CC BY
22Тематический номер «Молочное и мясное скотоводство»
www.agroyug.ru
/ ?
Алексеев А.А., кандидат сельскохозяйственных наук,
научный сотрудник
Виноградова И.В.,кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник Костюнина О.В., доктор биологических наук,
руководитель лаборатории, ведущий научный сотрудник, ВИЖ им. Л.К. Эрнста, Подольск
ИЗУЧЕНИЕ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНАХ CARD15 И TLR4 С ПРОДУКТИВНОСТЬЮ И КОЛИЧЕСТВОМ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК У КОРОВ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ
В качестве другого ДНК-маркера устойчивости к маститам представляет интерес ген TLR4. Он состоит из 3 экзонов и расположен на хромосоме BTA 8. Эволю-ционно сохраняется, что TLR4 распознают множество PAMPs и, следовательно, напрямую способствуют воспалительной реакции [6]. Также выявлено, что ген TLR4 полиморфен среди пород крупного рогатого скота и его экспрессия ассоциирована c чуствительностью к интрамаммарной инфекции [5,10].
Гены TLR и CARD имеют общие пути воздействия, например, оба вызывают активацию митоген-акти-вируемых протеинкиназ (MAPKs) или транскрипционного фактора NF-kB [10,12]. Таким образом, можно предположить, что TLR4 и CARD15/NOD2 могут взаимодействовать и модулировать иммунологические ответы, что может свидетельствовать и о эпистатиче-ском воздействии этих генов.
Цель работы заключалась в определении частоты встречаемости аллельных вариантов генов CARD15 и TLR4, изучение корреляции их генотипов с молочной продуктивностью и количеством соматических клеток в молоке.
Материалы и методы. Исследования проводили на 365 коровах голштинизированной черно-пестрой породы в ФГУП Э/х «Кленово-Чегодаево», Московской области.
Выделение ДНК осуществлялось с использованием наборов «ДНК-Экстран» (Синтол, Россия) согласно рекомендации производителя. Полиморфизм гена CARD15 (rs43710288) определяли методом аллель-специфической ПЦР, генотипы по TLR4 (rs8193060) выявляли посредством метода ПЦР-ПДРФ с использованием разработанных в лаборатории тест-систем.
Статистическую и биометрическую обработку данных проводили по общепринятым методикам, с использованием компьютерных программ Excel 2010, достоверность полученных данных определяли с помощью критерия достоверности Стъюдента [2].
Результат. У исследованного поголовья животных были изучены однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) по генам CARD15 SNP с. 3020 A>T и TLR4 SNP с. 9421 C>T.
Результаты исследований частоты встречаемости аллелей и генотипов изучаемых генов у коров голштинизированной чёрно-пёстрой породы представлены в таблице 1.
Мастит - воспаление молочной железы, подразделяется по характеру проявления на клинически выраженный и субклинический (протекающий бессимптомно). По оценке международной молочной федерации, мастит остаётся основным источником потерь в молочном скотоводстве всех высокоразвитых странах мира, а по данным Всемирной организации ветеринарного здравоохранения, мастит наносит более значительный ущерб молочному скотоводству, чем все болезни коров, вместе взятые [3]. Для снижения частоты заболевания маститом предлагается проведение лечебных, профилактических мероприятий. Большой интерес вызывают дополнительные стратегии, в основе которых лежат селекционные программы, направленных на генетическое усовершенствование животных. В качестве косвенного показателя при выборе животных для селекции часто используется количество соматических клеток (SCC) в молоке [1,8].
Этиология воспалительных заболеваний в молочных железах разнообразна и может включать в себя инфекции, вызываемые бактериями, паразитами, вирусами и грибками. Иммунный ответ возникает против широкого спектра патогенов благодаря рецепторам (PRMs & PRR), которые распознают консервативные молекулярные структуры, связанные с разными классами возбудителей. «Образраспознающие рецепторы» PRMs по структурным характеристикам относятся к нескольким классам белковых молекул, а по функции делятся на две группы: эндоцитозные и сигнальные. Среди сигнальных рецепторов центральное место занимают TLR и NOD (nucleotide-binding oligomerization domain) рецепторы [4,10].
