CC BY
116
© Коллектив авторов,2018
DOI: 10.17749/2077-8333.2018.10.2.035-042
ISSN 2077-8333
Определение вальпроевой кислоты и ее метаболитов в плазме крови методом вЭжх-масс-спектрометрии
(ВЭЖХ-МС/МС)
Малыгин А. С., Попов Н. С., Демидова М. А, Кудряшова М. Н.
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тверской государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ул. Советская, 4, Тверь 170100, Россия)
Нг
к i
<9 Л X о
is a IS Л
Е
ф
О
ю
X £
К в-
Е S
* S
* §
* г
и ч
ф 2
ф
и
S
h
: s
eg N
ц ©
х £
О '¡1
И >
J &■
Е О
о о
Е .
о з
к Т
Е <л «Б
0 .!=
¡F ®
V о
т 'S
<s ,Е
х ..
is ¡s
Ч
ф Е
е с
ш * = ÜT
■ о
Ü 4
fi & (0
ф " " in
® i
1 f*
i*.
T: E & Ф
Резюме
Цель - разработка методики ВЭЖХ-МС/МС определения вальпроевой кислоты и ее метаболитов в плазме крови для терапевтического лекарственного мониторинга. Материалы и методы. Хроматографию выполняли с использованием хроматографа Agilent 1260 Infinity II (аналитическая колонка Phenomenex synergi Fusion 4 мкм-С182x50 мм). В качестве подвижной фазы использовали смесь метанола и воды деионизированной в соотношении 90:10 с добавлением 0,1% аммония ацетата в изократическом режиме, скорость потока подвижной фазы - 0,5 мл/мин. Масс-спектрометрическую идентификацию вальпроевой кислоты осуществляли при отрицательной поляризации в режиме регистрации множественных ионов (MIM) по значению m/z 143,1. Диапазон применения методики составил от 1 до 200 мкг/мл. Масс-спектрометрическую идентификацию 2-пропил-4-пентаноил-$-О-глюкуронида, 2-пропил-4-пентеновой, 3-гидрокси-2-пропилпентановой, 4-гидрокси-2-пропилпентановой, 2-пропилпентандиовой и 3-оксо-2-пропилпентановой кислот осуществляли при отрицательной поляризации по значению MRM-переходов: m/z 319,2^143,2; m/z 140,1^140,1; m/z 159,1^101; m/z 159,1^123,1; m/z 173^129,1; 157,05^113 соответственно. Аналитический диапазон методики определения метаболитов составил 10-500 нг/мл. Результаты. Разработанная методика позволяет определять вальпроевую кислоту и ее метаболиты в одной пробе без отдельной пробоподготовки, что увеличивает информативность исследования без повышения его стоимости. Заключение. Внедрение методики количественного определения вальпроевой кислоты и ее метаболитов в плазме крови в работу клинических лабораторий позволит обеспечить индивидуальный подход к лечению пациентов с эпилепсией, тем самым повысив эффективность и безопасность фармакотерапии.
Ключевые слова
ВЭЖХ-МС/МС, противоэпилептические средства, вальпроевая кислота, метаболиты, лекарственный терапевтический мониторинг.
Статья поступила: 16.03.2018 г.; в доработанном виде: 17.04.2018 г.; принята к печати: 18.06.2018 г. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данной публикации. Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Для цитирования
Малыгин А. С., Попов Н. С., Демидова М. А., Кудряшова М. Н. Определение вальпроевой кислоты и ее метаболитов в плазме крови методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС). Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2018; 10 (2): 35-42. DOI: 10.17749/2077-8333.2018.10.2.035-042.
