CC BY
9
УДК 628.394:576.851.315
Проф. Г. И. Сидоренко, канд. мед. наук Г. А. Багдасарьян, доктор мед. наук Ю. Г. Талаева, канд. мед. наук Р. М. Абиева, канд. биол. наук
Ш. И. Сатдыков (Москва)
ИЗУЧЕНИЕ БДЕЛЛОВИБРИО БАКТЕРИОВОРУС КАК ОДНОГО ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ САМООЧИЩЕНИЯ ВОДЫ ВОДОЕМОВ
Актуальнейшим вопросом санитарной микробиологии является изучение самоочищения воды водоемов от патогенной бактериальной и вирусной флоры и факторов, которые могут способствовать усилению этих процессов. В связи с этим существенный интерес имеет исследование нового микроорганизма — бделловибрио бактериоворус \ который, по-видимому, является одним из естественных биологических факторов самоочищения воды.
Настоящая работа посвящена изучению биологии бделловибрио, обследованию воды открытых водоемов и сточных вод на его наличие к выяснению роли этого микроорганизма в процессах самоочищения воды водоемов в отношении энтеральных бактерий и вирусов. Нами модифицирована методика выделения бделловибрио в чистой культуре и выделены 3 новых штамма бделловибрио (2 из сточной воды и 1 — из речной).
Для экспериментальных исследований была отработана методика накопления бделловибрио и получения чистой культуры в высоком титре. Бделловибрио выращивали на клетках Е. coli штамм АТСС № 7020 в солевой среде Гелен. Рост микроорганизма и повышение титра его контролировали 2 методами — по просветлению бактериальной взвеси, измеряемому на фотоэлектрокалориметре ФЭК-М-56, и по нарастанию титра (метод агаровых слоев). Очистку и концентрирование бделловибрио проводили путем центрифугирования и последовательного фильтрования через мембранные фильтры № 5 и 1. Конечный титр очищенной культуры составлял 1 млрд. микробных тел в 1 мл среды. Морфологическое исследование культуры проводили при помощи фазовоконтрастной микроскопии.
С целью нахождения оптимальных условий для получения бделловибрио с высоким титром определяли pH среды, необходимую для его роста и размножения. Штаммы х — ty и L — 1 бделловибрио выращивали на клетках Е. coli АТСС № 7020, суспендированных в солевой среде Гелен, с 11 вариантами pH (от 4,7 до 9,5). Среды с различными pH разливали в пробирки по 10 мл и в них вносили по 50 мл бделловибрио и 500 мл промытой культуры Е. coli. Пробирки помещали в термостат при 35° и ежедневно в течение 7—8 суток определяли рост и размножение бделловибрио 2 методами: 1) по просветлению бактериальной суспензии, измеряемой на ФЭК-М-56; 2) по бляшкообразующим единицам (БОЕ), определяемым двухслойным методом Грациа. Для этого использовали среду NB/10, в которую вместо питательного бульона Difco вводили мясную воду из расчета 10 мл в 1 л среды. На 2-е сутки определяли количество бделловибрио в 1 мл (по БОЕ).1*'
Исследованиями по определению оптимальной pH среды для роста и размножения бделловибрио (методом просветления бактериальной суспензии) установлено, что процент лизиса суспензии Е. coli в кислой (pH от 4,5 до 6,0) солевой среде Гелен составляет: для штамма L — 1 от 39 до 72%, а для штамма х — ty от 45 до 65%; в щелочной среде (pH от 8,0 до 9,5) для штамма L — 1 от 45 до 60% и для штамма х — ty от 40 до 50%; в нейтральной среде для обоих штаммов лизис составляет около 80%. Оба штамма бделловибрио достаточно хорошо лизируют суспензию Е. coli как в кислой, так и щелочной средах. Однако результаты, полученные по БОЕ, указывают, что число бляшек штамма L — 1 составляло отЗ —5х10к5 до 2 —
1 В последующем будет называться сокращенно «бделловибрио».
