значения рассчитанных концентраций определения всех изучаемых соединений находились в пределах 85-115 % от номинального значения для уровней концентраций ЮС, МОС и НОС, в пределах
РИС. 2. FIG. 2.
Примеры MRM-хроматограмм холостого образца и образ- The examples of MRM chromatograms of a blank sample
ца с добавкой стандарта на уровне LLOQ (аналиты - NA, Adr, and a spiked LLOQ sample (analytes - NA, Adr, Dop, 5HT, 5HIAA,
Dop, 5HT, 5HIAA, DOPAC) DOPAC)
РИС. 3.
Примеры MRM-хроматограмм холостого образца и образца с добавкой стандарта на уровне LLOQ (аналиты - HVA, VMA, 3,4-DHBA (ВС), соталол (ВС))
FIG. 3.
The examples of MRM chromatograms of a blank sample and a spiked LLOQ sample (analytes - HVA, VMA, 3,4-DHBA (IS), Sotalol (IS))
80-120 % - для уровня концентраций LLOQ, в том числе при оценке селективности методики (табл. 6, серия 1). Величина коэффициента вариации рассчитанных концентраций при этом не превышала 15 %. При этом результат аналитических серий 2 и 3 (табл. 6), выполненных на образцах гомогенатов свежеотобранного мозга, рассчитывался с учётом эндогенного содержания аналитов в пробах без добавки стандарта. Двукратное разведение проб с содержанием изучаемых веществ, превышающим аналитический диапазон (Dil; см. табл. 3), холостой матрицей не влияло на метрологические характеристики методики: значение рассчитанных концентраций аналитов лежало в интервале 89,76-94,99 % от номинального значения, значение CV - в интервале 2,77-5,88 % (табл. 6). Перенос аналитов и внутренних стандартов из предыдущей пробы отсутствовал.
Выбранный раствор антиоксиданта обеспечивает стабильность аналитов в образцах гомогената в течение 24 ч хранения при комнатной температуре, 3 циклов заморозки/разморозки (FTS, freezing/thawing stability), 30 дней хранения в морозильной камере при температуре не выше -20 °С (LTS, long-term stability), а также стабильность в приготовленных пробах в автосемплере в течение 48 ч при температуре +4 °С (табл. 7).
Разработанная методика апробирована путём анализа образцов стриатума, полученного от 6 интактных линейных крыс-самцов породы Wistar. Пробы мозга сразу после забора охлаждали жидким азотом, извлекали стриатум. Гомогенизацию и добавление раствора стабилизатора проводили не позднее 20 мин после отбора. Результаты определения NA, Adr, Dop, 5HT, DOPAC, 5HIAA, VMA, HVA представлены в таблице 8.
е
ш ■о
г
-е-
ш ■о
г
00 VI
ТАБЛИЦА б
РЕЗУЛЬТАТЫ ВАЛИДАЦИИ РАЗРАБОТАННОЙ МЕТОДИКИ
TABLE б
RESULTS OF THE VALIDATION OF DEVELOPED METHOD
Параметры Adr NA Dop 5 HT 5HIAA DO РАС HVA VMA
Селективность Интерференция в области времён удерживания аналитов в холостых образцах не превышала 20 % от уровня LLOQ, в области времён удерживания внутренних - не превышала 5 % от площади пика*
LLOQ 50 нг/г 50 нг/г 1,25 мкг/г 75 нг/г 150 нг/г 200 нг/г 80 нг/г 67.5 нг/г
Калибровочный диапазон (линейная зависимость) 50-1200 нг/г 50-1200 нг/г 1,25-30,00 мкг/г 75-1800 нг/г 150-3600 нг/г 200-4800 нг/г 80-1920 нг/г 67,5-1620 нг/г
Правильность и прецизионность Асс., % CV, % Асс., % CV, % Асс., % CV, % Асс., % CV, % Асс., % CV, % Асс., % CV, % Асс., % CV, % Асс., % CV, %