Chromatography-tandem MASS spectrometry (HPLC-MS/MS) for the detection of valproic acid and its metabolites in blood plasma
Malygin A. S., Popov N. S., Demidova M. A., Kudrayshova M. N. Tver State Medical University (4 Sovetskaya Str., Tver 170100, Russia)
Л *
3¡|
и Ф
is а X м
I Í
S т
о >
« 5
и
Ю О
* £
I- о
IS S
5 I а &
® Е М ф
н а
х 0 о. о
н
s I
¡I
х4
IS X EIS
и пароксизмальные состояния
Summary
Aim: to adapt the HPLC-MS/MS technique to determining valproic acid and its metabolites in blood plasma for drug therapy monitoring. Materials and Methods: The chromatographic assay was run using an Agilent 1260 Infinity II chromatograph with a Phenomenex synergi Fusion analytical column 4 ¡jm-C182x50 mm. The mobile phase consisted of 0.1% ammonium acetate in distilled water and 0.1% ammonium acetate in methanol (10:90 v/v, 0.5 ml/min). The multiple ions monitoring (MIM) mode was used for mass-spectrometric detection of valproic acid at m/z = 143.1, with the negative ion mode. The method was found applicable over the range from 1 mcg/ml to 200 mcg/ml of valproic acid. For the mass spectroscopy detection of valproic acid metabolites, the multiple reaction monitoring (MRM mode) was used. MS identifications of 2-propyl-4-pentanoil-fi-0-glucuronide; 2-propyl-4-pentenoic acid, 3-hydroxy-2-propylpentanoic acid, 4-hydroxy-2-propylpentanoic acid, 2-propylglutaric acid and 3-oxo-2-propylpentanoic acid in the negative ion mode were carried out at m/z 319.2^143.2; m/z 140.1^140.1; m/z 159.1^101; m/z 159.1^123.1; m/z 173^129.1 and m/z 157.05^11, respectively. The method was sensitive over the range from 10 ng/ml to 500 ng/ml of the tested compounds. Results: The developed technique allows for determining valproic acid and its metabolites in a single sample; thus, the preliminary stage of separate sample preparation can be omitted, which increases the informative value of the assay without increasing its cost. Conclusion: This innovative methodology for the quantification of valproic acid and its metabolites in the blood plasma is expected to facilitate the individual approach to the treatment of patients with epilepsy, thereby increasing the efficacy and safety of the pharmacotherapy.
Key words
HPLC-MS/MS, antiepileptic drugs, valproic acid, metabolites, drug therapy monitoring. Received: 16.03.2018; in the revised form: 17.04.2018; accepted: 18.06.2018. Conflict of interests
The authors declare about the absence of conflict of interest with respect to this publication. All authors contributed equally to this article. For citation
Malygin A. S., Popov N. S., Demidova M. A., Kudrayshova M. N. Chromatography-tandem MASS spectrometry (HPLC-MS/MS) method for the detection of valproic acid and metabolites in blood plasma. Epilepsiya i paroksizmal'nye sostoyaniya / Epilepsy and paroxysmal conditions. 2018; 10 (2): 35-42. DOI: 10.17749/2077-8333.2018.10.2.035-042. (in Russian).
Corresponding author
Address: 4 Sovetskaya Str., Tver 170100, Russia. E-mail address: shurik.malygin@mail.ru (Malygin A. S.).
Введение
Необходимость проведения лекарственного терапевтического мониторинга при лечении противоэпи-лептическими препаратами, в т.ч. вальпроатами, доказана многочисленными исследованиями [1-5] и регламентирована нормативными документами (Приказ МЗ РФ от 22.10.2003 №494) [6]. Фармакоки-нетика вальпроатов характеризуется выраженным индивидуальным характером, развитие токсических реакций возможно даже при их использовании в средних терапевтических дозах, особенно у пациентов с генетически замедленным метаболизмом, что подтверждает важность лекарственного терапевтического мониторинга [5,7-8]. Основными показаниями к определению концентрации вальпроевой кислоты в крови являются первичное назначение препарата (с целью подбора дозировки), изменение дозы препарата, смена торгового наименования и лекарственной формы (например, при переходе на пролонгированные препараты), назначение новой комбинации противоэпилептических средств, неэффективность проводимой терапии, появление побочных
к и h 2 к
I
<9 Л X о
я а <9 Л
Е
ф
О
ю
X £
К в-
Е S
* S
* §
* г
и ч
ф 2
ф
и
эффектов, подозрение на нарушение режима приема препарата, текущий контроль концентрации в крови (1-2 раза в год), беременность (в соответствии с официальной инструкцией по применению противопоказаны в I триместре из-за тератогенности, во II и III триместре разрешены в меньших дозах и по серьезным показаниям), у детей младшего возраста в связи с быстрым изменением массы тела (1 раз в 3 месяца).
Учитывая высокую потребность в проведении лекарственного терапевтического мониторинга вальпроатов, необходимо наличие специфичной, точной, небольшой по продолжительности и объему исследуемого биологического материала, по возможности недорогой методики количественного определения вальпроевой кислоты в плазме крови. В настоящее время одним из наиболее эффективных методов проведения аналитических исследований лекарственных средств является высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометри-ческим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) [9,10]. Преимуществом данного метода для клинической практики при проведении лекарственного терапевти-
s
h : s
eg (ч £ ©
1 £ в m
о t и >
J £ е о о о
Е .
о з
к Т
Е <л «Б
0 ±
IF ®
V о
т 'S
я ,Е
х ..
8 Е
Ч
ф Е
Е С
<1> *
= 1Я
■ О
ü 4 ■р
& «в ф ~
® S
1 f*
i*.
