CC BY
189
УДК 579.61/.62
Золотарев П.Н.
Медицинский университет «Реавиз», г Самара E-mail: [email protected]
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛьНОСТИ ГРИБОВ
к фитосубстанциям
С каждым годом в современной фармакологии всё острее встает вопрос поиска новых соединений, обладающих антимикотической активностью, что в первую очередь обусловлено увеличением роста грибковых заболеваний кожи и слизистых оболочек человека.
При этом, среди научных исследований в современной литературе все чаще встречаются работы, направленные на изучение противогрибковой активности субстанций растительной природы.
В ходе выполнения настоящей работы изучена чувствительность грибов, вызывающих поражение кожи и слизистых оболочек человека, к фитосубстанциям, содержащим фенилпропаноиды и флавоноиды.
Материалом для исследования явились 39 штаммов грибов, вызывающих поражение кожи и слизистых оболочек (Trichophyton spp., Microsporum canis, Candida albicans).
Метод серийных двойных разведений в плотной питательной среде применялся для определения чувствительности микроорганизмов к фитосубстанциям, содержащим в качестве ведущей группы фенилпропаноиды или флавоноиды.
В результате исследования получены средние значения чувствительности исследуемых грибов к фитосубстанциям, выраженные в минимально-подавляющих концентрациях. Trichophyton spp., Microsporum canis и Candida albicans обладают максимальной чувствительностью ко второй фракции углекислотного экстракта гвоздики (МПК = 55,68±13,99 мкг/мл; 83,52±14,01 мкг/мл и 26,68±7,87 мкг/мл, соответственно).
Грибы обладают разнонаправленной чувствительностью к фитообразцам, при этом чувствительность микроорганизмов зависит как от видового состава патогена, так и от химической природы фитообразца.
В рамках экспериментальных исследований, была изучена чувствительность микроорганизмов к ряду фитосубстанций, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды, а также доказано, что грибы, вызывающие поражение кожи и слизистых оболочек человека, обладают чувствительностью к фитосубстанциям, причем эта чувствительность обусловлена видовой особенностью возбудителя.
Ключевые слова: грибы, чувствительность, фитосубстанции.
В настоящее время для подавления возбудителей грибковых культур, вызывающих поражение кожи и слизистых оболочек, используется широкий спектр антимикотических препаратов. При этом, в современной фармакологии всё наибольшую актуальность набирают исследования по поиску новых и более эффективных препаратов с противогрибковыми свойствами [1]-[3].
Помимо данных о чувствительности бактериальных и грибковых культур к антибактериальным и антимикотическим препаратам, в современной литературе всё чаще встречаются работы по изучению чувствительности данных микроорганизмов к субстанциям растительной природы [4]-[6].
Так, из подсолнечника линейнолистного (НеНаШкш orgyalis, сем. Asteraceae) выделена активная фракция фенольных веществ. Изолированный из этой фракции антибиотик назван геллоргином. Данное вещество подавляет рост грибов-дерматофитов - 10-50 мкг/мл
и неактивно в отношении грамотрицательных бактерий [7].
Установлено, что наиболее выраженной антимикробной активностью обладает эфирное масло тархуна, которое проявило активность в отношении всех штаммов, причем на грампо-ложительные бактерии в концентрации 312 мкг/ мл. Следует также отметить, что эфирное масло превосходит по своей активности препараты сравнения (гвоздичное масло и сангвиритрин). Достаточно высокую активность проявили водно-спиртовые экстракты травы тархуна в концентрации 2500-5000 мкг/мл или в 1:501:100, несколько меньшую - настой (10000 мкг/ мл). Также установлено, что водно-спиртовой экстракт проявляет антигрибковую активность в отношении грибов рода Candida [8], [9].
Говоря об индивидуальных веществах, можно отметить, что кофейная кислота, содержащаяся в таких растениях как: эхина-цея пурпурная, мелисса лекарственная, ива корзиночная обладает антибактериальными
и выраженными противогрибковыми свойствами [10].