4х 10е, а для штамма х — ty — от 2—Зх 102 до 1—4х 104 как в кислой, так и щелочной среде. В нейтральной среде количество бляшек достигало 5— 6х 108. Отмеченные различия как в результатах применения метода просветления бактериальной суспензии, так и по БОЕ статистически достоверны. Для первого случая ¿=7,8, а для второго <=8,1; Я=0,001. Таким образом, для выращивания бделловибрио штаммов х — ty и L — 1с высоким титром удовлетворительной является pH среды в пределах 6,2—7,5 (оптимальная 7.0-7,2).
В литературе практически отсутствуют сведения о биологической активности бделловибрио. Ввиду его широкого распространения в природе для гигиенистов и санитарных микробиологов имеют большой интерес данные о вирулентности бделловибрио и его токсичности. Особого внимания заслуживают иммуногенные свойства микроорганизма, так как возможность получения специфических сывороток может быть использована для его индикации и идентификации.
Нами изучалось биологическое действие 2 штаммов бделловибрио — х — ty (полученного из института им. Луи Пастера, Франция) и L — 1 (выделенного из воды Люберецкой станции аэрации) — путем внутривенного и внутрибрюшинного заражения белых мышей, а также при помощи керато-конъюнктивальной пробы у морских свинок. Титр культуры был 1—5х Ю-9 клеток в 1 мл. Заражающие дозы 1 млрд., 500 млн., 250 млн., 125 млн. и 60 млн. взвеси клеток в 1 мл. В опыт брали 100 мышей: по 50 животных для внутривенного и внутрибрюшинного заражения, из них по 10 мышей на каждую дозу. Мыши весили 12—15 г. Каждой мыши внутривенно и внутри-брюшинно вводили по 1 мл взвеси бделловибрио. Было поставлено 3 опыта. Вирулентность штамма бделловибрио проверена на 300 мышах. Наблюдение за мышами велось в течение 7 суток. Штаммы х — ty и L — 1 оказались не вирулентны для белых мышей в сопоставлении с вирулентностью энтеропа-тогенных бактерий.
Для определения кератоконыонктивальной пробы у морских свинок использовали 2-суточную культуру бделловибрио с титром 1—5х10-в. Для 1 свинки брали по 2 капли взвеси клеток бделловибрио; в опыте было 18 животных. Наблюдение за ними проводили в течение 2 недель. Ежедневно просматривали'конъюнктиву морских свинок при помощи большой лупы и с наведенным светом. Воспаления конъюнктивы не было отмечено.
Для изучения антигенной активности бделловибрио были иммунизированы 11 кроликов взвесью клеток штаммов бделловибрио х — ty и L — 1 (штаммом х — ty с титром бделловибрио Ю-9 в 1 мл иммунизированы 5 кроликов, штаммом L— 1с титром бделловибрио Ю-9 — 6 кроликов). Титр бделловибрио определяли количественным методом (БОЕ). Специфичность полученных сывороток в отношении бделловибрио подтверждена с помощью реакции нейтрализации.
Мы изучали также влияние ряда антибиотиков и изменение pH среды на рост и развитие бделловибрио. Выяснили действие 11 различных антибиотиков (ристомицина, канамицина, мономицина, неомицина, тетраолеана, тетрациклина, пасомицина, стрептомицина, полимиксина, олеандомицина, пенициллина) на рост и развитие бделловибрио (штаммы х — ty и L — 1). Антибиотики брали в концентрации от 7,8 ЕД (каждую последующую концентрацию увеличивали в 2 раза) до 1000 ЕД в 1 мл среды. В пробирки с 10 мл солевой среды Гелен вносили суточную промытую культуру Е. coli, бделловибрио и антибиотики с таким расчетом, чтобы в каждой пробирке было 500 млн. клеток Е. coli, 50 млн. бделловибрио и соответствующая концентрация антибиотиков в 1 мл среды. Затем измеряли экстинцию (Е) среды на ФЭК-М-56. В опытах ставили следующие 2 контроля: а) бделловибрио и Е. coli (без антибиотиков), б) Е. coli и 500 ЕД соответствующего антибиотика (без бделловибрио).