LLOQ 112,73 8,34 109,61 12,06 104,46 13,48 82,64 6,28 103,52 9,49 115,69 7,62 86,68 9,39 100,42 7,97
Серия 1 (л = б**) LQC MQC 92,25 97,49 8,66 8,59 96,79 90,04 8,94 7,47 95,74 97,45 7,96 6,48 88,31 86,98 5,01 2,30 98,19 111,27 8,97 5,75 97,73 98,66 9,49 6,60 98,98 104,73 9,11 5,71 102,87 109,07 3,34 2,72
HQC 104,51 3,78 91,97 4,04 100,89 5,95 89,17 2,95 114,60 3,25 105,36 3,78 108,76 7,68 110,87 3,96
LLQC 85,44 8,06 94,21 12,11 90,42 6,40 110,94 7,00 108,36 6,91 114,02 5,72 101,01 6,36 111,76 3,39
Серия 2(п = б**) LQC MQC 99,82 96,97 9,09 9,16 92,70 91,98 9,06 8,04 95,90 92,33 10,04 8,77 93,18 87,29 3,59 3,36 106,26 113,84 3,19 4,22 106,73 97,66 5,69 5,03 110,72 104,49 1,40 6,52 102,01 96,82 3,73 2,55
HQC 104,38 9,21 101,75 6,78 96,28 6,17 93,33 2,72 111,91 2,13 99,15 3,12 112,17 5,00 102,51 3,01
LLQC 101,48 13,05 98,56 12,01 106,51 5,59 92,11 3,81 116,19 4,06 112,96 4,18 100,72 11,90 117,89 2,41
Серия 3 (л = б**) LQC MQC 93,43 89,70 9,26 3,36 93,27 96,11 7,95 5,02 92,70 91,00 4,95 2,70 91,44 93,15 3,09 3,48 110,03 95,31 6,76 10,62 108,07 98,65 3,10 3,44 100,96 99,25 8,29 1,80 109,49 105,30 3,73 2,93
HQC 87,67 5,39 99,14 5,51 93,76 7,27 96,03 3,22 86,07 2,35 97,61 3,20 105,11 3,46 106,65 2,61
LLQC 99,89 15,58 100,79 14,08 100,46 12,13 92,11 3,81 109,36 8,70 114,22 6,29 102,55 12,13 109,99 8,42
Правильность и прецизионность LQC 95,17 9,95 94,26 9,14 94,78 8,37 91,44 3,09 104,82 8,36 104,17 8,01 110,45 8,75 104,80 4,95
между сериями (л = 18**) MQC HQC 94,72 98,85 8,78 10,72 92,71 97,62 7,65 7,26 93,59 96,98 7,37 7,35 93,15 96,03 3,48 3,22 106,81 103,31 10,67 13,00 98,32 100,70 5,36 4,90 102,82 108,68 5,91 6,49 103,73 106,68 5,82 4,71
Эффект Асс., % 93,77 90,73 94,99 94,71 89,76 93,58 91 ,17 93,36
разведения (л = б) CV,% 4,63 4,05 3,60 5,88 2,77 3,97 4,68 4,24
Примечание. *- оценка селективности проводилась в рамках серии 1;**- количество проб на каждом уровне концентраций; Асс. (accuracy) - отклонение среднего значения рассчитанных концентраций от номинального значения.
ТАБЛИЦА 7
РЕЗУЛЬТАТЫ ОЦЕНКИ СТАБИЛЬНОСТИ АНАЛИТОВ В ГОМОГЕНАТАХ МОЗГА
TABLE 7
RESULTS OF ASSESSING STABILITY OF ANALYTES IN BRAIN HOMOGENATES
Параметры Adr NA Dop 5НТ SHIAA DOPAC HVA VMA
и STS (24 ч при комнатной LQC 100^ 96,5S 99,S5 91,S0 96,93 97,S0 99,01 101,79
и ц а температуре) (n = 6*) HQC 100,47 94,03 97,51 90,64 105^5 102,21 103^ 107,47
р т н LQC 100,60 101,04 101,40 95,56 97,26 100,69 102,62 105,00
це FTS (n = 6*) (3 цикла)
он к HQC 103,22 96,7S 103,04 97,63 101,4S 101,13 102,01 107,44
й о н LQC 102^1 9S,42 9S,76 96,21 99,61 100,65 101,47 100,41
д о ASS (48 ч при +4 °С) (n = 6*)
схо и HQC 102,4S 95,96 96,22 93,S2 100^3 97,95 100,79 104,5S
т о LTS (30 дней при температуре LQC 103,11 100,12 104^4 95,50 9S,41 102,41 102,43 96,99
не выше -20 °С) (n = 6*) HQC 102,25 99,0S 100,74 9S,70 9S,75 97,S4 9S,65 9S,S5
Примечание. * - количество проб на каждом уровне концентрации; FTS - стабильность после 3 циклов заморозки/разморозки (freezing/thawing stability); LTS - долгосрочная стабильность (long-term stability).