'S E
а Ф
зЦ
и Ф
с » X са
! * S т
о >
« 5
и
Ю О
* £
I- о
Я 2
5 I a &
® Е М ф
н а
® л X 0
о. о
н
s I ¡1 х4
IS X EIS
ческого мониторинга является возможность определения не только вальпроевой кислоты, но и ее метаболитов [11,12].
Целью исследования явилось определение валь-проевой кислоты и ее метаболитов в плазме крови ВЭЖХ-масс-спектрометрическим методом при проведении лекарственного терапевтического мониторинга.
Материалы и методы
Забор крови для определения вальпроевой кислоты и ее метаболитов осуществляли из кубитальной вены с помощью вакуумных систем BD Vacutainer® с К3ЭДТА («Бектон Дикинсон Б.В», Нидерланды). Для получения плазмы образцы крови центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Пробоподго-товку осуществляли осаждением белков плазмы крови метанолом. Для этого к 200 мкл исследуемого образца добавляли 600 мкл метанола с 0,1% аммония ацетата. Пробы встряхивали на вортекс-шейкере в течение 30 сек., термостатировали 20 мин. при температуре 37оС, далее центрифугировали в течение 10 мин. при 13000 об./мин., надосадочную жидкость использовали для исследования.
При первичном назначении вальпроатов исследование проводили после достижения равновесной концентрации в крови (не менее 5 периодов полувыведения - 2-3 дня, так как Т1/2 вальпроевой кислоты составляет 9-16 ч). Для определения минимальной равновесной концентрации (Cmin) забор крови осуществляли до приема вальпроата, для оценки максимальной плазменной концентрации (Cmax) исследование выполняли через 1-3 ч после.
Определение вальпроатов в плазме крови осуществляли с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies, ФРГ). Для анализа образцов плазмы крови использовали следующие условия хромато-графирования: неподвижная фаза - аналитическая колонка Phenomenex synergi Fusion 4 мкм-С18 2x50 мм при температуре 50оС; подвижная фаза - смесь метанола и воды деионизированной в соотношении 90:10 с добавлением 0,1% аммония ацетата; скорость потока подвижной фазы - 0,5 мл/мин.; объем вводимой пробы - 10 мкл; общее время изократического элюирования - 5 мин.
Детекцию вальпроевой кислоты и ее метаболитов осуществляли масс-спектрометрически с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра AB Sciex QTrap 3200 MD (AB Sciex, Сингапур) с электрораспылительным источником ионов (Turbo V с зондом TurboIonSpray). Для получения устойчивой масс-спектрограммы использовали следующие условия детектирования: отрицательная поляризация, напряжение электроспрея - 4500,0 В, потенциал декластеризации - 45,0 В; при давлении газа завесы 20,0 psi и газа распыления 40,0 psi, потенциал ввода - 9,0 В.
Методика ВЭЖХ-масс-спектрометрического определения вальпроатов в плазме крови была валидиро-вана в соответствии с отечественными и международными рекомендациями по валидации биоаналитических методов [13,14] по критериям селективности, правильности, линейности, прецизионности, стабильности и кросс-переноса. Предел обнаружения вальпроевой кислоты при масс-детектировании в режиме MIM был равен 0,5 мкг/мл (соотношение сигнал/шум - 4,3:1), а нижний предел количественного определения - 1 мкг/мл (соотношение сигнал/ шум - 11,4:1). Аналитический диапазон методики составил 1-200 мкг/мл. В данном диапазоне отмечалась линейная зависимость аналитического сигнала от концентрации вальпроевой кислоты в анализируемой пробе (r2=0,9999). Эта зависимость описывается следующим уравнением: у=29,4х+2650, где х - концентрация вальпроевой кислоты мкг/мл, у - величина аналитического сигнала. Учитывая тот факт, что терапевтическая концентрация вальпроевой кислоты в плазме крови в среднем составляет 50-100 мкг/мл, аналитический диапазон методики позволяет использовать ее для лекарственного терапевтического мониторинга. Аналитический диапазон методики определения метаболитов вальпроевой кислоты (2-пропил-4-пентеновой, 3-гидрокси-2-пропилпента-новой, 4-гидрокси-2-пропилпентановой, 2-пропил-пентадиовой и 3-оксо-2-пропилпентановой кислот) составил 10-500 нг/мл.
В качестве программного обеспечения использовали Analyst MD 1.6.3.Software (AB Sciex).
Результаты и обсуждение
Идентификацию вальпроевой кислоты и ее метаболитов осуществляли масс-спектрометрически по значению MRM-переходов. С этой целью в начале исследования получали масс-спектры путем прямого ввода исследуемых образцов в масс-детектор с помощью шприцевого насоса. В качестве растворителя использовали метанол с 0,1% аммония ацетата.
