CC BY
14УДК 615.074-615.213 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-08-04
© Коллектив авторов, 2020
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ВЭЖХ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО ВАЛЬПРОЕВОЙ КИСЛОТЫ И 1,3,4-ТИАДИАЗОЛА В ПЛАЗМЕ КРОВИ КРОЛИКОВ ДЛЯ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
А.С. Малыгин
аспирант, кафедра фармакологии и клинической фармакологии,
ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Тверь); ORCID ID 0000-0003-1955-5105 E-mail: dr.a.s.m@yandex.ru Н.С. Попов
к.фарм.н., ассистент, кафедра фармации,
ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Тверь); ORCID ID 0000-0002-1792-7414 М.А. Демидова
д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармации,
ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Тверь); ORCID ID 0000-0002-0270-8809 Н.А. Шатохина
к.м.н., доцент, кафедра фармакологии и клинической фармакологии,
ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Тверь);
ORCID ID 0000-0001-6970-1313
E-mail: tgmu-nauka@mail.ru
Цель исследования. Разработка и валидация методики ВЭЖХ-масс-спектрометрического определения нового производного вальпроевой кислоты и 1,3,4-тиадиазола в плазме крови кроликов.
Материал и методы. Объектом исследования явился 1\1-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид (вальпразоламид) -новое противоэпилептическое средство из группы тиадиазоловых производных вальпроевой кислоты. Определение вальпразо-ламида в плазме крови кроликов осуществляли с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies, Германия). В качестве детектора использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр ABSciex QTrap 3200 MD (ABSciex, Сингапур) с электрораспылительным источником ионов (TurboV с зондом Turbo Ion Spray). Для разработанной методики оценивали селективность, перенос пробы, линейность, правильность, прецизионность, матричный эффект, степень извлечения вальпразоламида.
Результаты. Разработана методика ВЭЖХ-масс-спектрометрического определения вальпразоламида в плазме крови кроликов (аналитическая колонка Phenomenex Synergi C18 4 мкм 2,0x50 мм, градиентное элюирование: 0-1 мин 10%-ный водный раствор ацетонитрила; 1-3 мин линейное повышение концентрации ацетонитрила в смеси до 90%; 3-4 мин изократический участок с концентрацией ацетонитрила 90%; 4-5 мин кондиционирование колонки 10%-ным раствором; скорость потока подвижной фазы - 0,6 мл/мин; объем вводимой пробы - 20 мкл; общее время градиентного элюирования - 5 мин; масс-спектрометрическое детектирование). Условия масс-детектирования: положительная поляризация, напряжение электроспрея 5500,0 В, потенциал декластеризации 41,0; давление газа завесы 20,0 psi, газа распыления - 40,0 psi, потенциал ввода 3,5 В. MRM-переходы для вальпразоламида составили m/z256,1 ^m/z130,1 ит^81,0. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетазоламид (m/z 223,1^ m/z73,0).
Выводы. Аналитический диапазон методики определения вальпразоламида составляет 1-1000 нг/мл. Разработанная методика является селективной, точной, прецизионной и линейной, по всем параметрам соответствует требованиям по валидации биоаналитических методик.
Ключевые слова: ВЭЖХ-МС/МС, вальпроевая кислота, 1,3,4-тиадиазол, противоэпилептические средства, масс-спектро-метрия.
Для цитирования: Малыгин А.С., Попов Н.С., Демидова М.А., Шатохина Н.А. Разработка и валидация методики ВЭЖХ-масс-спектрометрического определения нового производного вальпроевой кислоты и 1,3,4-тиадиазола в плазме крови кроликов для фармакокинетических исследований. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(8):26-33. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-08-04
Вальпроевая кислота является эффективным и широко используемым антиконвульсантом [1, 2]. Преимуществом вальпроатов является возможность их использования при эпилепсии различных форм, основными недостатками - нелинейность фармакокинетики и недостаточная безопасность. Путем химической модификации структуры вальпроевой кислоты разрабатываются вальпроа-ты новой генерации с улучшенным профилем безопасности [3-5]. Получены противоэпилепти-ческие средства среди тиадиазоловых производных вальпроевой кислоты [6]. Синтезирован оригинальный 1,3,4-тиадиазолиламид вальпроевой кислоты (К-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-
пропилпентанамид) с лабораторным наименованием — вальпразоламид [7]. Экспериментально показано наличие у него противоэпилептической активности [8]. Для исследования фармакокинетики перспективного противоэпилептического средства необходима разработка аналитической методики количественного определения в биологических объектах.