В настоящее время широко исследуются и используются в качестве генетических маркеров в области толерантности/восприимчивости к заболеванию маститом однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Одним из потенциальных ДНК-маркеров устойчивости к маститам рассматривается ген CARD15, расположенный на BTA18. Домен рекрутирования каспазы 15 (CARD15), также известный как домен олигомери-зации нуклеотидов 2 (NOD2), является цитозольным белком, способным инициировать воспаление после распознавания PAMP [9].
ЭФФЕКТИВНОЕ №1 февраль
животноводство 2018
Таблица 1
Частота встречаемости аллелей и генотипов по генам CARD15 и у коров голштинизирован-ной чёрно-пёстрой породы
Ген Генотипы1, % Частота аллелей1, %
11 12 22 1 2
CARD15 38,1 49,3 12,6 62,8 37,2
TLR4 44,5 42,8 12,7 65,9 34,1
1 - расшифровка аллелей по САВ015: 1- А, 2-Т; по Т1_В4: 1- С, 2- Т
Изучение полиморфизма генов показало, что частота встречаемости аллеля А и Т по САКР15 составила 62,8 и 37,2%%, а аллелей С и Т по ТЬК4 65,9 и 34,1%%, соответственно. У данной выборки коров было выявлено три генотипа по САКР15 БЫР (с. 3020 А>Т), наиболее часто встречался гетерозиготный вариант АТ с частотой 49,3%. По гену ТЬК4 генотипы СС и СТ встречались с частотой 44,5 и 42,8% соответственно.
Нами были изучены показатели молочной продуктивности с учетом генотипов по генам САКР15 и ТЬК4, результаты анализа представлены в таблице 2.
Таблица 2
Молочная продуктивность и качественные показатели молока коров с учётом генотипа по CARD15 и (в среднем за 1-4 лактации), (гол)
Показатель Генотип по CARD15 Генотип по TLR4
АА АТ ТТ СС СТ ТТ
Количество, 139 179 47 166 154 45 гол.
Количество соматических клеток, тыс.см3 379,3 ± 40,2 aaabb 496,5 ± 46,4 aaa 586,9 ± 107,5 bb 413,6 ± 37,5 aab 531,1 ± 58,6 aa 552,6 ± 93,1 b
.. . ,.,.оп ,_,-,.„ 6202,1 6179,7 6496,7 Удой за 305 дн. 6158,° 6274,8 6215,7 ± 591 ± 619 ± 1052 лактации, кг ± 62,1 ± 60,0 ± 91,9 ,' " ' , ' bb c bb c
Удой за всю лактацию, кг 7057,1 ± 126,1 6908,1 ±107,0 7055,8 ± 204,4 6888,0 ± 118,8 6933,3 ±117,4 7150,3 ± 240,7
.. 3,94 3,89 3,93 3,88 Масс°Вая0доля ±0,01 ±309021 ±0,02 ±0,01 ±309021 ±0,03 жира, % ±0,01 ±0,01 r b b b b
Массовая доля белка, % 3,32 ±0,02 abb 3,29 ±0,01 a 3,27 ±0,01 bb 3,31 ±0,01 bb 3,30 ±0,01 3,27 ±0,02 bb
По гену ТЬК4 коровы с генотипом СС по сравнению с животными носителями генотипов СТ и ТТ имели наименьшее содержание соматических клеток в молоке, которое составило 413,6 тыс.см3, что на 117,5 (р<0,01) и 139 тыс.см3 (р<0,05) меньше со сравниваемыми аллелями. По массовой доле жира и белка в молоке, коровы с генотипом СС превосходили коров с генотипом ТТ на 0,05% (р<0,05) и 0,04% (р<0,01). Продуктивность за 305 дней лактации у животных с генотипом СС, СТ, ТТ составила 6202, 6179,7 и 6496,7 кг молока соответственно.
