CC BY
25Тематический номер «Генетика и племенное дело»
www.agroyug.ru
УДК 636.22/.28:612.1/.8
Кононова Л.В. кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий
Шарко Г.Н. старший научный сотрудник лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий, Всероссийский научно-исследовательский институт овцеводства и козоводства — филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ», (ВНИИОК — филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ»), г. Ставрополь. Мачульская Е.В. кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биотехнологии, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии» (ФГБНУ КНЦЗВ), г. Краснодар
сравнительный полиморфизм локуса лептина в популяциях крупного рогатого скота красной степной и швицкой пород
Введение. Продолжительность продуктивного использования молочного скота — категория не только биологическая, но и экономическая, так как эффективность ведения отрасли молочного скотоводства зависит не только от уровня удоев, но и сроков производственного использования коров. Для крупного рогатого скота характерен довольно большой биологически обусловленный период продуктивного использования (коровы 8-10 лактаций).
В странах с развитым молочным скотоводством срок продуктивного долголетия высокопродуктивных коров, как правило, действительно составляет 2,5-3 лактации.
В настоящее время проблема продуктивного долголетия молочных пород скота вызывает повышенный интерес среди ученых и практиков. Наследуемость продуктивного долголетия низка и причинами изменения данного показателя могут быть многочисленные факторы генетического и паратипического характера. При этом, зачастую, разные исследователи получают противоречивые
результаты, что не позволяет эффективно использовать их на практике [1, 7].
Достижения в сфере современной молекулярной генетики позволяют исследовать гены, коррелирующие с полезными признаками крупного рогатого скота. В настоящее время в качестве гена-маркера, ассоциированного с функциональным долголетием коров и репродуктивными качествами, активно используется аллельный полиморфизм гена лептина (ЬЕР) [2].
Ген лептина расположен в 4 хромосоме крупного рогатого скота. Структура гена лептина представлена промоторной областью, 3 экзонами, 2 ин-тронами и 3"иТК-областью. Полиморфизмы К25С и У7Б встречаются во втором, а Д80У — в третьем экзоне1ЕР-гена[10].
Лептин — гормон, вырабатываемый адипоци-тами — клетками жировой ткани, играет важную роль в метаболизме, в частности, в накоплении жира в организме. Лептин участвует в регуляции пищевого поведения, влияет на функционирова-
ЭФФЕКТИВНОЕ июнь
ЖИВОТНОВОДСТВО
ние иммунной системы и репродуктивную функцию, а также на рост и конституцию животных [4].
Структурно лептин представляет собой протеин, состоящий из 167 аминокислот и включающий 21 аминокислотную сигнальную последовательность. В литературе описано около 60 SNP полиморфизмов гена лептина. Лептин интересен для селекции тем, что во многом определяет молочную продуктивность скота, содержание компонентов в молоке (белка и жира), и, что не менее важно, он связан с продуктивным долголетием сельскохозяйственных животных [8].
Установлено, что от LEP — генотипа зависит продолжительность функционального использования коров. Так, коровы с генотипом СС (SNP R25C гена лептина) имеют в 3,14 раз больший риск выбраковки, чем животные с гетерозиготными генотипами RC, а коровы с генотипом FF (SNP Y7F гена лептина) в 3,64 раза более высокий риск выбраковки, чем коровы с генотипом YY. Многие авторы отмечают, что полиморфизм локуса R25C ассоциирован с содержанием жира и белка в молоке, лёгкостью отёлов и продолжительностью стельности, а локуса A80V — с продолжительностью хозяйственного использования и уровнем рентабельности [5, 6, 9].
Цель исследований: изучение полиморфизма гена лептина в выборке коров молочного направления продуктивности.
Материал и методы исследований. Методом ПЦР-ПДрф (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) был исследован полиморфизм по гену LEP у коров красной степной (n=20) и швицкой (n=16) пород.
Выделение ДНК из цельной крови коров проводили с использованием наборов реагентов Diatom™ DNA Prep 100 согласно прописи, предоставленной фирмой-производителем (ООО Лаборатория «Изоген»,Россия). Принцип действия набора основан на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоционатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. Выход ДНК составил 3-5 мкг/100 мкл с OD 260/280 от 1,6 до 2,0.
Выявление SNP полиморфизма в гене LEP проводили в трёх точках: R25C, Y7F, A80V. При проведении ПЦР-ПДРФ использовали три пары праймеров, каждая из которых давала возможность ампли-фицировать фрагмент, содержащий SNP. Размер ПЦР-продуктов составил 305; 310 и 424 п.н. соответственно (таблица 1). Данные праймеры синтезированы ЗАО «Синтол», Россия.
Таблица 1. Последовательность праймеров
SNP Последовательность праймеров Размеры ПЦР-продуктов, п.н.