Цель исследования — разработка методики ВЭЖХ-масс-спектрометрического определения нового производного вальпроевой кислоты и 1,3,4-тиадиазола в плазме крови кроликов и оценка ее соответствия валидационным критериям.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для количественного определения вальпразо-ламида (N-(5 -этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-
пропилпентанамид) использовали хроматограф Agilent 1260 Infinity (Agilent, Германия) с масс-спектрометром ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Сингапур). Результаты анализировали с помощью программного обеспечения Analyst MD 1.6.2. Software (ABSciex, Сингапур).
Методику валидировали по требованиям отечественных и международных рекомендаций [9— 11]. Оценивали селективность (selectivity), перенос пробы (carry over), матричный эффект (matrix effect), линейность (linearity), правильность (accuracy), прецизионность (precision). Нижний предел количественного определения (НПКО, LLOQ) и предел обнаружения вальпразоламида определяли по его минимальной концентрации, для которой соотношения сигнал/шум были соответственно более 10:1 и 3:1. В качестве внутреннего стандарта выбран ацетазоламид (N-[(5-аминосульфонил)-1,3,4-тиадиазол-2-ил]ацетамид,
CAS 59-66-5, Sigma Aldrich, США) - производное 1,3,4-тиадиазола, имеющее сходные с исследуемым 1,3,4-тиадиазолиламидом вальпроевой кислоты параметры хроматографирования.
В работе использовали пулированную плазму крови шести кроликов породы шиншилла. Для доказательства селективности методики в качестве бланка (double blank) использовали плазму крови кроликов без аналита и внутреннего стандарта. Селективность рассчитывали по формуле
АиС(бланк)
селективность,% = -
-100%.
АиС( НПКО аналита)
где АиС - площадь под хроматографическим пиком.
Для оценки переноса пробы осуществляли последовательный анализ плазмы крови с содержанием вальпразоламида 1000 нг/мл (максимальная концентрация), ацетазоламида 100 нг/мл (К -внутренний стандарт) и бланка.
После холостых проб (бланка) анализировали образцы плазмы крови, содержащие вальпразола-мид в концентрации, соответствующей НПКО. Вычисления выполняли по формулам:
перенос пробы (аналит),% = АИС(бланк)
АиС(НПКО аналита ) перенос пробы (IS),% =
100%,
АиС(бланк) AUC(IS)
100%.
Валидационными критериями являлись значения селективности и переноса пробы для анали-та не более 20%, для К - не более 5%.
При разработке калибровочного решения использовали 11 растворов вальпразоламида (от 1 до 1000 нг/мл), приготовленных на пулированной плазме, с трехкратным повторением анализов.
Статистическую обработку данных проводили методом наименьших квадратов. Оценивали наличие линейной зависимости (коэффициент корреляции более 0,99) аналитического сигнала от концентрации вещества в пробе.
Чтобы оценить правильность и прецизионность, исследовали по пять биологических образцов с уровнями вальпразоламида 1 нг/мл (НПКО), 10 нг/мл (низкая концентрация), 100 нг/мл (средняя концентрация), 1000 нг/мл (максимальная концентрация). Проводили внутрисерийный и межсерийный анализы.
Для определения матричного эффекта анализировали неэкстрагированные образцы плазмы крови шести подопытных животных с содержанием вальпразоламида 10 и 750 нг/мл, а также растворы аналита в ацетонитриле (стандартные образцы) с такой же концентрацией. Матричный эффект рассчитывали по формуле
матричный эффект,% =
МеапАиС(неэкстрагированные образцы)
=--100%.
МеапАиС(стандартные образцы)
Критерий приемлемости для данного показателя - не более 15%.
Степень извлечения вальпразоламида из плазмы крови (в процентах) оценивали по соотношению площадей пиков, полученных при анализе экстрагированных и неэкстрагированных образцов плазмы крови шести кроликов, к которым был добавлен вальпразоламид в концентрациях 10 и 750 нг/мл. Степень извлечения рассчитывали по формуле
степень извлечения,% =
МеапАиС(экстрагированный образец) 0,
=--100%,
МеапАиС(неэкстрагированный образец)
где Mean - среднее значение; AUC - площадь под пиком.
Стабильность исследуемых образцов оценивали после 24 ч их нахождения при температуре 15 °С, а также после трехкратной заморозки и разморозки проб. Критерием приемлемости считали изменение площади хроматографических пиков менее 10%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пробоподготовку осуществляли осаждением белков плазмы крови ацетонитрилом (АЦН). Для этого к 200 мкл плазмы крови кроликов добавляли 800 мкл АЦН. Пробы встряхивали на вортекс-шейкере, термостатировали 20 мин при 37 °С, центрифугировали 10 мин при 18000 об/мин и отбирали надосадочную жидкость.