Полученные данные показывают, что у животных с генотипами АА по БЫР с. 3020 А>Т и СС по БЫР с. 9421 С>Т показатель количества соматических клеток ниже по сравнению с другими генотипами, а уровень молочной продуктивности в целом выше, что косвенно может свидетельствовать о лучшем физиологическом состоянии животного, таким образом, данные аллели можно отмечать как желательные и использовать в качестве маркера, при разведении резистентного к маститу стада.
Работа выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Фонд содействия инновациям)
в рамках программы «УМНИК» договор №6671 ГУ/2015.
а р<0,05, аар<0,01, ааар<0,001 при сравнении генотипов АА/ АТ(СС/СТ)
Ь р<0,05, ЬЬ р<0,01,ЬЬЬ р<0,001 при сравнении генотипов АА/ ТТ (СС/ТТ)
с р<0,001 при сравнении генотипов СТ/ТТ
Анализ данных таблицы 2 показывает, что у коров с генотипом АА по гену САКР15 количество соматических клеток в молоке составило 379,3 тыс.смЗ, что меньше по сравнению с животными носителями аллеля АТ на 117,2 тыс.смЗ (р<0,001) и генотипа ТТ на 207,0 тыс.смЗ (р<0,01). Массовая доля жира в молоке коров с генотипом АА была выше, чем у группы с ТТ на 0,03% (р<0,01) и составила 3,94%. По содержанию белка в молоке группы коров с генотипом АА, превосходили животных с аллелями АТ и ТТ на 0,03 (р<0,05) и 0,05% (р<0,01), соответственно. Статистически значимых различий по молочной продуктивности за 305 дней обнаружено не было.
Литература:
1. Артемьева О.А, Переселкова Д.А., Виноградова И.В., Котковская Е.Н., Гладырь Е.А., Сивкин Н.В., Зиновьева Н.А.. Скрининг стада молочных коров на наличие в молоке гемолитических микроорганизмов во взаимосвязи с содержанием соматических клеток. Сельскохозяйственная биология, 2015, том 50, №6, с. 810-816.
2. Меркурьева, Е.К. Биометрия в селекции и генетике сельскохозяйственных животных/ Е.К. Меркурьева. -М.: Колос, 1970. -423 с.
3. Kumar, A., Rahal, A., Dwivedi, S. K., and Gupta, M. K.: Bacterial prevalence and antibiotic resistance profile from bovine mastitis in Mathura, India. J. Dairy Sci., 38: 31-34, 2010.
4. Leung E, Hong J, Fraser A, Krissansen GW: Splicing of NOD2(CARD1 5) RNA transcripts. Molecular immunology 44(4):284-294. 2007.
5. Mesquita, A.Q., Rezende, C.S.M., Mesquita, A.J., Garcia, E.A., Jardim, D.V and Kipnis, A.P.J. Association of TLR4 рolymorphisms with subclinical mastitis in Brazilian Holsteins. Braz. J. Microbiol. 43(2): 692-697. 2012.
6. Mitra, M., Taraphder, S., Sonawane, G. S., and Verma, A.: Nucleotide sequencing and SNP detection of Toll-like receptor-4gene in Murrah Buffalo (Bubalus bubalis), Mol. Biology 659513, doi:10.5402/2012/659513, 2012.
7. Mogensen, T. H.: Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses, Clin. Microbiol. Rev., 22: 240-273, 2009.
8. Muhasin Asaf VN, Kumar A, Rahim A, Sebastian R, Mohan V, Dewangan Pand Panigrahi M : An overview on single nucleotide polymorphismstudies inmastitis research. VeterinaryWorld 7(6): 416-421. 2014.
9. Pant, S.D., Schenkel, F.S., Leyva-Baca, I., Sharma, B.S. and Karrow, N.A.: Identification of single nucleotide polymorphisms in bovine CARD15 and their associations with health and production traits in Canadian Holsteins. BMCGenomics 8:421-427. 2007.
10. Sharma, B.S.; Leyva, I.; Schenkel, F.; Karrow, N.A. : Association of Toll-Like Receptor 4 Polymorphisms with Somatic Cell Score and Lactation Persistency in Holstein Bulls. J. Dairy Sci. 89:3626-3635. 2006.
*