Детекцию вальпроевой кислоты при ее количественном определении осуществляли в режиме регистрации множественных ионов (MIM) при отрицательной поляризации. Применение режима MRM (мониторинга множественных реакций) для определения вальпроевой кислоты считали нецелесообразным, так как она не фрагментируется на ионы-продукты на втором квадруполе и ее масс-спектры первого и второго порядков являются одинаковыми (m/z 143,1 —>143,1) (рис. 1).
Учитывая, что в процессе метаболизма вальпрое-вой кислоты образуется большое количество промежуточных и конечных продуктов, на предварительном этапе исследования среди множества метаболитов отбирали наиболее значимые для лекарственного терапевтического мониторинга.
Известно, что вальпроевая кислота в организме человека метаболизируется преимущественно в пе-
Нг
к
I
is а. х о
IS а с а. с
ф о ю
X ?
К в-
Е S
И
5 U
* г
U ч
ф 2
«
и
S
Ï5
a f4
g ©
1 £
в m
о t
и >
J £
Е О
О О
Е .
о з
к Т
Е <Л
«Б
0 ±
ï ® V о
is ,Е X ..
8 ¡s
Ч
« Е
Е 5
ф «
з= m ■ о
14 ■р
& (0 ф ~
® !
1 f*
Tï Е а «
SE
si
0 «
я а X м
1 * s р
о >
« 5 = ^
ш Î
* £ H О
Ü S
ё S
s X а &
® Е M ф
н а
х 0 а о
18 i I*
х*
IS X EIS
и пароксизмальные состояния
Рисунок 1. Масс-спектр 1 и 2 порядков вальпроевой кислоты [M-H]- (в режиме сканирования отрицательно заряженных ионов).
Figure 1. First and second order mass spectra of valproic acid [M-H]- (in the mode of negatively charged ions scanning).
чени по нескольким направлениям: путем конъюгации с глюкуроновой кислотой (до 50%), с помощью ß-окисления жирных кислот в митохондриях (до 40%) и внемитохондриального ш-окисления при участии цитохрома Р450 (до 10%), менее 5% вальпроевой кислоты выделяется в неизмененном виде через почки с мочой [15].
Ряд метаболитов вальпроевой кислоты (особенно продукты ш-окисления), являясь высоко реакцион-носпособными, обладают выраженной токсичностью. Скорость и направление метаболизма вальпроевой кислоты зависит от активности ферментных систем организма, что, в свою очередь, может быть генетически детерминировано (например, наибольшее клиническое значение для метаболизма вальпроевой кислоты имеет ген CYP2C9, мутантные варианты которого вызывают замедление метаболизма вальпроатов. По особенностям метаболизма выделяют следующие группы: распространенные метаболи-
к и h 2 к
I
<9 Л X о
is а <9 Л
Е
«
О
ю
X ?
К в-
Е S
* S
* £
* г
и ч
ф 2
«
и
заторы вальпроевой кислоты - гомозиготные носители полиморфного аллельного варианта гена CYP2C9; медленные метаболизаторы - гетерозиготные носители мутантных аллельных вариантов генов CYP2C9; сверхмедленные метаболизаторы - гомозиготные носители полиморфных мутантных аллельных вариантов генов CYP2C9 или их гетерозиготной комбинации [7]), варьировать в различных возрастных группах, изменяться при заболеваниях печени, зависеть от особенностей питания, применения лекарственных препаратов, влияющих на активность ферментов, участвующих в метаболизме вальпрое-вой кислоты и др. В связи с тем, что на метаболизм вальпроатов влияют различные факторы, одного генетического исследования для оценки лекарственного метаболизма недостаточно и весьма актуальным при проведении лекарственного терапевтического мониторинга представляется определение наиболее значимых метаболитов.
s
* S
eg (ч g ©
1 £ в m
о t и >
J £ Е О О О Е .
о з
к Т
Е <Л
«Б
0 ±
ï ® V о
•s ,Е X ..
IS ¡S
Ч
« Е
Е d
(И * = ÙT
■ о
1 4 fi & (в
(U "
® ! i f*
i*.
Tï Е а «
Рисунок 2. Масс-спектр 1-го и 2-го порядков 2-пропил-4-пентаноил-р-О-глюкуронида [M-H]- (в режиме сканирования отрицательно заряженных ионов).