Для хроматографического анализа были разработаны следующие параметры: неподвижная фаза - аналитическая колонка Phenomenex Synergi С18 4 мкм 2,0x50 мм, при температуре 40 °С; подвижная фаза - АЦН и вода деионизированная Milli-Q со следующим профилем градиента: 0-1 мин 10%-ный водный раствор АЦН; 1-3 мин линейное повышение концентрации АЦН в смеси до 90%; 3-4 мин изократический участок с концентрацией
АЦН 90%; 4-5 мин кондиционирование колонки 10%-ным раствором АЦН; скорость элюента -0,6 мл/мин; объем пробы - 20 мкл; время градиентного элюирования - 5 мин.
Масс-детектирование проводили при положительной поляризации (напряжение электроспрея 5500,0 В; потенциал декластеризации - 41,0; давление газа завесы - 20,0 psi, газа распыления -40,0 psi; потенциал ввода -3,5 В). MRM-переходы вальпразоламида составили m/z256,1^-m/z 130,1 и m/z81,0 (рис. 1).
Идентификацию ацетазоламида (внутреннего стандарта) осуществляли по значению MRM-перехода m/z 223,1^m/z73,0.
Предел обнаружения вальпразоламида в плазме крови составил 0,25 нг/мл (соотношение сигнал/шум 4,1:1), а НПКО - 1 нг/мл (соотношение сигнал/шум 12,3:1). Хроматограмма плазмы с концентрацией вальпразоламида на уровне НПКО представлена на рис. 2.
При оценке селективности на хроматограм-мах бланка не было обнаружено пиков площадью более 20% (аналит) и более 5% (IS) со временами удерживания, соответствующими временам удерживания вальпразоламида и ацетазоламида.
При оценке переноса пробы последовательно анализировали образцы плазмы крови с содержанием вальпразоламида 1000 нг/мл и ацетазоламида 100 нг/мл. Хроматограммы плазмы крови кроликов с вальпразоламидом и IS представлены на рис. 3.
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии переноса пробы.
При последующем введении образцов чистой плазмы крови на хроматограммах бланка не было обнаружено пиков площадью более 20% от НПКО аналита и 5% для IS, по времени удерживания, совпадающих с аналитом и IS соответственно (рис. 4).
При построении калибровочного графика использовали образцы с содержанием вальпразола-мида от 1 до 1000 нг/мл (рис. 5).
Калибровочное решение определяли уравнением у = 43 8х + 938 (коэффициент корреляции 0,9998), где х - содержание вальпразоламида (нг/мл), у - отношение площадей хроматографиче-ских пиков аналита и внутреннего стандарта.
Величина матричного эффекта при анализе проб с содержанием вальпразоламида 10 и 750 нг/мл не превышала 15%, а степень извлечения из плазмы крови составляла соответственно 94,6% (RSD 7,5%) и 97,2% (RSD 4,7%).
а)
Рис. 1. Масс-спектры вальпразоламида I (а) и II (б) порядков
Рис. 2. Хроматограмма плазмы крови с содержанием вальпразоламида на уровне НПКО (1 нг/мл) и ацетазоламида (IS) 100 нг/мл
Рис. 3. Хроматограммы плазмы крови: а - с вальпразоламидом (1000 нг/мл); б - с внутренним стандартом (ацетазоламид 100 нг/мл)
Рис. 4. Хроматограмма чистой плазмы крови (бланка) с указанием времени удерживания для вальпразоламида и ацетазоламида (IS)
Рис. 5. Калибровочный график для определения содержания вальпразоламида в плазме крови кроликов
Таблица. Правильность и прецизионность методики определения вальпразоламида
Аналит, нг/мл Внутри серии Между сериями
X±SD RSD, % е, % X±SD RSD, % е, %
1 1,08±0,07 6,48 7,40 1,10±0,08 7,27 9,09
10 9,84±0,28 2,84 -1,62 10,18±0,31 3,04 1,76
100 103,23±2,21 2,14 3,12 98,52±1,66 1,68 -1,50
1000 991,10±3,47 0,35 -0,89 990,35±2,85 0,289 -0,97
Точность и прецизионность методики доказывало соответствие значений относительного стандартного отклонения (RSD) и относительной погрешности (е) требованиям по валидации (таблица).
Исследуемые образцы сохраняли стабильность после 24 ч их нахождения при температуре 15 °С, а также в течение трех циклов заморозки и разморозки проб. При повторных анализах площадь хроматографических пиков изменялась менее чем на 10%.