Пробирки помещали в термостат при 35°. Определяли экстинцию на ФЭК-М-56 в течение 7—8 суток ежедневно. Кроме того, в опытах с некото-
рыми антибиотиками (пенициллин, стрептомицин и тетраолеан) количество
* бделловибрио измеряли по БОЕ. Определение проводили после контакта антибиотиков с бделловибрио в течение 1 часа двухслойным методом Грациа. Установлено, что антибиотики мономицин, неомицин, тетраолеан полностью подавляют рост обоих штаммов бделловибрио во всех изученных концентрациях; канамицин, стрептомицин, пенициллин в концентрациях от 250 ЕД, пасомицин в концентрации от 125 ЕД, а тетрациклин в концентрации от 15,6 ЕД в 1 мл и выше подавляют рост бделловибрио штамм L — 1. Антибиотики олеандомицин в концентрации от 62,5 ЕД, ристомицин в концентрации от 250 ЕД, полимиксин в концентрации от 500 ЕД в 1 мл и выше подавляют рост бделловибрио штамм х — ty. Эти же антибиотики не оказывают действия на рост бделловибрио штамм L — 1 даже в концентрации 500 ЕД в 1 мл среды. Результаты исследований свидетельствуют о неодинаковой устойчивости разных штаммов бделловибрио к антибиотикам. Так, при равных условиях опыта штамм L — 1 оказался устойчивее штамма х — ty
* к олеандомицину, полимиксину и ристомицину. Однако по БОК не выявлено влияния пенициллина, стрептомицина и полимиксина в концентрациях 250— 1000 ЕД. Титр бделловибрио после контакта с испытанными антибиотиками уменьшался на 2—3 log.
Для обнаружения взаимного влияния вирусов и бделловибрио был поставлен опыт со штаммом бделловибрио х — ty и вирусами полиомиелита I типа и аденовирусом (штамм 22 ф). Опыт проведен на 4 водах: сточной, речной, водопроводной и морской при 20—22° в объеме 1 л. Параллельно в тех же пробах воды изучалось влияние как вирусов бделловибрио, так и бделловибрио на вирусы. Для обнаружения влияния бделловибрио на вирусы использовали реакцию нейтрализации на культуре ткани HeLa. Параллельно титровали бделловибрио методом двухслойного агара (БОЕ). Титрование вирусов проводилось на культуре клеток HeLa. Результаты опытов учитывались на 15—23-е сутки.
На 4-е сутки титр вирусов снижался по сравнению с исходным на 2,5 log в речной и сточной воде и на 1,5 log в водопроводной и морской воде. Одновременное титрование бделловибрио методом агаровых слоев показало, что титр бделловибрио в присутствии вируса снижался на 7-е сутки на 1,0—
^ 3,0 log. Таким образом, установлено, что при взаимодействии вирусов и
бделловибрио в воде происходит их частичная взаимная инактивация.
Для выявления возможной роли бделловибрио в процессах самоочищения воды необходимо изучать закономерности его распространения в естественных водах различной степени загрязнения. В связи с этим с начала 1968 г. мы проводили систематическое обследование сточных вод, воды открытых водоемов и условно чистых вод (колодцы, родники) в Москве и Московской области на наличие бделловибрио. Параллельно в воде определяли наличие патогенных бактерий семейства кишечных, энтеровирусов, фагсв тифозной и кишечной палочки и санитарно-показательных микроорганизмов группы кишечной палочки и энтерококков.
Исследовано 366 проб воды. Исследовали поступающую сточную воду и выходящую с очистных сооружений Тушинской и Кожуховской станций
Ф аэрации, воду Москвы-реки, Сходни, Нары и других рек. Родниковую и
колодезную воду исследовали в пределах Московской области. На наличие бделловибрио исследовали также морскую воду (Черного и Каспийского морей) в районах пляжей и мест выпуска сточных вод (40 проб). Для определения бделловибрио в естественных водах пользовались методикой, принцип которой заключается в просветлении (лизисе) добавленной к пробе воды взвеси бактериальных клеток (Е. coli) при наличии в ней бделловибрио. В зависимости от исходной концентрации бделловибрио полное просветление пробы наступает в течение 2—8 суток. Степень просветления определяли на ФЭК-М-56.