ТАБЛИЦА 8
РЕЗУЛЬТАТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОРАДРЕНАЛИНА, АДРЕНАЛИНА, ДОПАМИНА, СЕРОТОНИНА, DOPAC, 5HIAA, VMA, HVA В ОБРАЗЦАХ СТРИАТУМА КРЫС
TABLE 8
RESULTS OF QUANTIFICATION OF NORADRENALINE, ADRENALINE, DOPAMINE, SEROTONIN, DOPAC, 5HIAA, VMA, HVA IN RAT STRIATUM SAMPLES
Концентрация, нг/г
Adr NA Dop 5НТ SHIAA DOPAC HVA VMA
Средние значения (n = 6) менее LLOQ 354,S5 9^1,30 595,S6 11S0,49 1S51,35 S96,26 менее LLOQ
SD - 33,43 1497^4 137,25 244,61 2S3,25 266,3S -
CV, О - 9,42 16,31 23,03 20,72 15,30 29,72 -
ОБСУЖДЕНИЕ
В результате подбора оптимальных условий анализа для приготовления проб тканей мозга после их механической гомогенизации было выбрано разведение образца метанольным раствором внутренних стандартов. Это значительно ускоряет производительность пробоподготовки по сравнению с работами, в которых использовались жидкостно-жидкост-ная экстракция [18], диализ [13, 17, 19], а также дери-ватизация аналитов [13, 14]. Применение ВЭЖХ-МС/ МС даёт преимущество в селективности и чувствительности методики по сравнению с ВЭЖХ-УФ [8] и ВЭЖХ-ЭД [9-12] при проведении фармакодинами-ческих исследований ЛС. Так, при использовании данных методик молекулы изучаемых ЛС могут экстрагироваться и коэлюироваться вместе с аналитами, давая тем самым завышенные результаты количественного определения [3]. Время хроматографического анализа составляет 21 мин, что дольше, чем в методиках E. Grouzmann и соавт. [5], N. Hwang и соавт. [6], L. Fang и соавт. [7], S. Greco и соавт. [14], C. Ji и соавт. [15]. Однако в данных работах анализируется меньшее количество моноаминовых нейромедиаторов и их метаболитов.
При подборе стабилизатора был использован подход, заключающийся в предварительной оценке краткосрочной стабильности аналитов в гомогенатах и стабильности проб в автосемплере без добавления и с добавлением антиоксидантов. Аналогичный подход был использован для образцов плазмы крови в работе [21], но он не предусматривал испытаний ASS. Приемлемые результаты при выборе антиоксиданта были достигнуты только при добавлении к супернатанту го-могената водных растворов аскорбиновой кислоты в объёмном соотношении 1:5 (см. табл. 5, 7). Это связано с тем, что в метанольных пробах солевые восстановители (Na2SO3, Na2S2O3, Na2S2O5) растворяются значительно хуже, чем выбранный стабилизатор. При изучении долгосрочной стабильности показано (табл. 7), что для хранения образцов достаточно температуры не выше -20 °С.
Полученные в ходе апробации методики значения концентраций Dop, NA, 5HT, 5HIAA, DOPAC, HVA в образцах стриатума крыс совпадают с данными, опубликованными в работах J. Lu и соавт. [2] и N.N. Khlebnikova и соавт. [10]. Хроматографические пики Adr и VMA на хроматограммах испытуемых проб обнаружены не были, что свидетельствует о правильности забора образцов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработанная методика количественного определения норадреналина, адреналина, допамина, серотони-на, DOPAC, 5HIAA, VMA, HVA в образцах мозга крысы соответствует требованиям руководств НЦЭСМП, ЕАК, ICH, FDA по показателям селективности, калибровочной зависимости, правильности и прецизионности внутри цикла и между циклами, эффекта разведения, эффекта переноса из предыдущей пробы, эффекта матрицы, стабильности. Применение выбранного способа стабилизации позволяет предотвратить окисление аналитов во время подготовки и анализа проб, а также их хранения в течение как минимум 30 дней. Это значительно снижает риски недостоверных результатов при проведении доклинических испытаний фармакодинамики и исключения из эксперимента фармакологически эффективных соединений из-за ложно заниженных концентраций ней-ромедиаторов и их метаболитов в пробах.