ВЫВОДЫ
Методика ВЭЖХ-МС/МС определения валь-празоламида в плазме крови кроликов является селективной, точной, прецизионной и линейной, по всем параметрам соответствует валидационным требованиям. Аналитический диапазон методики позволяет использовать ее на этапе исследования экспериментальной фармакокинетики вальпразо-ламида.
ЛИТЕРАТУРА
1. Фрейдкова Н.В., Пылаева О.В., Мухин К.Ю. Вальпарин ХР в лечении эпилепсии (обзор литературы и описание клинических случаев). Русский журнал детской неврологии. 2015; 10(3): 37-42.
2. Perucca E. Pharmacological and therapeutic properties of valproate: a summary after 35 years of clinical experience. CNS Drugs. 2012; 16(10): 695-714.
3. Kaufmann D., Bialer M., Shimshoni J.A., Devor M., Yagen B. Synthesis and evaluation of antiallodynic and anticonvulsant activity of novel amide and urea derivatives of valproic acid analogues. J. Med. Chem. 2009. Nov 26; 52(22): 7236-7248.
4. Pessah N., Yagen B., Hen N., Shimshoni J.A., Wlodarczyk B., Finnell R.H., Bialer M. Design and pharmacological activity of glycinamide and N-methoxy amide derivatives of analogs and constitutional isomers of valproic acid. Epilepsy Behav. 2011 Nov; 22(3): 461-468.
5. Trojnar M.K., Wierzchowska-Cioch E., Krzyzanowski M., Jargiello M., Czuczwar S.J. New generation of valproic acid. Pol. J. Pharmacol. 2004 May-Jun; 56(3): 283-288.
6. Jain A.K., Sharma S., Vaidya A., Ravichandran V., Agrawal R.K. 1,3,4-Thiadiazole and its Derivatives: A Review on Recent Progress in Biological Activities. ^em. Biol. Drug. Des. 2013; 81: 557-576.
7. Патент РФ № 2 672 887. 13.03. 2018. Щ5-Этил-1,3,4-ти-адиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид, обладающий противо-эпилептической и обезболивающей активностями. Ска-чилова С.Я., Малыгин А. С., Попов Н.С., Демидова М.А.; владелец патента: «Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ».
8. Malygin A.S., Demidova M.A., Skachilova S.Ya., Shilova E.V. Synthesis of a novel amide derivative of valproic acid and 1,3,4-thiadiazole with antiepileptic activity .Bulletin of RSMU. 2020;1: 75-80.
9. Береговых В.В. Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств. М.: Лит-терра. 2008; 18-65.
10. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research ^DER), US Government Printing Office, Washington, DC 2001.
11. Guidance on the Investigation of Bioequivalence. European Medicines Agency (EMA). Committee for Medicinal Products of Human Use (OTMP). 2010.
Поступила 19 октября 2019 г.
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HPLC-MS/MS METHOD OF DETERMINATION OF A NEW DERIVATIVE OF VALPROLEIC ACID AND 1,3,4-THIADIAZOLE IN RABBIT BLOOD PLASMAFOR PHARMACOKINETIC STUDY
© Authors, 2020 A.S. Malygin
Post-graduate Student, Tver State Medical University (Tver) ORCID ID 0000-0003-1955-5105 E-mail: tgmu-nauka@mail.ru N.S. Popov
Ph.D. (Pharm.), Assistant, Tver State Medical University (Tver) ORCID ID 0000-0002-1792-7414 M.A. Demidova
Dr.Sc. (Med.), Professor, Tver State Medical University (Tver) ORCID ID 0000-0002-0270-8809 N.A. Shatokhina
Ph.D. (Med.), Associate Professor, Tver State Medical University (Tver) ORCID ID 0000-0001-6970-1313
Objective. To develop and validate the HPLC-mass spectrometric method for determining a new derivative of valproic acid and 1,3,4-thiadiazole in rabbit plasma.