Figure 2. First and second order mass spectra of 2-propyl-4-mpentanoyl-p-O-glucuronide [M-H]- (in the mode of negatively charged ions scanning).
si
и «
IS a
x eg
I*
S P
0 > « 5
И
Ю О * g
H о
IS S
S Я
1 I a &
® E M Ф
н a
x 0 a. <5
!S I ¡1 x4
IS X EIS
Рисунок 3. Масс-спектр 1-го порядка метаболитов вальпроевой кислоты (2-пропил-4-пентеновой, 3-гидрокси-2-пропилпентановой, 4-гидрокси-2-пропилпентановой, 2-пропилпентандиовой и 3-оксо-2-пропилпентановой кислот) в режиме сканирования отрицательно заряженных ионов.
Figure 3. First-order mass spectra of valproic acid metabolites (2-propyl-4-pentenoic acid, 3-hydroxy-2-propylpentanoic acid, 4-hydroxy-2-propylpentanoic acid, 2-propylpentandioic acid and 3-oxo-2-propylpentanoic acid) in the mode of negatively charged ions scanning.
Основным метаболитом вальпроевой кислоты является продукт ее конъюгации с глюкуроновой кислотой - 2-пропил-4-пентаноил^-О-глюкуронид (VPA-G). Глюкуронирование вальпроевой кислоты протекает с участием косубстрата уридиндифосфата (УДФ) глюкуроновой кислоты при участии фермента УДФ-глюкуронозилтрансферазы (UDP 1-9; 1-3; 1-4; 1-10; 1-8; 1-6; 2B7; 2B15 [15]). Глюкуронидные конъю-гаты вальпроевой кислоты нетоксичны, являются полярными соединениями, растворимы в воде, выводятся из организма через почки с мочой. Идентификацию 2-пропил-4-пентаноил^-О-глюку-ронида осуществляли по значению MRM-перехода (m/z 319,2^143,2) при отрицательной поляризации ([M-H]-) (рис. 2).
Ключевым метаболитом Р450-зависимого пути метаболизма вальпроевой кислоты в эндоплазмати-ческом ретикулуме является 2-пропил-4-пентеновая кислота (4-en-VPA). В образовании этой ненасыщенной жирной кислоты принимают участие CYP2C9, CYP2A6 и CYP2B6. Под влиянием этих же ферментов происходит образование 5-гидрокси-2-пропилпен-тановой кислоты (5-OH-VAP, которая превращается в 2-пропилпентандиовую (2-пропилглутаровую) кислоту (2PGA)) и 4-гидрокси-2-пропилпентановой кислот (4-OH-VAP превращается в 4-оксо-2-пропилпента-новую кислоту, а далее - в 2-пропилбутандиовую (2-пропилянтарную) кислоту). С помощью CYP2A6
вальпроевая кислота окисляется до 3-гидрокси-2-пропилпентановой кислоты (3-OH-VAP). Кроме того, из вальпроевой кислоты могут образовываться следующие непредельные жирные кислоты 2-пропил-2-пентеновая кислота (2-en-VPA), (3Е)2-пропил-3-пентеновая кислота ((3E)-3-en-VAP), ^)2-пропил-
3-пентеновая кислота ((3Z)-3-en-VAP) и 2-пропил-2,4-пентадиеновая кислота (2,4-dien-VPA).
В качестве индикаторных метаболитов для лекарственного терапевтического мониторинга были выбраны 2-пропил-4-пентеновая кислота, 2-пропил-пентандиовая кислота, образующаяся из 5-гидро-кси-2-пропилпентановой кислоты (промежуточного продукта метаболизма вальпроевой кислоты);
4-гидрокси-2-пропилпентановая кислота; 3-гидро-кси-2-пропилпентановая кислота и продукт ее метаболизма 3-оксо-2-пропилпентановая кислота (этот метаболит образуется также в процессе митохондри-ального р-окисления). Для каждого метаболита были получены масс-спектры и определены MRM-переходы: 2-пропил-4-пентеновая кислота (m/z 140,1 —>140,1); 3-гидрокси-2-пропилпентановая кислота (m/z 159,1—101); 4-гидрокси-2-пропилпента-новая кислота (m/z 159,1—123,1); 2-пропилпентадио-вая кислота (m/z 173—129,1); 3-оксо-2-пропилпента-новая кислота (m/z 157,05—113) (рис.3).
Предложенные условия высокоэффективной жидкостной хроматографии являлись универсальными
Нг
к
I
is а х о
IS а is а с
ф о ю
* Ï
К в-
E S
И
5 «
X £
и ч
ф 2
«
и
S
a N
g ©
1 £
о 1=
и >
J &■
E О
<3 о
E .
о з
к T
Е (Я
«S
о ±
ï ® V о
is ,E X ..
IS H
4
E I!