Ограничения исследования
Данная методика прошла валидацию и показала свою пригодность для определения аналитов в образцах тканей мозга крыс. Использование методики для количественного определения изучаемых веществ у другого вида животных потребует её частичной валидации путём оценки эффекта матрицы, калибровочной зависимости и селективности.
Финансирование
Исследование выполнено за счёт средств гранта Российского научного фонда «Разработка новых фармакологических агентов для терапии нейродегенеративных заболеваний» № 22-13-20085.
Конфликт интересов
Авторы данной статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012. [Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part one. Moscow: Grif i K; 2012. (In Russ.)].
2. Lu J, Sun F, Ma H, Qing H, Deng Y. Quantitative detection of dopamine, serotonin and their metabolites in rat model of Parkinson's disease using HPLC-MS/MS. 2015 IEEE International Conference on Mechatronics and Automation. 2015: 1460-1465. doi: 10.1109/ICMA.2015.7237700
3. Яичков И.И., Джурко Ю.А., Шитов Л.Н. Основные ошибки в аналитической части исследований биоэквивалентности и фармакокинетики. Медицинская этика. 2018; 6(1): 33-38. [Yaichkov II, Dzhurko YA, Shitov LN. The main error in the analytical part of bioequivalence studies and pharmacokinetics. Medical Ethics. 2018; 6(1): 33-38. (In Russ.)].
4. Хохлов А.Л., Рыска М., Кукес В.Г., Писачкова М., Печена М., Яворский А.Н., и др. Современные подходы к проведению
биоаналитических исследований при создании лекарственных препаратов. М.: Российская академия наук; 2018. [Khokhlov AL, Ryska M, Kukes VG, Pisachkova M, Pechena M, Yavorsky AN, et al. Modern approaches to conducting bioanalytical studies in the creation of drugs. Moscow: Russian Academy of Sciences; 2018. (In Russ.)].
5. Grouzmann E, Centeno C, Eugster PJ. Quantification of va-nillylmandelic acid, homovanillic acid and 5-hydroxyindoleacetic acid in urine using a dilute-and-shoot and ultra-high pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry method. Clin Chem Lab Med. 2018; 56(9): 1533-1541. doi: 10.1515/cclm-2017-1120
6. Hwang N, Chong E, Oh H, Cho HW, Lee JW, Sung KW, et al. Application of an LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of homovanillic acid and vanillylmandelic acid for the diagnosis and follow-up of neuroblastoma in 357 patients. Molecules. 2021; 26(11): 3470. doi: 10.3390/molecules26113470
7. Fang L, Lv Y, Sheng X, Yao S. Sensitive, rapid and easy analysis of three catecholamine metabolites in human urine and serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry. J Chro-matogrSci. 2012; 50(5): 450-456. doi: 10.1093/chromsci/bms068
8. Thomas J, Khanam R, Vohora D. A validated HPLC-UV method and optimization of sample preparation technique for norepinephrine and serotonin in mouse brain. Pharm Biol. 2015; 53(10): 1539-1544. doi: 10.3109/13880209.2014.991837
9. Brenes JC, Fornaguera J. The effect of chronic fluoxetine on social isolation-induced changes on sucrose consumption, immobility behavior, and on serotonin and dopamine function in hippocampus and ventral striatum. BehavBrain Res. 2009; 198(1): 199-205. doi: 10.1016/j.bbr.2008.10.036
10. Khlebnikova NN, Orshanskaya EV, Narkevich VB, Kudrin VS, Krupina NA. Dipeptidyl peptidase 4 inhibitors diprotin A and sitag-liptin administered on weeks 2-3 of postnatal development modulate monoamine metabolism in the striatum of adult rats. Bull Exp Biol Med. 2017; 163(2): 190-194. doi: 10.1007/s10517-017-3763-5
11. Krupina NA, Khlebnikova NN, Narkevich VB, Naplekova PL, Kudrin VS. The levels of monoamines and their metabolites in the brain structures of rats subjected to two- and three-month-long social isolation. Bull Exp Biol Med. 2020; 168(5): 605-609. doi: 10.1007/s10517-020-04761-5