^ Наличие бделловибрио в просветленной пробе выборочно подтверждали
при фазовоконтрастном микроскопировании.
Результаты исследования свидетельствуют о значительном распространении изучаемого микроорганизма в сточных водах и воде открытых водоемов средней климатической зоны СССР. Полученные данные позволяют установить определенную зависимость распространения бделловибрно от степени загрязнения воды. Наибольшее содержание бделловибрио обнаружено в сточных водах и в воде сильно загрязненных водоемов. Не отмечено существенной разницы в выделении бделловибрио в различных пунктах отбора проб воды в Москва-реке, Сходне, Наре и других реках. В чистой колодезной и родниковой воде бделловибрио не обнаруживается. Частота выделения его из проб сточных вод после их очистки на очистных сооружениях по сравнению с неочищенной сточной водой всегда уменьшалась. Установлена довольно четкая корреляция между содержанием в воде бделловибрио и санитарно-показательными микроорганизмами. Бделловибрио постоянно обнаруживался в пробах, из которых были выделены патогенные бактерии и вирусы кишечной группы. Установлено изменение содержания бделловибрио в воде открытых водоемов и сточных водах в различное время года. Отмечено увеличение процента положительных на бделловибрио проб в сточных водах и воде открытых водоемов и повышение его концентрации в летне-осенние месяцы по сравнению с весной. Это совпадает с повышением процента выделения из летне-осенних проб воды цитопатических вирусов и сальмонелл и понижением в этих пробах титра санитарно-показательных микроорганизмов.
При изучении динамики просветления воды по показаниям фотоэлектро-калориметра в зависимости от степени ее загрязнения установлено, что наиболее интенсивное просветление пробы от взвеси бактериальных клеток (соответствующее наибольшей концентрации бделловибрио в воде) отмечается в сточной воде, несколько менее интенсивное — в речной. В родниковой воде просветление проб не зарегистрировано на всем протяжении срока наблюдения (8 суток). Таким образом, хотя применявшаяся нами методика не давала возможности проводить количественное определение бделлофибрио в изучаемых водах, однако сроки и интенсивность просветления проб воды, безусловно, позволяют судить о больших или меньших концентрациях бделловибрио в изучаемых объектах.
Помимо определения бделловибрио, в пробах воды по просветлению бактериальной взвеси была сделана попытка непосредственного выделения этого микроорганизма из проб естественных вод. Выделение чистой культуры производили на газоне кишечной палочки при помощи метода агаровых слоев (1,5 и 0,7% агар Дифко), используемого для определения бактериофага. Пробу воды предварительно фильтровали через мембранный фильтр. При наличии бделловибрио бляшки появлялись со 2-х суток инкубирования при 35°. Полученные данные свидетельствуют о более высоких концентрациях бделловибрио в более загрязненных водах; если в сточной воде определялось до 500 БОЕ!мл, то в речной — 1—90 БОЕ!мл. Полученные нами доказательства возможности выделения бделловибрио в чистой культуре непосредственно из природных вод представляют большой теоретический и практический интерес; необходимо проведение дальнейших исследований в этом направлении.
Поступила I7/V 1972 г.
A STUDY OF BDELLOVIBRIO BACTERIOVORUS AS ONE OF BIOLOGIC FACTORS OF SELFPURIFICATION OF WATER BODIES
G. /. Sidorenko, G. A. Bagdasaryan, Yu. G. Talaeva, R. M. Abieva, Sli. /. Satdykov
The paper deals with biologic properties of Bdellovibrio Bacteriovorus, its distribution in streams and sewage, its role in the water purification process in respect to enteral bacteria and viruses. Several strains of Bdellovibrio were recovered from sewage and surface waters; their virulence for albino mice and guinea pigs, their toxicity for various linesof tissue cultures, and their lytic action for saprophytic and pathogenic bacteria were studied.
