Изучение антимикотической активности веществ в отношении дерматофитов рода Microsporum

Ринат Салаватович Мухаммадиев; Рифкат Расимович Мусин; Валентина Юрьевна Титова; Анна Михайловна Тремасова; Евгений Владимирович Скворцов

Ветеринарный врач. 2023. № 2. С. 23 - 27. The Veterinarian. 2023; (2): 23 - 27

Научная статья

УДК 619: 636:619:614:648.6

DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_2_23

Изучение антимикотической активности веществ в отношении дерматофитов рода Microsporum

Ринат Салаватович Мухаммадиев, Рифкат Расимович Мусин, Валентина Юрьевна Титова, Анна Михайловна Тремасова, Евгений Владимирович Скворцов

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия Автор, ответственный за переписку: Ринат Салаватович Мухаммадиев, tanirtashir@mail.ru

Аннотация. Проведено изучение антимикотической активности веществ бензоата натрия, тимола, бензотриазола, экстракта сныти и экстракта чистотела в сравнении с широко применяемыми на практике противогрибковыми средствами хлорнитрофенолом, тербинафином, флуконазолом, нафтифином, клотримазолом, 2-меркаптобензтиазолом в отношении дерматофитов из рода Microsporum. Методом двукратных серийных разведений определили прямую антимикотическую активность тестируемых веществ в диапазоне концентрации 0,098-100 мкг/мл. Установлено, что большинство тестируемых веществ были способны подавлять рост изолятов дерматофитов Microsporum canis и Microsporum gypseum. Наиболее выраженным антимикотическим действием в отношении изучаемых изолятов грибов обладали тимол и клотримазол, для которых значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) составил 6,25 мкг/мл. Оценка чувствительности дерматофитов из рода Microsporum к активным веществам показало, что изолят M. canis был чувствителен ко всем тестируемым веществам. Изолят M. gypseum был чувствителен к тимолу, клотримазолу, хлорнитрофенолу, тербинафину, нафтифину, 2-меркаптобензтиазолу, экстракту чистотела и обладал устойчивостью к экстракту сныти. Полученные результаты открывают перспективы дальнейшего исследования тимола и его применения в качестве основного активного вещества лекарственных средств для наружного лечения микроспорийной инфекции.

Ключевые слова: дерматофиты, р. Microsporum, действующие вещества, антимикотическая активность, чувствительность к действующим веществам

A study of antimycotic activity substances against dermatophytes genus Microsporum

Rinat S. Muhammadiev, Rifkat R. Musin, Valentina Y. Titova, Anna M. Tremasova, Evgeny V. Skvortsov

Federal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for toxicological, radiation, and biological safety», Kazan, Russia.

Corresponding author: Rinat Salavatovich Muhammadiev, tanirtashir@mail.ru

Аbstract. A study of antimycotic activity against dermatophytes Microsporum genus of substances sodium benzoate, thymol, benzotriazole, gout extract and celandine extract was conducted in comparison with the widely used antifungal agents chlornitrophenol, terbinafine, fluconazole, naftifine, clotrimazole, 2-mercaptobenzthiazole. Antimycotic activity substances were determined in concentration range of 0.098100 ^g/ml by method of double serial dilutions. It was found that most of substances were able to inhibit growth of isolates of Microsporum canis and Microsporum gypseum. Thymol and clotrimazole had the most pronounced antimycotic effect against fungal isolates, for which minimum inhibitory concentration (MIC) was 6.25 ^g/ml. Evaluation of sensitivity dermatophytes Microsporum genus to the substances showed that M. canis isolate was sensitive to all tested substances. Isolate ofM. gypseum was sensitive to thymol, clotrimazole, chlornitrophenol, terbinafine, naftifine, 2-mercaptobenzthiazole, celandine extract and was resistant to celandine extract. Obtained research results open up prospects for further study thymol and its use as main active substance in the drugs for external treatment of microsporial infection.