Material and methods. The object of the study was N-(5-ethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl) -2-propylpentanamide (valprazolamide) - a new antiepileptic drug from the group of thiadiazole derivatives of valproic acid. Valprazolamide was determined in rabbit plasma using an Agilent 1260 Infinity II high performance liquid chromatograph (Agilent Technologies, Germany). An AB Sciex QTrap 3200 MD triple quadru-pole mass spectrometer (AB Sciex, Singapore) with an electrospray ion source (Turbo V with a TurboIonSpray probe) was used as a detector. Selectivity, carry over, linearity, accuracy, precision, matrix effectand recovery were evaluated for the developed method. Results. A method of HPLC-mass spectrometric determination of valprazolamide in rabbit plasma was developed (Phenomenex Syner-gi C18 analytical column 4 pm 2.0 x 50 mm, gradient elution: 0-1 minute 10% aqueous acetonitrile solution; 1-3 minutes linear increase in concentration acetonitrile in a mixture up to 90%; 3-4 minutes isocratic section with an acetonitrile concentration of 90%; 4-5 minutes conditioning the column with a 10% solution; flow rate of the mobile phase - 0.6 ml / min; volume of sample injected -20 pl; total time gradient elution - 5 min t; mass spectrometric detection). Mass detection conditions: positive polarization, voltage of the electrospray 5500.0 V, declustering potential 41.0; the curtain gas pressure is 20.0 psi, the spray gas is 40.0 psi, the input potential is 3.5 V. The MRM transitions for valprazolamide were m/z 256.1 ^ m/z 130.1 and m/z 81.0. Acetazolamide (m/z 223.1 ^ m/z 73.0) was used as an internal standard.
Conclusion. The analytical range of the method for determining valprazolamide is 1-1000 ng/ml. The developed method is selective, accurate, precision and linear, it meets the requirements for the validation of bioanalytical methodsin all respects. Key words: HPLC-MS/MS, valproic acid, 1,3,4-thiadiazole, antiepileptic drugs, mass spectrometry.
For citation: Malyqin A.S., Popov N.S., Demidova M.A., Shatokhina N.A. Development and validation of HPLC-MS/MS method of determination of a new derivative of valproleic acid and 1,3,4-thiadiazole in rabbit blood plasmafor pharmacokinetic study. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(8):26-33. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-08-04
REFERENCES
1. Frejdkova N.V., Pylaeva O.V., Muhin K.Ju. Val'parin HR v lechenii jepilepsii (obzor literatury i opisanie klinicheskih sluchaev). Russkij zhurnal detskoj ne-vrologii. 2015; 10(3): 37-42.
2. Perucca E. Pharmacological and therapeutic properties of valproate: a summary after 35 years of clinical experience. CNS Drugs. 2012; 16(10): 695-714.
3. Kaufmann D., Bialer M., Shimshoni J.A., Devor M., Yagen B. Synthesis and evaluation of antiallodynic and anticonvulsant activity of novel amide and urea derivatives of valproic acid analogues. J. Med. Chem. 2009. Nov 26; 52(22): 7236-7248.
4. Pessah N., Yagen B., Hen N., Shimshoni J.A., Wlodarczyk B., Finnell R.H., Bialer M. Design and pharmacological activity of glycinamide and N-methoxy amide derivatives of analogs and constitutional isomers of valproic acid. Epilepsy Behav. 2011 Nov; 22(3): 461-468.
5. Trojnar M.K., Wierzchowska-Cioch E., Krzyzanowski M., Jargietto M., Czuczwar S.J. New generation of valproic acid. Pol. J. Pharmacol. 2004 May-Jun; 56(3): 283-288.
6. Jain A.K., Sharma S., Vaidya A., Ravichandran V., Agrawal R.K. 1,3,4-Thiadiazole and its Derivatives: A Review on Recent Progress in Biological Activities. Chem. Biol. Drug. Des. 2013; 81: 557-576.
7. Patent RF № 2 672 887. 13.03. 2018. N-(5-Jetil-1,3,4-ti—adiazol-2-il)-2-propilpentanamid, obladajushhij protivo-jepilepticheskoj i obezbolivajushhej ak-tivnostjami. Skachilova S.Ja., Malygin A. S., Popov N.S., Demidova M.A.; vladelec patenta: «Vsesojuznyj nauchnyj centr po bezopasnosti biologicheski aktivnyh veshhestv».
8. Malygin A.S., Demidova M.A., Skachilova S.Ya., Shilova E.V. Synthesis of a novel amide derivative of valproic acid and 1,3,4-thiadiazole with antiepileptic activity.Bulletin of RSMU. 2020;1: 75-80.
9. Beregovyh V.V. Validacija analiticheskih metodik dlja proizvoditelej lekarstv. Tipovoe rukovodstvo predprijatija po proizvodstvu lekarstvennyh sredstv. M.: Litterra. 2008; 18-65.
10. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER), US Government Printing Office, Washington, DC. 2001.
11. Guidance on the Investigation of Bioequivalence. European Medicines Agency (EMA). Committee for Medicinal Products of Human Use (CHMP). 2010.