Имеются сведения о выраженной антимикробной активности эфирного масла мелиссы лекарственной при сочетанном применении с антибиотиками в отношении многочисленных тест-культур. Так, при концентрации масла 1:10000 происходила остановка роста мицелия плесневых грибов [11].
Отмечая изменение персистентных свойств грибов, можно отметить, что антилизоцимная активность грибов рода Candida снижалась более чем у 75% штаммов на 60% и более от исходного уровня под действием настоев шиповника и полыни, на 40-60% - под действием ромашки и пижмы. В меньшей степени ингибирующее действие проявлял одуванчик - у 66±16,6% штаммов на 20-40% от первоначальных значений АЛА. Береза снижала данный признак лишь у 33±13,6% штаммов Candida на 40-60%, при этом у 41,7±12,4% штаммов грибов АЛА не изменялась, а у 25±12,5% штаммов отмечалось повышение персистентного признака на 20-40% [12].
Также в работе О.В. Бухарина с соавт. (2015 г.) экспериментально-клинически обоснован выбор противогрибковой терапии фито-субстанициями под контролем антилизоцимной и липолитической активности Candida albicans. Изучение данной активности Candida albicans в качестве биомишени позволило отобрать фи-тосредства с максимальным ингибирующим эффектом в отношении биологических свойств грибов: настои Artemisia absinthium L. и Rosa cinnamomea L., среди растительных ароматических веществ: Juniperus communis L., Citrus limon burm., Dianthus, Melissa officinalis Chaix. и Aloe arborescens mill. Представленные исследования подтвердили эффективность отобранных лекарственных фитосубстанций, которая проявлялась в снижении частоты встречаемости кандидозного дисбиоза кишечника [3].
Таким образом, вопрос изучения чувствительности грибковых культур, остается открытым и актуальным в настоящее время, а полученные данные, в ходе экспериментальных исследований, должны быть использованы для создания высокоэффективных и комбинированных антимикотических препаратов на основе растительных субстанций.
Цель исследования
Изучить чувствительность грибов, вызывающих поражение кожи и слизистых оболочек к фитосубстанциям, содержащим фенилпропа-ноиды и флавоноиды.
Материалы и методы
Материалом для исследования явились 39 штаммов грибов, вызывающих поражение кожи и слизистых оболочек. Видовой состав был представлен следующими микроорганизмами: Trichophyton spp. - 14 штаммов (Trichophyton rubrum - 6 штаммов; Trichophyton mentagrophytes var. Interdigitale - 3 штамма; Trichophyton mentagrophytes var. gypseum - 5 штаммов); Microsporum canis - 7 штаммов; Candida albicans - 18 штаммов.
Метод серийных двойных разведений в плотной питательной среде применялся для определения чувствительности микроорганизмов к фитосубстанциям. При работе с грибами в качестве плотной среды использовалась среда Сабуро. Среда бралась в объеме 20 мл на стерильную чашку Петри.
При работе с плотной средой готовились рабочие разведения препаратов нужной концентрации, которые вносились в расплавленный раствор агара в отношении 1/9 (2 мл препарата на 18 мл агара). Среда тщательно перемешивалась и разливалась по чашкам Петри. Толщина слоя питательной среды не превышала 3-4 мм.
Грибковый инокулят для посева готовился путем внесения агаровой культуры в изотонический раствор хлорида натрия с последующим доведением до определенной концентрации в камере Горяева.
Посев осуществлялся бактериальной петлей с предварительным определением количества петель в 1 мл. Посевная доза для плотной питательной среды составляла 2х107 микробных клеток.
Чашки Петри с разведенными препаратами и засеянные микроорганизмами помещались для инкубирования в термостат для грибов на 7 дней при температуре 290С.
Учет результатов производился визуально. За минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата принимали ту концентрацию, которая вызывала полную ингибицию видимого роста.