ID *
3= û> ■ e>
14
fi a te
" U>
® ï
5 i-
Tï E
a «
SE J
s t
0 «
я а
X м
1 * s р
о >
« 5
= ^
ш Î
* £
H О
¡s S
ё S
S X
а а
® is
м Ф
н а
х 0
а о
18 i
il х4
IS X EIS
и пароксизмальные состояния
А
В
С
Рисунок 4. Хроматограммы 3-окси-2-пропилпентановой кислоты (A), 2-пропилпентадиовая кислоты (В), 3-гидрокси-2-пропилпентановой кислоты (С) (плазма крови больного эпилепсией, получавшего препарат вальпроевой кислоты).
Figure 4. Chromatograms of 3-hydroxy-2-propylpentanoic acid (A), 2-propylpentadioic acid (B), 3-hydroxy-2-propylpentanoic acid (C) (blood plasma of a patient with epilepsy treated with valproic acid).
А
В
С
Рисунок 5. Хроматограммы 2-пропил-4-пентеновой кислоты (A), 4-гидрокси-2-пропилпентановой кислоты (В), 2-пропил-4-пентаноил^-О-глюкуронида (С) (плазма крови больного эпилепсией, получавшего препарат вальпроевой кислоты).
Figure 5. Chromatograms of 2-propyl-4-pentenoic acid (A), 4-hydroxy-2-propylpentanoic acid (B), 2-propyl-4-pentanoyl-ß-O-glucuronide (C) (blood plasma of a patient with epilepsy treated with valproic acid).
к и h 2 к
I
is а X о
IS а с а
Е
«
О
ю
х £
R В-
Е S
* S
* £
* г
и ч
ф 2
«
и
s * s
eg N g ©
1 £
о 1=
и >
J £ Е О
<3 О
Е .
о з
к Т
Е (Я
«s
0 ±
ï ® V о
is ,Е X ..
is 5
Ч
« E
!s d
<u *
= rn ■ «
1 4
i* a te <D ~
® !
i ■:
Tï E
a «
iU
S I
u «
IS a X и
is *
S т
0 >
« 5 = ^
ш *
* £ H О
Ü S
ё ¡S
1 SE
а а
» Е M ф
н а
х 0
а о 18 |
I I
х*
IS X EIS
для вальпроевой кислоты и ее метаболитов. Общее время изократического элюирования не превышало 2 мин. для всех исследованных метаболитов. На рисунках 4-5 показаны хроматограммы плазмы крови пациента, получавшего вальпроевую кислоту (перед приемом очередной дозы вальпроата).
Таким образом, анализ результатов проведенного исследования показал, что разработанная и ва-лидированная методика ВЭЖХ-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) позволяет определять вальпроевую кислоту и ее метаболиты в одной пробе (с использованием двух режимов масс-спектрометрической детекции - MIM и MRM), что существенно экономит время на проведение исследования, не требует отдельной пробоподготовки для каждого аналита, характеризуется небольшим объемом биологического материала для исследования (200 мкл плазмы крови на один анализ). Разработанная методика была апробирована для определения вальпроевой кислоты и ее метаболитов в плазме крови пациен-
тов с эпилепсией, получавших вальпроаты. Аналитический диапазон методики ВЭЖХ-МС/МС определения вальпроевой кислоты (1-200 мкг/мл) и метаболитов (10-500 нг/мл) позволяет использовать ее для лекарственного терапевтического мониторинга, так как у всех обследованных пациентов содержание вальпроевой кислоты и ее метаболитов было в пределах данных диапазонов. Внедрение методики количественного определения вальпроевой кислоты и ее метаболитов в плазме крови в работу клинических лабораторий позволит обеспечить индивидуальный подход к лечению пациентов с эпилепсией, тем самым повысив эффективность и безопасность фармакотерапии. В связи с тем, что данная методика не требует отдельной пробоподго-товки для определения метаболитов, а их идентификация обеспечивается только изменением режима детекции, ее внедрение позволит повысить информативность анализа, не увеличивая стоимость и продолжительность исследования.
Литература:
1. Айвазян С. О. Терапевтический лекарственный мониторинг антиконвульсантов у детей. Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2010; 2 (3): 2-7.
2. Батурин В. А., Батурина М. В., Котова А. А., Скрипнюк А. А. Рутинная практика терапевтического лекарственного мониторинга - некоторые итоги работы
в системе ОМС. Качественная клиническая практика. 2016; 1: 47-49.
3. Белоусов Ю. Б., Леонова М. В., Штейн-берг Л. Л., Тищенкова И. Ф. Терапевтический лекарственный мониторинг в реальной практике. Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2013; 3: 6-15.