Keywords: dermatophytes, Microsporum, active substances, antimycotic activity, sensitivity to active substances

Введение. Согласно данным Международного общества по медицинской и ветеринарной микологии (The International Society for Human and Animal Mycology) в последние годы наблюдается повышение количества штаммов возбудителей дерматофитозов, проявляющие резистентность к применяемых в ветеринарии противогрибковым средствам [7, 9, 13]. Наиболее патогенным и распространенным среди них являются микроскопические грибы из рода Microsporum, которые вызывают у многих животных поверхностную форму микроспории [1, 9]. Дерматофиты из рода Microsporum - это группа патогенных плесневых грибов семейства Arthrodermataceae способные синтезировать протеазы и кератиназы для гидролиза кератина кожи и ее придатков (волосы, когти, шерсти), и использования продуктов их гидролиза в качестве источника питания [12]. Они продуцируют споры (макро- и микроконидии), обладающие устойчивостью к высоким и низким температурам, а также жизнеспособностью в течение длительного периода времени [14].

Возбудители микроспории выявлены у всех видов сельскохозяйственных животных. Чаще всего они обнаруживаются у молодых особей или животных со слабым иммунитетом [12, 14]. Эти микромицеты, проникнув в роговой слой эпидермиса и придатки кожи животных, продуцируют экзотоксины и гидролитические ферменты, разрушающие более глубокие слои кожи и ее производных, и служат причиной воспаления и патологических изменений их пораженных участков [6, 14].

Наиболее распространенными возбудителями микроспории у сельскохозяйственных животных являются виды Microsporum canis, Microsporum gypseum, Microsporum nanum и Microsporum equinum [8, 12]. Грибы M. gypseum и M. canis поражают преимущественно лошадей и свиней, М. equinum -лошадей, M. nanum - свиней. Животные, являющиеся носителями этих патогенов, могут быть источниками заражения не только животных, но и человека [5, 12]. Поэтому заболеваемость микроспорией сельскохозяйственных животных и людей находится в тесной взаимосвязи, и для решения проблемы распространения микроспории необходимо объединение усилий ветеринарных и медицинских специалистов.

Несмотря на разнообразие существующих специфических лекарственных средств для лечения и профилактики микроспории в ветеринарии [4, 7, 13], полностью искоренить данное заболевание у сельскохозяйственных животных до сегодняшнего времени не удается. В связи с этим поиск новых биологически активных соединений с антимикотической активностью в отношении дерматофитов рода Microsporum является актуальной проблемой современной ветеринарной медицины.

Цель исследования - изучение антимикотической активности веществ в отношении дерматофитов рода Microsporum.

Материалы и методы. Объектами исследования являлись изоляты грибов Microsporum canis и Microsporum gypseum, выделенные из шерсти лошадей и находящиеся в музеи культур микроорганизмов отделения биотехнологии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности. Культуры дерматофитов хранили при температуре 4 °С на агаризованной среде Сабуро [4].

Для получения препаратов (тимол, 2-меркаптобензтиазол, бензоат натрия, нафтифин, флуконазол, тербинафин, клотримазол, бензотриазол, хлорнитрофенол) вещества растворяли в органических растворителях 70 % этаноле или диметилсульфоксиде (ДМСО). Экстракт сныти и чистотела получали путем измельчения зеленой массы травы в ДМСО в соотношении 1:8 с последующим перемешиванием смеси в течение 7 суток и центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант (надосадочную жидкость) отбирали и изучали на антимикотическую активность.