Контролем при титровании служили чашки Петри со средой Сабуро, не засеянные микроорганизмами, а также разведения спирта, используемые для приготовления настоек и экстрактов, и разведения диметилсульфоксида (DMSO). используемого в качестве растворителя высококонцентрированных и трудно-растворимых препаратов [13]-[15].
Данные, полученные в ходе исследований, были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде доверительного интервала (М±т). О достоверности различий судили с помощью критерия Стъюдента.
Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости р<0,05.
Статистическая обработка результатов выполнялась с помощью пакета прикладных программ StatSoft Statistica v.6.0 и Ехсе1 2000 (MS Office 2000, USA) [16].
Результаты и обсуждение
Среднестатистические результаты, отражающие чувствительность грибов к фитосубстанциям, взятым в различных разведениях, представлены на рисунках 1, 2, 3, 4.
Рисунок 1. Чувствительность грибов к фитосубстанциям, изготовленным на основе 40% спирта этилового, взятым в различных разведениях (среднестатистические значения)
Рисунок 2. Чувствительность грибов к фитосубстанциям, изготовленным на основе 70% спирта этилового, взятым в различных разведениях (среднестатистические значения)
По данным, представленным на рисунке
1, видно, что Trichophyton spp. способен задерживать рост только под действием ивы остролистной экстракта, тогда как другие препараты не препятствуют его размножению. Штаммы Microsporum canis оказались не чувствительны ко всем вышеперечисленным препаратам, тогда как Candida albicans чувствительна только к родиолы экстракту жидкому.
Из данных, представленных на рисунке
2, можно отметить, что Trichophyton spp. чувствителен к полыни эстрагон настойке и зверобою настойке, причем к последнему препарату Trichophyton spp. проявляет максимальную чувствительность (2-е разведение). Microsporum canis чувствителен так же, как и предыдущий род грибов только к полыни эстрагон настойке и зверобою настойке. Candida albicans проявляет максимальную чувствительность из всех изучаемых штаммов грибов, и эта чувствительность проявляется к полыни эстрагон настойке (3-е разведение). К лимоннику настойке не один из грибов не чувствителен, что выражается в росте культур на чашках с добавлением препарата.
При анализе результатов исследования, представленных на рисунке 3, выявлено, что Trichophyton spp. проявляет чувствительность
только к фитосубстанциям, ведущей группой в которых являются флавоноиды (настойка берёзы и настойка почек тополя). Microsporum canis чувствителен к настойке берёзы, настойке почек тополя и расторопши экстракту жидкому. Candida albicans чувствителен ко всем вышеуказанным препаратам, за исключением лимонника плодов настойки.
Нерастворимые в воде и спирте фитосуб-станции были разведены диметилсульфоксидом в пропорции 1/20. После разведения определялась чувствительность штаммов грибов к фи-тообразцам.
По результатам, представленным на рисунке 4, видно, что данные штаммы проявляют чувствительность к фитосубстанциям, разведенным диметилсульфоксидом, в разной степени. Также установлено, что максимальной чувствительностью ко всем образцам обладает Candida albicans. Максимальная чувствительность Candida albicans проявляется ко II фракции углекислотного экстракта гвоздики в 11 -ом разведении.
Таким образом, из рисунков 1, 2, 3, 4 следует, что все штаммы грибов чувствительны к фитосубстанциям в разных значениях разведений, однако для количественной оценки чувствительности и для определения антигриб-
Рисунок 3. Чувствительность грибов к фитосубстанциям, изготовленным на основе 80% спирта этилового, взятым в различных разведениях (среднестатистические значения)
ковой активности фитопрепаратов необходимо определить их минимально-подавляющих концентраций. Качественные показатели чувствительности грибов к фитосубстанциям представлены в таблице 1. Минимально-подавляющие концентрации таких препаратов как эхинацеи пурпурной настойка, сирени настойка, родиолы розовой настойка, мелиссы настойка, лимонника настойка, лимонника плодов настойка, роди-олы экстракт жидкий и экстракт элеутерококка жидкий определить не считается актуальным, так как эти препараты не оказывают видимой задержки роста исследуемых грибов.