4. Леонова М. В., Ивжиц М. А., Тищенкова И. Ф.и др. Терапевтический лекарственный мониторинг антиконвульсантов у детей в реальной практике. Эпилепсия
и пароксизмальные состояния. 2017; 9 (1): 26-34.
5. Якунина А. В., Повереннова И. Е. Роль терапевтического лекарственного мониторинга при использовании противоэпилептических препаратов. Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2016; 3: 66-73.
6. Приказ МЗ РФ от 22.10.2003 №494 «О совершенствовании деятельности врачей клинических фармакологов».
7. Шнайдер Н. А., Дмитренко Д. В. Хроническая интоксикация вальпроевой кислотой в эпилептологии: диагностика
и лечение. Неврология, нейропсихиа- 12.
трия, психосоматика. 2016; 8 (2): 94-99.
8. Sztajnkrycer M. D. Valproic acid toxicity: overview and management. J Toxicol Clin Toxicol. 2002; 40 (6): 789-801.
9. Попов Н. С., Малыгин А. С., Демидова М. А. Разработка ВЭЖХ-МС/МС-метода 13. для идентификации и количественного определения нового производного тиадиазола. Современные проблемы
науки и образования. 2017; 5: URL: www. science-education.ru/ru/article/ 14.
view?id=26988. Дата обращения: 12.03.2018.
10. Zhao M., Li G., Qiu F., Sun Y. Development and Validation of a Simple and Rapid UPLC-MS Assay for Valproic Acid and Its Comparison With Immunoassay and HPLC 15. Methods. Ther Drug Monit. 2016; 38 (2): 246-252.
11. Wen D., Chen Z., Yang C., Liu H. et al.
A rapid and simple HPLC-MS/MS method for the simultaneous quantification of
valproic acid and its five metabolites in human plasma and application to study pharmacokinetic interaction in Chinese epilepsy patients. J of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2018; 149 (5): 448-456.
Zhao M., Zhang T., Li G, Qiu F., Sun Y., Zhao L. Simultaneous Determination of Valproic Acid and Its Major Metabolites by UHPLC-MS/MS in Chinese Patients: Application to Therapeutic Drug Monitoring. J Chromatogr Sci. 2017; 55 (4): 436-444. Береговых В. В. Валидация аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств. М. 2008; 18-65. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER), US Government Printing Office, Washington, DC, 2001. Upendra A., Remmel A., Remmel P. Effect of Aging on Glucuronidation of Valproic Acid in Human Liver Microsomes and the Role of UDP-Glucuronosyltransferase UGT1A4, UGT1A8, and UGT1A10. Drug Metabolism and Disposition. 2009; 37 (1): 229-236.
ht
к
I
is л X о
IS а с л
Е
«
О
ю
X £
R В-
E S
* S
* £
* г
и ч
ф 2
«
и
S
* s
eg (ч g ©
1 £ в m
о t и >
J £ Е О О О Е .
о з
к Т
Е <Л
«Б
0 ±
ï ® V о
is ,Е X ..
is s
Ч
« Е
Е С
(И * = 1Я
■ о
ü 4 ■р
а (в ф ~
® !
1 f""
i*.
Tï E a «
si
и «
IS а X eg
I*
S I
о > « 5
И
ю g * g
Н о
¡s S
S X
а а
® Е M ф
н а X 0
о. о
н
s S
il х4
IS X EIS
References:
1. Ajvazyan S. O. Epilepsiya i paroksizmal'nye sostoyaniya / Epilepsy and paroxysmal conditions (in Russian). 2010; 2 (3): 2-7.
2. Baturin V. A., Baturina M. V., Kotova A. A., Skripnyuk A. A. Kachestvennaya klinicheskaya praktika (in Russian). 2016; 1: 47-49.
3. Belousov Yu.B., Leonova M. V., Shtejnberg L. L., Tishchenkova I. F. Epilepsiya i paroksizmal'nye sostoyaniya / Epilepsy and paroxysmal conditions (in Russian). 2013; 3: 6-15.
4. Leonova M. V., Ivzhic M. A., Tishchenkova I. F. et al. Epilepsiya i paroksizmal'nye sostoyaniya / Epilepsy and paroxysmal conditions (in Russian). 2017; 9 (1): 26-34.
5. Yakunina A. V., Poverennova I. E. Epilepsiya i paroksizmal'nye sostoyaniya / Epilepsy and paroxysmal conditions (in Russian). 2016; 3: 66-73. DOI: 10.17749/20 7 78333.2016.8.3.066-073.
6. The order of the Ministry of Health of the Russian Federation of 22.10.2003 № 494 "On the improvement of the activity of physicians of clinical pharmacologists"
10.