R25C 2 экзон Т ^ С F:CCAGGGAGTGCCTTTCATTA R:GGTGTCATCCTGGACCTTCC 305
Y7F 2 экзон А^Т F:CTGCGTGGTCTACAGCACACCTC R:AGGGCCAAAGCCACAGGATTCGA 310
A80V 3 экзон С ^ Т F:CAAGCAGGAAATAGGGAGTCATGG R: CTGGTGAGGATCTGTTGGTAGGTC 424
Амплификацию проводили на четырехканаль-ном программируемом термостате «Терцик» фирмы «ДНК-технология». Объём реакционной смеси составил 25 мкл. Условия амплификации приведены в таблице 2.
Таблица 2. Программа для амплификации
SNP: А80V и Y7F SNP: R25C
95°С — 30" 95°С — 2 '30"1 цикл 95°С — 30" 95°С — 2 '30" 1 цикл
95°С — 30" 67°С— 30" 72°С— 30" 1 цикл 95°С — 30" 67°С— 30" 72°С— 30" 1 цикл
95°С — 20" 65°С— 20" 72°С— 30" 33 цикла 95°С — 20" 65°С— 20" 72°С— 30" 35 циклов
95°С — 20" 63°С — 20" 72°С — 3' 1 цикл 95°С — 20" 63°С — 20" 72°С — 3' 1 цикл
Для рестрикции амплифицированных участков гена ЬБРиспользовали эндонуклеазы (ООО «Сибэнзим-М», Россия), представленные в таблице 3.
Таблица 3. Эндонуклеазы рестрикции
SNP Эндонуклеаза рестрикции Величина фрагментов рестрикции, п.н.
R25C 2 экзон Т ^ С Bsp13I RR — 305 CC — 283 и 22 CR — 305,283 и 22
Y7F 2 экзон А^Т Bpu14I YY — 310 FF — 288 и 22 YF — 310, 288 и 22
A80V 3 экзон С ^ Т PspEI АА — 424 VV — 398 и 26 AV — 424, 398 и 26
Для подсчета частот каждого из аллелей использовали следующую формулу: Р = (2Ы1+Ы2)/2п, где Р — частота аллеля, Ы1 — число гомозигот по исследуемому аллелю, Ы2 — число гетерозигот, п — объем выборки.
Результаты и их обсуждение. По результатам анализа определена частота встречаемости генотипов гена ЬБР по полиморфизму R25C: RR, RC и СС; У7Б: УУ, УБ и ББ и по Д80У: ДА, ДУ и УУ (таблица 4).
Анализ результатов генотипирования исследуемых популяций позволил выявить определенную схожесть частоты встречаемости аллелей в локусе R25C. Частота встречаемости аллеля R в красной степной породе составила 0,2, швицкой — 0,16, а концентрация аллеля С — 0,8 и 0,84 соответственно. Гомозиготный «желательный» генотип RR встречался с практически одинаковой частотой (0,05 — в красной степной породе и 0,06 — в швицкой). Частота встречаемости генотипа СС в обеих популяциях довольно высокая и варьировала в пределах 0,65-0,75. Гетерозиготный генотип RC преобладал у коров красной степной породы (0,30 против 0,19 — у швицких).
Тематический номер «Генетика и племенное дело»
www.agroyug.ru
Таблица 4. Результаты генотипирования коров красной степной и швицкой пород по локусам LEP
SNP: LEP Порода n Частота встречаемости аллелей Частота встречаемости генотипов
R25C R C RR CC RC
красная степная 20 0,2 0,8 0,05 0,65 0,30
швицкая 16 0,16 0,84 0,06 0,75 0,19
Y7F Y F YY FF YF
красная степная 20 0,9 0,1 0,90 0,10 -
швицкая 16 0,72 0,28 0,60 0,10 0,30
A80V A V AA VV AV
красная степная 20 0,4 0,6 0,35 0,60 0,05
швицкая 16 0,81 0,19 0,60 0,40
Полиморфизм локуса У7Р представлен аллелями У и Р с неодинаковой частотой встречаемости, зависящей, по всей видимости, от породных особенностей коров. При анализе частот встречаемости генотипов полиморфизма У7Р в обеих выборках отмечается низкая встречаемость гомозигот РР (0,10), несмотря на высокую частоту встречаемости УУ — 0,90 у коров красной степной породы и 0,60 у швицкой. Гетерозиготные животные УР среди коров красной степной породы не выявлены, а в швицкой породе встречались с частотой 0,30 [3].
По частотам встречаемости аллелей и генотипов локуса Д80У данные по исследуемым популяциям разнятся. Так, в выборке коров красной степной породы частота встречаемости аллеля А составила 0,4, а в швицкой породе в два раза больше — 0,81. У коров красной степной породы частота встречаемости аллеля V достигает 0,6 и «нежелательный» генотип УУ встречается с частотой 0,60. В группе швицких коров частота встречаемости аллеля V составила 0,19, что практически в три раза меньше, чем в популяции коров красной степной породы и «нежелательный» генотип Уу при этом отсутствовал. Доля гетерозигот ДУ по данному ло-кусу составила 0,05 в красной степной породе и 0,40 — в швицкой (превосходство в восемь раз).