По результатам, представленным на рисунках 1, 2, 3, 4 и таблице 1, установлено, что штаммы Trichophyton spp., Microsporum canis и Candida albicans оказались не чувствительны к настойкам, содержащим в качестве ведущей группы фенилпропаноиды. Чувствительность штаммов проявлялась к эфирным маслам, экстрактам и настойкам с флавоноидами.
Разведения
□ Trichophyton spp. Н Microsporum canis Ш Candida albicans
Рисунок 4. Чувствительность грибов к фитосубстанциям, разведенным диметилсульфоксидом и взятым в различных разведениях (среднестатистические значения)
Также в результате эксперимента получены средние значения чувствительности исследуемых грибов к фитосубстанциям, выраженные в минимально-подавляющих концентрациях.
Анализируя результаты чувствительности микроорганизмов к фитосубстанциям фенольной природы, было установлено, что Trichophyton spp., Microsporum canis и Candida albicans обладают максимальной чувствительностью ко второй фракции УЭГ (МПК = 55,68±13,99 мкг/мл; 83,52±14,01 мкг/мл и 26,68±7,87 мкг/мл, соответственно).
Установлено, что грибы обладают разнонаправленной чувствительностью к фитообраз-цам, при этом чувствительность микроорганизмов зависит как от видового состава патогена, так и от химической природы фитообразца.
Таким образом, в ходе экспериментальных исследований, была изучена чувствительность микроорганизмов к ряду фитосубстанций, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды,
Таблица 1. Средние значения чувствительности исследуемых грибов к фитосубстанциям, выраженных в МПК
№ Препарат Средние значения минимальных подавляющих концентраций (МПК) в мкг/мл при титровании в агар Сабуро (M±m)
Trichophyton spp. (n = 11) Microsporum canis (n = 7) Candida albicans (n = 15)
1. Полыни эстрагон настойка 11412,65±1284,51 6428,57±1020,20 3214,28±510,10
2. Зверобоя настойка 1428,57±178,57 1607,14±230,53 1339,28±212,54
3. Настойка берёзы 1285,71±138,32 2571,43±276,64 847,14±107,14
4. Прополиса настойка - - 1857,14±142,86
5. Тополя почек настойка 642,85±92,21 535,31±85,02 321,43±46,11
6. Расторопши экстракт жидкий - 1700,00±0,00 1020,00±256,36
7. Ивы остролистной экстракт 525,00±131,95 - -
8. Родиолы экстракт жидкий - - 660,00±221,63
9. Эфирное масло гвоздики 570,96± 95,67 1395,68±287,00 666,12±167,42
10. Эфирное масло фенхеля 1213,7±0,00 - -
11. Углекислотный экстракт аниса 1252,7±365,74 - -
12. Углекислотный экстракт гвоздики 194,00±57,24 101,26±25,42 320,80±38,23
13. Углекислотный экстракт фенхеля 687,00±0,00 1443,75± 362,86 378,03±77,65
14. I фракция УЭГ 883,03±110,38 993,41±142,50 220,76±27,56
15. II фракция УЭГ 55,68±13,99 83,52±14,01 26,68±7,87
16. III фракция УЭГ 371,132±0,00 1696,61±212,76 212,07±26,51
17. IV фракция УЭГ 5819,24±447,63 1432,83±179,08 1790,57±223,82
а также доказано, что грибы, вызывающие поражение кожи и слизистых человека, обладают чувствительностью к фитосубстанциям, причем эта чувствительность носит разнонаправленный характер.
Также считаем целесообразным дальнейшее изучение изменения патогенных,
персистентных свойств и антибиотикочув-ствительности микроорганизмов под действием фитосубстанций, что позволит углубить данные по воздействию фитообразцов на микроорганизмы и разработать адекватную лекарственную форму для лечения гнойно-воспалительных заболеваний.