[Prikaz MZ RF ot 22.10.2003 №494 «O sovershenstvovanii deyatel'nosti vrachej klinicheskih farmakologov» 12.
(in Russian)].
Shnajder N. A., Dmitrenko D. V. Nevrologiya, nejropsihiatriya, psihosomatika (in Russian). 2016; 8 (2): 94-99.
Sztajnkrycer M. D. Valproic acid toxicity:
overview and management. J Toxicol Clin 13.
Toxicol. 2002; 40 (6): 789-801.
Popov N. S., Malygin A. S.,
Demidova M. A. Sovremennye problemy
naukii obrazovaniya (in Russian). 2017; 5:
URL: www.science-education.ru/ru/article/
view?id=26988. Accessed: 12.03.2018.
Zhao M., Li G., Qiu F., Sun Y. Development
and Validation of a Simple and Rapid 14.
UPLC-MS Assay for Valproic Acid and Its
Comparison With Immunoassay and HPLC
Methods. Ther Drug Monit. 2016; 38 (2):
246-252.
Wen D., Chen Z., Yang C., Liu H. et al. A
rapid and simple HPLC-MS/MS method for 15.
the simultaneous quantification of valproic
acid and its five metabolites in human
plasma and application to study
pharmacokinetic interaction in Chinese
epilepsy patients. J of Pharmaceutical and
и пароксизмальные состояния
Biomedical Analysis. 2018; 149 (5): 448-456.
Zhao M., Zhang T., Li G, Qiu F., Sun Y., Zhao L. Simultaneous Determination of Valproic Acid and Its Major Metabolites by UHPLC-MS/MS in Chinese Patients: Application to Therapeutic Drug Monitoring. J Chromatogr Sci. 2017; 55 (4): 436-444. Beregovyh V. V. Validation of analytical techniques for drug manufacturers. The typical management of the enterprise for the production of medicines [Validaciya analiticheskih metodik dlya proizvoditelej lekarstv. Tipovoe rukovodstvo predpriyatiya po proizvodstvu lekarstvennyh sredstv (in Russian)]. Moscow. 2008; 18-65. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER), US Government Printing Office, Washington, DC, 2001. Upendra A., Remmel A., Remmel P. Effect of Aging on Glucuronidation of Valproic Acid in Human Liver Microsomes and the Role of UDP-Glucuronosyltransferase UGT1A4, UGT1A8, and UGT1A10. Drug Metabolism and Disposition. 2009; 37 (1): 229-236.
к и h 2 к i <9 Л X о
я а <9 Л
Е
«
О
ю
X £
R В-
E s
Í s
* £
* г
и ч
ф 2
«
и
Сведения об авторах:
Малыгин Александр Сергеевич - ординатор кафедры фармакологии, клинической фармакологии, ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава России. E-mail: shurik.malygin@mail.ru.
Попов Никита Сергеевич - ассистент кафедры фармации, ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава России. E-mail: ns.popov@mail.ru.
Демидова Марина Александровна - д.м.н., профессор, заведующая кафедрой фармации, ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава России. Тел.: +7(4822)53-86-55. E-mail: demidova.m.a@mail.ru.
Кудряшова Марина Николаевна - к.б.н., доцент кафедры фармации, ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава России. E-mail: marinabstrv@rambler.ru.
About the authors:
Malygin Aleksandr Sergeevich - Resident-in-Training, Chair of Pharmacology & Clinical Pharmacology, Tver State Medical University. E-mail: shurik.malygin@mail.ru.
Popov Nikita Sergeevich - Assistant, Chair of Pharmacy, Tver State Medical University. E-mail: ns.popov@mail.ru.
Demidova Marina Aleksandrovna - MD, Professor & Head, Chair of Pharmacy, Tver State Medical University. Tel.: +7(4822)53-86-55. E-mail: demidova.m.a@mail.ru.
Kudrayshova Marina Nikolaevna - PhD (Biology), Associate Professor, Chair of Pharmacy, Tver State Medical University. E-mail: marinabstrv@rambler.ru.
S * s
eg (4 g ©
1 £ в m
о t и >
J £ E О О О Е .
о з
к Т
Е <Л
«Б
0 ±
ï ® V о
я ,Е X ..
8 ¡s
Ч
« Е
Е С
<1> *
= ÙT ■ «
ü 4 Р
а (в ф ~
® !
1 f""
i ■:
Tï E
а «
S !
0 «
я a X eg
1 * S т
0 >
« 5 =
ш *
* £ H о
я s
ё Я
1 X a a
® E M ф
н a X 0
a о
H
S S
I I
x4
Я X EIS
7
8.
9
