CC BY
66
ИЗОНИАЗИД-РЕЗИСТЕНТНЫЕ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS: ЧАСТОТА ВЫЯВЛЕНИЯ, СПЕКТРЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ УСТОЙЧИВОСТИ
С. Н. Андреевская Т. Г. Смирнова, Е. Е. Ларионова, И. Ю. Андриевская, Л. Н. Черноусова, А. Эргешов
Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза, Москва, Россия
Отсутствие ускоренной диагностики туберкулеза с устойчивостью возбудителя к изониазиду с сохраненной чувствительностью к рифампицину (ИР-ТБ) может быть причиной низкой эффективности терапии и приводить к амплификации лекарственной резистентности, в том числе к формированию множественной лекарственной устойчивости. Целью работы было определить частоту встречаемости ИР-ТБ в современной популяции, охарактеризовать фенотипическую чувствительность и генетические детерминанты устойчивости к изониазиду представителей этой группы M. tuberculosis на репрезентативном материале. Анализировали результаты определения лекарственной чувствительности, полученные при исследовании молекулярно-генетическими и/или культуральными методами изолятов M. tuberculosis / ДНК M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких из клинических отделений Центрального научно-исследовательского институа туберкулеза за период 2011-2018 гг. Частота ИР-ТБ составила 12% от всех выявленных случаев туберкулеза. M. tuberculosis с ИР были как монорезистентными к изониазиду (45%), так и полирезистентными (устойчивыми к 2-6 противотуберкулезным препаратам), а устойчивость к изониазиду была обусловлена мутациями в гене katG, приводящими к высокому уровню резистентности. На основании анализа литературных данных и собственных наблюдений подчеркивается важность разработки и внедрения новых простых молекулярных тестов для определения устойчивости одновременно к рифампицину и изониазиду.
Ключевые слова: M. tuberculosis, изониазид-резистентность, лекарственная чувствительность, молекулярная диагностика, однонуклеотидный полиморфизм, туберкулез
Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение № 05.586.21.0065 (уникальный идентификатор соглашения RFMEFI58619X0065).
Вклад авторов: А. Эргешев, Л. Н. Черноусова — разработка дизайна исследования; Е. Е. Ларионова, И. Ю. Андриевская — получение данных для анализа; Т. Г. Смирнова — анализ полученных данных; С. Н. Андреевская — написание текста рукописи, обзор публикаций по теме статьи; все авторы участвовали в обсуждении результатов.
Соблюдение этических стандартов: был проведен ретроспективный анализ результатов, полученных при выполнении рутинных лабораторных исследований для пациентов, проходящих лечение в Центральном НИИ туберкулеза; все пациенты подписали добровольное информированное согласие на проведение исследования.
CxJ Для корреспонденции: Софья Николаевна Андреевская Яузская аллея, д. 2, г. Москва, 107564; [email protected]
Статья получена: 11.12.2019 Статья принята к печати: 07.01.2020 Опубликована онлайн: 12.01.2020 DOI: 10.24075/vrgmu.2020.001
ISONIAZID-RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS: PREVALENCE, RESISTANCE SPECTRUM AND GENETIC DETERMINANTS OF RESISTANCE
Andreevskaya SN Smirnova TG, Larionova EE, Andrievskaya lYu, Chernousova LN, Ergeshov A Central Tuberculosis Research Institute, Moscow, Russia
The lack of simple, rapid diagnostic tests for isoniazid-resistant rifampicin-susceptible tuberculosis infection (Hr-TB) can result in low treatment efficacy and further amplification of drug resistance. Based on the clinical data, this study sought to estimate the prevalence of Hr-TB in the general population and characterize the phenotypic susceptibility and genetic determinants of isoniazid resistance in M. tuberculosis strains. Molecular-genetic and culture-based drug susceptibility tests were performed on M. tuberculosis isolates and M. tuberculosis DNA obtained from the patients with pulmonary TB undergoing treatment at the Central Tuberculosis Research Institute between 2011 and 2018. The tests revealed that Hr-TB accounted for 12% of all TB cases in the studied sample. Hr-TB strains were either resistant to isoniazid only (45%) or had multiple resistance to 2-6 anti-TB agents. Resistance to isoniazid was caused by mutations in the katG gene. Based on the literature analysis and our own observations, we emphasize the importance of developing simple molecular drug susceptibility tests capable of detecting simultaneous resistance to rifampicin and isoniazid and the necessity of their translation into clinical practice. Keywords: M. tuberculosis, isoniazid resistance, drug susceptibility, molecular diagnostics, single nucleotide polymorphism, tuberculosis
Funding: this study was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation and carried out under the Federal Targeted Program for Research and Development in Priority Areas of Development of the Russian Scientific and Technological Complex for 2014-2020, Project № 05.586.21.0065 (Project ID RFMEFI58619X0065).
Author contribution: Ergeshov A, Chernousova LN — study design; Larionova EE, Andrievskaya IYu — data acquisition; Smirnova TG — data analysis; Andreevskaya SN — manuscript preparation, literature analysis. All authors have equally contributed to the discussion of the obtained results.
Compliance with ethical standards: we retrospectively analyzed the results of routine laboratory tests performed on the patients undergoing treatment for tuberculosis at the Central Tuberculosis Research Institute. All patients gave informed consent.