Определение действия изучаемых веществ на рост культуры грибов осуществляли в концентрации 100 мкг/мл для 2-меркаптобензтиазола, тимола, бензотриазола, бензоат натрия, флуконазола, клотримазола, нафтифина, хлорнитрофенола, тербинафина и 12,5 мкг/мл для экстрактов сныти и чистотела по методике Крючковой [4]. Для этого в опытную пробирку со стерильной жидкой питательной средой Сабуро вносили тестируемые вещества или экстракты и взвесь культуры дерматофитов в количестве 200000 грибных тел/мл. Пробирки встряхивали и инкубировали при температуре 27 °С. Результаты наблюдали по наличию или отсутствию роста культуры через 14 суток совместной инкубации с изучаемыми препаратами. Параллельно ставились контрольные пробирки с культурой, которые инкубировали без внесения тестируемых веществ.

Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) тестируемых веществ определяли методом двукратных серийных разведений в диапазоне концентрации 0,098-100 мкг/мл для

2 - меркаптобензтиазола, тимола, бензотриазола, бензоат натрия, флуконазола, клотримазола, нафтифина, хлорнитрофенола, тербинафина и 0,0122-12,5 мкг/мл для экстрактов сныти и чистотела в 48-луночных стерильных планшетах в соответствии с методом, разработанным отделом микологии Всероссийской государственной центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ») на основе EUCAST E.Def 9.3.1 [2]. Контролем служили лунки с культурой без тестируемого вещества. МИК (мкг/мл) выражали как минимальную концентрацию вещества, полностью ингибирующую рост культуры гриба. Чувствительность грибов к тестируемым веществам интерпретировали на основании диапазонов величин МИК [2] - более 32 мкг/мл -устойчивый, от 16 до 32 мкг/мл - дозозависимый, менее 16 мкг/мл - чувствительный.

Анализ экспериментальных результатов осуществляли методом вариационной статистики, используя программу Microsoft Office Excel 13. Достоверность разницы между исследуемыми группами определяли по t-критерию Стьюдента для независимых переменных при уровне вероятности p < 0,05 (не менее 95 %).

Результаты исследований. Антимикотическую активность веществ бензоата натрия, тимола, бензотриазола, экстракта сныти и экстракта чистотела определяли в сравнении с применяемыми на практике противогрибковыми средствами хлорнитрофенолом, тербинафином, флуконазолом, нафтифином, клотримазолом, 2-меркаптобензтиазолом. В таблице 1 представлены результаты действия изучаемых веществ на рост культуры дерматофитов в концентрации 100 мкг/мл для 2-меркаптобензтиазола, клотримазола, бензоата натрия, тербинафина, бензотриазола, тимола, хлорнитрофенола, нафтифина, флуконазола и 12,5 мкг/мл для экстрактов сныти и чистотела в отношении изолятов грибов Microsporum canis и Microsporum gypseum. Тест предполагал обнаружение присутствия или отсутствия ингибирования роста культур при воздействии исследуемых веществ.

Таблица 1 - Антимикотическая активность веществ к тест-культурам

Вещество Microsporum canis Microsporum gypseum

Тимол + +

Бензоат натрия - -

Бензотриазол - -

Экстракт чистотела + +

Экстракт сныти - -

2-меркаптобензтиазол + +

Нафтифин + +

Клотримазол + +

Флуконазол - -

Хлорнитрофенол + +

Тербинафин + +

Примечания 1 - «+» - обладает активностью. 2 - «-» - не обладает активностью.

Проведение скрининга исследуемых веществ на их анимикотическую активность показало, что большинство веществ обладали активностью в отношении изолятов грибов М. canis и М. gypseum. Из одиннадцати изученных нами веществ четыре не обладали антимикотической активностью к тест-культурам грибов.

В результате определения величин ингибирующих концентраций действующих веществ было установлено, что наиболее выраженной антимикотической активностью на дерматофиты Microsporum обладали тимол и клотримазол, для которых величины МИК составляли 6,25 мкг/мл для М. canis и М. gypseum (таблица 2). Все остальные тестируемые нами вещества были менее активными или низкоактивными.