2.12.2015
Список литературы:
1. Дерматовенерология. Национальное руководство \ нод ред. Ю.Ю Скрипкина, Ю.С. Бутова, О.Л. Иванова. - M.: ГЭОТАР-Mедиа, 2013. - 1024 с.
2. Патент РФ №2214239 Антигрибковый нренарат / Шакуров И.Г., Шакурова А.И., ^ркин В.А., Kуркина A.B., Жданов И.П., Жданова А.И. - А 61 K 35/78, Бюл. №29 от 03.09.2001 г. - 6 с.
3. Бухарин О.В., Челначенко O.E., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Андрющенко С.В. Экспериментально-клиническое обоснование выбора антимикотических фитопрепаратов // Вестник Оренбургского государственного университета. 2015. - № 3 (178). - с. 183-191.
4. Золотарев П.Н. Выявление и определение антибактериальных свойств фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, и чистых веществ // Mедицинский вестник Башкортостана. Специальный выпуск. - 2006. - №1. - С. 131-135.
5. Золотарев П.Н. Динамика антибиотикочувствительности микроорганизмов нод действием фитосубстанций // Аспирантские чтения - 2007. Труды межвузовской конференции молодых учёных. Приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья». - Самара, 2007. - С. 21-25.
6. Золотарев П.Н. Оценка антибактериальной активности лекарственных нленок, содержащих II фракцию углекислотного экстракта цветков гвоздики (Caryophyllus aromaticus L.) // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. - Самара: Издательство «Самарский университет», 2006. - №9 (49). - С. 145-154.
7. Бондаренко А.С., Омельчук Т.Я., Скоробогатько Т.И. Антимикробная активность некоторых семейств лилейных, лютиковых, губоцветных и крестоцветных // Фитонциды. - ^ев, 1967. - С. 85-88.
8. Исследование ранозаживляющих свойств геля эфирного масла полыни гладкой на модели гнойной раны / Р.Н. Пак, Д.Б. Омар-ханова, M.M. Тусупбекова и др. // XIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство": Тезисы докладов. - M., 2006. - С. 570.
9. Swiader, K. Flavonoids of rare Artemisia species and their antifungal properties / K. Swiader, E. Lamer-Zarawka // Fitoterapia. -1996. - Vol. 67, No. 1. - P. 77-78.
10. Сакович г.С., ^лхир В.Ю, Енютина Е.Ю. Эстифан - первый отечественный препарат иммуностимулирующего действия из эхинацеи // Человек и лекарство: Тезисы докладов II Российского национального конгресса. - M.: РЦ «Фармединфо», 1995. - 143 с.
11. Koch-Heitzmann I. 2000 Jahre Melissa officinalis / I. Koch - Heitzmann, W. Schultze // Z. Phytotherapie. - 1991. - Vol. 11, No. 2. -P. 50-58.
12. Челпаченко О.Е. Патогенетическое значение микробиоциноза кишечника у детей с синдромом дисплазии соединительной ткани и возможные пути коррекции: Дис.... докт. мед. наук / Челпаченко, О.Е. - Оренбург, 2003. - 348 с.
13. Дмитриева В.С. Микробиологический контроль активности антибактериальных препаратов / В.С. Дмитриева, С.М. Семенов. - М.: Медицина, 1965. - 99 с.
14. Лабинская А.С., Блинкова Л.П., Ещина А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. - М.: Медицина, 2004. - 576 с.
15. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Фисенко В.П., Арзамасцев Е.В., Бабаян Э.А. и др. - М.: ИИА «Ремедиум», 2000. - 398 с.
16. Грошовый Т.А. Маркова Е.В, Головкин В.А. Математическое планирование эксперимента. - Киев: Вища школа, 1992. - 185 с.
Сведения об авторе: Золотарев Павел Николаевич, доцент кафедры морфологии и патологии Медицинского университета «Реавиз», кандидат медицинских наук 443030, г. Самара, пр. Карла Маркса, 6-48, e-mail: [email protected]