12. Cannazza G, Carrozzo MM, Cazzato AS, Bretis IM, Troisi L, Parenti C, et al. Simultaneous measurement of adenosine, dopamine, acetylcholine and 5-hydroxytryptamine in cerebral mice microdialysis samples by LC-ESI-MS/MS. J Pharm Biomed Anal. 2012; 71: 183-186. doi: 10.1016/j.jpba.2012.08.004
13. Jampolska M, Andrzejewski K, Zaremba M, Joniec-Macie-jak I, Kaczynska K. Deficiency of biogenic amines modulates the activity of hypoglossal nerve in the reserpine model of Parkinson's disease. Cells. 2021; 10: 531. doi: 10.3390/cells10030531
14. Greco S, Danysz W, Zivkovic A, Gross R, Stark H. Micro-dialysate analysis of monoamine neurotransmitters - A versatile and sensitive LC-MS/MS method. AnalChim Acta. 2013; 771: 65-72. doi: 10.1016/j.aca.2013.02.004
15. Ji C, Walton J, Su Y, Tella M. Simultaneous determination of plasma epinephrine and norepinephrine using an integrated strategy of a fully automated protein precipitation technique, reductive ethylation labeling and UPLC-MS/MS. Anal Chim Acta. 2010; 670: 84-91. doi: 10.1016/j.aca.2010.04.051
16. Kim S, Jang EY, Song S-H, Kim JS, Ryu IS, Jeong C-H, et al. Brain microdialysis coupled to LC-MS/MS revealed that CVT-10216, a selective inhibitor of aldehyde dehydrogenase 2,
alters the neurochemical and behavioral effects of methampheta-mine. ACS Chem Neurosci. 2021; 12(9): 1552-1562. doi: 10.1021/ acschemneuro.1c00039
17. Kovac A, Somikova Z, Zilka N, Novak M. Liquid chroma-tography-tandem mass spectrometry method for determination of panel of neurotransmitters in cerebrospinal fluid from the rat model for tauopathy. Talanta. 2014; 119: 284-290. doi: 10.1016/ j.talanta.2013.10.027
18. Попов Н.С., Гавриленко Д.А., Балабаньян В.Ю., Петрова М.Б., Донсков С.А., Атаджанов И.Б., и др. Количественное определение моноаминовых нейротрансмиттеров в гомоге-натах головного мозга крыс с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Фарма-кокинетика и Фармакодинамика. 2022; (4): 33-42. [Popov NS, Gavrilenko DA, Balabanyan VYu, Petrova MB, Donskov SA, At-adzhanov IB, et al. Quantitative determination of monoamine neurotransmitters in rat brain homogenates using HPLC-MS/ MS. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. 2022; (4): 33-42. (In Russ.)]. doi: 10.37489/2587-7836-2022-4-33-42
19. Syslova K, Rambousek L, Kuzma M, Najmanova V, Bubenikova-Valesova V, Slamberova R, et al. Monitoring of do-pamine and its metabolites in brain microdialysates: Method combining freeze-drying with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A. 2011; 1218(21): 3382-3391. doi: 10.1016/j.chroma.2011.02.006
20. Xie Z, Lorkiewicz P, Riggs DW, Bhatnagar A, Srivastava S. Comprehensive, robust, and sensitive UPLC-MS/MS analysis of free biogenic monoamines and their metabolites in urine. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2018; 1099: 83-91. doi: 10.1016/ j.jchromb.2018.09.012
21. Хохлов А.Л., Яичков И.И., Джурко Ю.А., Рыска М., Ку-беш В., Шитов Л.Н. Подходы к разработке биоаналитических методик для определения нестабильных соединений в биологических жидкостях. Acta biomedica scientifica. 2018; 3(5): 106-115. [Khokhlov AL, Yaichkov II, Dzhurko YuA, Ryska M, Kubes V, Shitov LN. Approaches to the development of bioanalytical methods for determination of unstable substances in biological fluids. Acta biomedica scientifica. 2018; 3(5): 106-115. (In Russ.)]. doi: 10.29413/ABS.2018-3.5.16
22. ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis. 2022. URL: https://www.ema.europa.eu/ en/documents/scientific-guideline/ich-guideline-m10-bioanalyti-cal-method-validation-step-5_en.pdf [date of access: 15.05.2023].
23. Food and Drug Administration. Guidance for industry. bioanalytical method validation. 2018. URL: https://www.fda.gov/ files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf [date of access: 15.05.2023].
24. Руководство по экспертизе лекарственных средств. М.: Полиграф-Плюс; 2014; (1). [Guide to the expert analysis of drugs. Moscow: Polygraph-Plus; 2014; (1). (In Russ.)].
25. Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза: Решение Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 85. 2016. [On approval of the Rules for conducting bioequivalence studies of medicinal products within the framework of the Eurasian Economic Union. Decision of the Council of the Eurasian Economic Commission of November3,2016No. 85. 2016. (In Russ.)]. URL: http://docs.cntd. ru/document/456026107 [дата доступа: 15.05.2023].
Сведения об авторах
Хохлов Александр Леонидович - доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заместитель директора по научной работе Центра трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова, ФГБОУ ВО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»; заведующий кафедры фармакологии и клинической фармакологии, ректор, ФГБОУ ВО «Ярославский государственные медицинский университет» Минздрава России, e-mail: al460935@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-0032-0341 Яичков Илья Игоревич - кандидат фармацевтических наук, научный сотрудник Центра трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова, ФГБОУ ВО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»; научный сотрудник Института фармации, ФГБОУ ВО «Ярославский государственные медицинский университет» Минздрава России, e-mail: ilya_1993_08@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-0066-7388
КорсаковМихаил Константинович - доктор химических наук, профессор кафедры химии, теории и методики преподавания химии, директор Центра трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова, ФГБОУ ВО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского», e-mail: m.korsakov@yspu.org, https://orcid.org/0000-0003-0913-2571 Каграманян Игорь Николаевич - доктор медицинских наук, профессор Института лидерства и управления здравоохранением, ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), e-mail: info@hsha.ru, https://orcid.org/0000-0002-2139-6847 Вольхин Никита Николаевич - младший научный сотрудник Центра трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова, ФГБОУ ВО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского», e-mail: nnvolkhin@ysmu.ru, https://orcid.org/0000-0002-4275-9037
Петухов Сергей Станиславович - инженер Центра трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова, ФГБОУ ВО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»; младший научный сотрудник Института фармации, ФГБОУ ВО «Ярославский государственные медицинский университет» Минздрава России, e-mail: sspp465@mail.ru, https://orcid.org/0009-0007-8435-7689
Зайкова Валерия Евгеньевна - лаборант Центра трансфера фармацевтических технологий им. М.В. Дорогова, ФГБОУ ВО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского»; специалист Института фармации, ФГБОУ ВО «Ярославский государственные медицинский университет» Минздрава России, e-mail: valeria.zaykova@bk.ru, https://orcid.org/0009-0008-9431-1980
Information about the authors
Alexander L. Khokhlov - Dr. Sc. (Med.), Professor, Member of RAS, Deputy Director for Science of the Center of Pharmaceutical Technologies Transfer named after M.V. Dorogov, Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky; Head of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Rector, Yaroslavl State Medical University, e-mail: al460935@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-0032-0341
Ilya I. Yaichkov - Cand. Sc. (Med.), Research Officer at the Center of Pharmaceutical Technologies Transfer named after M.V. Dorogov, Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky; Research Officer at the Institute of Pharmacy, Yaroslavl State Medical University, e-mail: ilya_1993_08@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-0066-7388 Mikhail K. Korsakov - Dr. Sc. (Chem.), Professor at the Department of Chemistry, Theory and Methods for Teaching of Chemistry, Director of the Center of Pharmaceutical Technologies Transfer named after M.V. Dorogov, Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky, e-mail: m.korsakov@yspu.org, https://orcid.org/0000-0003-0913-2571
Igor N. Kagramanyan - Dr. Sc. (Med.), Professor at the Institute of Leadership and Management of Healthcare, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), e-mail: info@hsha.ru. https://orcid.org/0000-0002-2139-6847
NikitaN. Volkhin- Junior Research Officer at the Center of Pharmaceutical Technologies Transfer named after M.V. Dorogov, Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky, e-mail: nnvolkhin@ysmu.ru, https://orcid.org/0000-0002-4275-9037
Sergey S. Petukhov - Engineer at the Center of Pharmaceutical Technologies Transfer named after M.V. Dorogov, Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky; Junior Research Officer at the Institute of Pharmacy, Yaroslavl State Medical University, e-mail: sspp465@mail.ru, https://orcid.org/0009-0007-8435-7689
Valeria E. Zaykova - Clinical Research Assistant at the Center of Pharmaceutical Technologies Transfer named after M.V. Dorogov, Yaroslavl State Pedagogical University named after K.D. Ushinsky; Specialist at the Institute of Pharmacy, Yaroslavl State Medical University, e-mail: valeria.zaykova@bk.ru, https://orcid.org/0009-0008-9431-1980