Данные чувствительности исследуемых дерматофитов рода Microsporum к тестируемым веществам, которые были получены на основании диапазонов величин МИК, показали, что изоляты грибов Microsporum canis и Microsporum gypseum были чувствительны ко всем активным веществам, представленным в таблице 2, кроме экстракта чистотела в отношении изолята M. gypseum (таблица 2). По степени чувствительности изолятов M. canis и M. gypseum к активным веществам и их активности (МИК) исследуемые вещества можно расположить в ряд: клотримазол и тимол (МИК 6,25 мкг/мл)

> хлорнитрофенол (МИК 6,25-12,5 мкг/мл) > тербинафин (МИК 12,5 мкг/мл) > 2-меркаптобензтиазол и нафтифин (МИК 12,5-25 мкг/мл) > экстракт чистотела (МИК 25-50 мкг/мл).

Таблица 2 - Показатели МИК (минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл) активных веществ к тест-культурам

Активное вещество Microsporum canis Microsporum gypseum

МИК, мкг/мл Интерпретация результатов чувствительности препарата МИК, мкг/мл Интерпретация результатов чувствительности препарата

Тимол 6,25 чувствительный 6,25 чувствительный

Экстракт чистотела 25 дозозависимый 50 устойчивый

2-меркаптобензтиазол 12,5 чувствительный 25 дозозависимый

Нафтифин 12,5 чувствительный 25 дозозависимый

Клотримазол 6,25 чувствительный 6,25 чувствительный

Хлорнитрофенол 6,25 чувствительный 12,5 чувствительный

Тербинафин 12,5 чувствительный 12,5 чувствительный

Результаты, полученные в экспериментах, согласуются с данными других зарубежных и отечественных авторов, где обнаружено, что дерматофиты из рода Microsporum чувствительны к веществам тербинафину, 2-меркаптобензтиазолу, клотримазолу, нафтифину и хлорнитрофенолу [2, 3, 6, 10, 11, 15]. Так, Хофбауэр с соавторами [10] в своих исследованиях, изучая чувствительность 275 изолятов грибов из рода Microsporum к известному противогрибковому препарату «Тербинафин», выявил, что большинство изолятов (99 %) обладали чувствительностью к этому антимикотическому средству. Вместе с тем информация о чувствительности дерматофитов M. canis и M. gypseum к тимолу в доступной научной литературе не обнаружена.

Заключение. В результате проведенных исследований показано, что вещества тимол, экстракт чистотела и известные противогрибковые соединения тербинафин, 2-меркаптобензтиазол, клотримазол, нафтифин, хлорнитрофенол способны ингибировать рост дерматофитов из рода Microsporum. Наиболее эффективными в отношении изолятов грибов M. canis и M. gypseum являлись тимол и клотримазол. Флуконазол, бензотриазол, бензоат натрия и экстракт сныти не обладали антимикотической активностью в отношении исследуемых дерматофитов. Тимол может стать перспективным в качестве основного действующего вещества лекарственных средств при поверхностных грибковых инфекциях.

Литература

1. Иванов, А. И. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных / А. И. Иванов. - Уфа : Башкирский ГАУ, 2019. - 196 с.

2. Козлова, А. Д. Изучение резистентности патогенных и условно-патогенных грибов к противогрибковым препаратам / А. Д. Козлова, С. П. Яцентюк, В. В. Соколов // Ветеринария сегодня.

- 2022. - № 11. - С. 20.

3. Косенкова, С. И. Использование нафтифина гидрохлорида и преимущества его применения для лечения различных форм грибковых инфекций / С. И. Косенкова, И. И. Краснюк, (Мл.) И. И. Краснюк // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2018. - № 13. - C. 144.

4. Крючкова, М. А. Антимикотическая активность дермадекса / М. А. Крючкова, Л. Е. Матросова, В. Ю. Титова // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. - № 2. -С. 150.

5. Маноян, М. Г. Бессимптомное миконосительство и его значение в распространении дерматофитозов животных и человека / М. Г. Маноян, Р. С. Овчинников, А. Н. Панин // VetPharma -2012. - № 3. - С. 40.