Из 27 теоретически возможных комплексных генотипов у исследуемых животных выявлено 13 (таблица 5). Оценка генетической структуры поголовья красной степной и швицкой пород показа-
ла, что среди исследованных животных наиболее часто встречаются коровы с комплексным генотипом ССУУУУ (11 голов или 30,6%). На долю генотипа ССДДУУ приходится 8 голов или 22,2%. На третьем месте по частоте встречаемости находится генотип КСДДУУ (4 головы или 11,1%).
Таблица 5. Частота встречаемости комплексных LEP-генотипов
LEP-генотип Породы молочного направления продуктивности
красная степная (n=20) швицкая (n=16)
частота встречаемости кол-во животных частота встречаемости кол-во животных
RRAAYY - - 0,0625 1
RCAAYY 0,15 3 0,0625 1
RCAAYF - - 0,0625 1
RCAVYY 0,05 1 - -
RCVVYY 0,1 2 - -
RCVVYF - - 0,0625 1
RCVVFF 0,05 1 - -
CCAAYY 0,2 4 0,25 4
CCAAYF - - 0,0625 1
CCAAFF - - 0,125 2
CCVVYY 0,4 8 0,1875 3
CCVVYF - - 0,125 2
CCVVFF 0,05 1 - -
Можно выделить генотипы, которые характерны для красной степной породы и не встречаются в швицкой и наоборот. Так в популяции коров красной степной породы выявлены следующие генотипы: КСДУУУ, КСУУУУ, КСУУРР и ССУУРР. Для выборки коров швицкой породы характерны ККДДУУ, КСДДУР, КСУУУР, ССДДУР, ССДДРР и ССУУУР генотипы.
Таким образом, ДНК-диагностика по определению полиморфизма гена лептина (БЫР: Р25С, У7Р, Д80У) и полученные данные могут быть использованы для выявления перспективных животных. Оценка совместного действия гена лептина по трём локусам и его учёт позволяют осуществлять более тонкий анализ потенциала животного. Появляется возможность корректировать изменение частот встречаемости тех или иных аллелей и генотипов в популяции путём определенного отбора и подбора пар для селекционного процесса.
Литература:
1. Ковалюк Н.В. Использование полиморфизма локуса LEP в селекции черно-пестрого скота / Н.В. Ковалюк, В.Ф. Сацук, Е.В. Мачульская, Н.А. Морковкина, Ю.Ю. Шахназарова // Молочное и мясное скотоводство. — 2017. — № 3. — С. 14-16.
2. Ковалюк Н.В. Выявление полиморфизма в гене лептина крупного рогатого скота / Н.В. Ковалюк, Ф. Дениз // Сборник научных трудов Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства. — 2014. — Т. 2. — № 3. — С. 30-35.
3. Чижова Л.Н. Полиморфизм гена лептина у коров молочного направления продуктивности / Л.Н. Чижова, Л.В. Кононова, Г.Н. Шарко, Г.П. Ковалёва // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. — 2017. — Т. 2. — № 10. — С. 113-117.
4. Giblin L. All Association of bovine leptin polymorphisms with energy output and energy storage traits in progeny tested Holstein-Friesian dairy cattle sires / L. Giblin, S. Butler, B. Kearney, S. Waters et al. // BMC Genetics. — 2010. — № 11:73.
5. Komisarek J. Impact of leptin gene polymorphisms on breeding value for milk production traits in cattle / J. Komisarek, J. Szyda, A. Michalak, Z. Dorynek// J. Anim. Feed Sci. — 2005. — № 14. — P. 491-500.
6. Komisarek J. Impact of LEP and LEPR gene polymorphisms on functional traits in Polish Holstein-Friesian cattle / J. Komisarek// Animal Science Papers and Reports. — 2010. — V. 10. — P. 133-141.
7. Kovaljuk N.V. LEP gene allelic polymorphism in a subpopulation of ayrshire cattle / N.V. Kovaljuk, A.E. Volchenko, E.V. Machulskaja, V.F. Satsuk// Russian Journal of Genetics. — 2015. — Т. 51. — № 2. — С. 214-217.
8. Szyda J. Statistical Modeling of Candidate Gene Effects on Milk Production Traits in Dairy Cattle / J. Szyda, J. Komisarek// J. Dairy Sci. — 2007. — № 90. — Р. 2971-2979.
9. Szyda J. Evaluation markers in selected genes for association with functional longevity of dairy cattle / J. Szyda, М. Morek-Kopec, J. Komisarek, A. Zarnecki // BMC Genetics. — 2011. — 12:30
10. Yoon D.H. Highly polymorphic bovine leptin gene / D.H. Yoon, B.H. Cho, Park et al. // J. Anim. Sci. — 2005. — V.18. — №11. — P.1548-1551.