6. Соколова Т. В. Выбор рационального подхода к терапии микозов кожи - основа эффективности лечения / Т. В. Соколова, К. Росель // Клиническая дерматология и венерология. - 2018.

- № 17. - С. 17.

7. Begum, J. Antifungal resistance in dermatophytosis: a global health concern: antifungal resistance in dermatophytes / J. Begum, P. Das // Letters in animal biology. - 2022. - Vol. 2, No 1. - P. 41.

8. Chermette, R. Dermatophytoses in animals / R. Chermette, L. Ferreiro, J. Guillot // Mycopathologia.

- 2008. - Vol. 166, No 5. - P. 385.

9. Fungal infections in animals: a patchwork of different situations / S. Seyedmousavi, S. M. Bosco, S. de Hoog [et al.] // Journal of Medical Mycology. - 2018. - Vol. 56 (1). - P. 165-169.

10. Hofbauer, B. In vitro susceptibility of Microsporum canis and other dermatophyte isolates from veterinary infections during therapy with terbinafine or griseofulvin / B. Hofbauer, I. Leitner, N. S. Ryder // Medical Mycology - 2002. - Vol. 40. - P. 179.

11. In-vitro activity of 10 antifungal agents against 320 dermatophyte strainsusing microdilution method in Tehran / P. Adimi, S. J. Hashemi, M. Mahmoudi [et al.] // Iran. J. Pharm. Res. - 2013. - Vol. 12. -P. 537.

12. Segal, E. Human and zoonotic dermatophytoses: epidemiological aspects / E. Segal, D. Elad // Frontiers in Microbiology. - 2021. - Vol. 12. - P. 71.

13. State-of-the-art dermatophyte infections: epidemiology aspects, pathophysiology, and resistance mechanisms / N. M. Martinez-Rossi, T. A. Peres, T. A. Bitencourt [et al.] // Journal of Fungi. - 2021. - Vol. 7 (8). - P. 629.

14. Transmission of onychomycosis and dermatophytosis between household members: A Scoping Review / A. Jazdarehee, L. Malekafzali, J. Lee, R. Lewis // Journal of Fungi. - 2022. - Vol. 8. - P. 60.

15. Virulence and antifungal susceptibility of Microsporum canis strains from animals and humans / C. I. Aneke, W. Rhimi, V. Hubka [et al.] // Antibiotics. - 2021. - Vol. 10. - P. 296.

References

1. Ivanov, A. I. Infectious diseases of young agricultural animals / A. I. Ivanov. - Ufa : Bashkir State Agrarian University, 2019. - 196 p.

2. Kozlova, A. D. Study of resistance of pathogenic and opportunistic fungi toantimycotics / A. D. Kozlova, S. P. Yatsentyuk, V. V. Sokolov // Veterinary Science Today. - 2022. - No 11. - P. 20.

3. Kosenkova, S. I. The use of naftifini hydrochloride and its advantages in the treatment of various typers of fungal diseases / S. I. Kosenkova, I. I. Krasnyuk, (Jr.) I. I. Krasnyuk // Drug development & registration. - 2018. - No 13. - P. 144.

4. Kryuchkova, M. A. Antimycotic activity of Dermadex / M. A. Kryuchkova, L. E. Matrosova, V. Yu. Titova // Immunopathology, allergology, infectology. - 2009. - No 2. - P. 150.

5. Manoyan, M. G. Asymptomatic mycocarriage and its role in the spread of dermatophytosis in animals and humans / M. G. Manoyan, R. S. Ovchinnikov, A. N. Panin // VetPharma - 2012. - No 3. - P. 40.

6. Sokolova T. V. The development of a rational approach to the therapy of fungal skin infections as the basis of effective treatment / T. V. Sokolova, K. Rosell // Klinicheskaya Dermatologiya i Venerologiya. -2018. - No 17. - P. 17.