[>3 Correspondence should be addressed: Sofya N. Andreevskaya Yauzskaya alley, 2, Moscow, 107564; [email protected]
Received: 11.12.2019 Accepted: 07.01.2020 Published online: 12.01.2020
DOI: 10.24075/brsmu.2020.001
Лекарственно-устойчивый туберкулез (ТБ) представляет собой серьезную проблему для здравоохранения. Основное внимание в настоящее время сосредоточено на борьбе с
туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ ТБ), т. е. туберкулезом такой формы, при которой возбудитель устойчив одновременно к двум наиболее
эффективным противотуберкулезным препаратам (ПТП) — изониазиду и рифампицину [1]. Россия занимает третье место в мире по распространенности МЛУ ТБ [2]. В 2018 г. показатели заболеваемости и распространенности МЛУ ТБ в РФ стабилизировались и составили соответственно 5,6 и 23,6 на 100 000 человек населения. При этом доля пациентов с МЛУ ТБ среди бактериовыделителей увеличилась (с 27,4% в 2017 г. до 29,3% в 2018 г. среди новых случаев ТБ и с 54,0% в 2017 г. до 55,3% в 2018 г. среди всех пациентов с ТБ органов дыхания, выделяющих микобактерии туберкулеза) [3].
На этом фоне другим формам резистентности уделяют недостаточное внимание. Одной из таких форм, выделяемых ВОЗ в отдельную группу, является туберкулез, резистентный к изониазиду (Hr-TB, ИР-ТБ), который характеризуется устойчивостью возбудителя к изониазиду и чувствительностью к рифампицину [4]. Изониазид — ПТП 1-го ряда, высокоэффективный для лечения активного туберкулеза, оказывающий бактерицидное воздействие на M. tuberculosis. Фенотипическая резистентность к изониазиду ассоциирована с мутациями в ряде генов (katG, inhA, ahpC и др.), продукты которых вовлечены в фармакокинетику и фармакодинамику изониазида в бактериальной клетке [5, 6].
Неадекватная терапия ИР-ТБ создает высокие риски для формирования приобретенной лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, в том числе к рифампицину, приводя к развитию МЛУ [7]. По данным ВОЗ, распространенность ИР-ТБ составляет 5-11% в зависимости от региона [8]. Сведений о распространенности ИР-ТБ в России недостаточно.
Цель исследования: охарактеризовать частоту встречаемости ИР M. tuberculosis, выделенных у больных туберкулезом легких из клинических отделений ФГБНУ «ЦНИИТ» за период 2011-2018 гг., дать расширенную характеристику фенотипической чувствительности и описать генетические детерминанты устойчивости к изониазиду этой группы M. tuberculosis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования
Исследовали клинические изоляты M. tuberculosis и/или ДНК M. tuberculosis, выделенные из диагностического материала, полученного от каждого пациента, поступившего в консультационное и клинические отделения ФГБНУ «ЦНИИТ» (за период 2011-2018 гг.). Все виды микробиологических исследований проводили из одной порции диагностического материала.
Культуральная диагностика
Выявление M. tuberculosis проводили на жидкой среде Middlebrook 7H9 в системе BACTEC MGIT 960 (BD; USA) согласно стандартному протоколу изготовителя [9]. Фенотипическую лекарственную чувствительность определяли модифицированным методом пропорций в системе BACTEC MGIT 960 (BD; США) к восьми противотуберкулезным препаратам в критических концентрациях: изониазид (H, 0,1 мкг/мл), рифампицин (R, 1,0 мкг/мл), этамбутол (E, 5,0 мкг/мл), пиразинамид (Z, 100,0 мкг/мл), этионамид (Eto, 5,0 мкг/мл), амикацин (Am, 1,0 мкг/мл), капреомицин (Cm 2,5 мкг/мл) и левофлоксацин (Lfx 1,0 мкг/мл) согласно стандартным процедурам [9, 10].
Выделение ДНК
ДНК выделяли из диагностического материала набором реагентов «Амплитуб-РВ» для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР в реальном времени, комплект № 1 («Синтол»; Россия), согласно инструкции производителя.
ДНК M. tuberculosis определяли с использованием набора реагентов «Амплитуб-РВ» для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом ПЦР в реальном времени, комплект № 2 («Синтол»; Россия), согласно инструкции производителя. Амплификацию проводили в термоциклере с оптическим модулем CFX96 (Bio-Rad; США).
Определение генотипической ЛУ к рифампицину, изониазиду и фторхинолонам проводили или с использованием микрочиповой технологии с наборами «ТБ-БИОЧИП-1» и «ТБ-БИОЧИП-2» («БИОЧИП-ИМБ»; Россия), или с использованием наборов «Амплитуб-МЛУ-РВ» и «Амплитуб^О-РВ» («Синтол»; Россия). Процедуры осуществляли согласно инструкциям производителей.
Статистическая обработка результатов
При оценке результатов исследования использовали описательную статистику: количество наблюдений, частота, доля (в %), 95%-й доверительный интервал (95% ДИ). Весь анализ проводили с использованием MS Excel (Microsoft; США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Были проведены культуральные и молекулярно-генетические исследования диагностического материала от 4056 больных туберкулезом легких. В 71 случае ни ДНК M. tuberculosis, ни культура M. tuberculosis не были выделены; эти случаи были исключены из исследования. Из оставшихся 3985 образцов диагностического материала были выделены ДНК и/или культуры M. tuberculosis и определена фенотипическая/ генотипическая чувствительность к ПТП. При получении результатов для клинических изолятов M. tuberculosis и культуральным, и молекулярно-генетическим методом (МГМ), в случае их несовпадения, приоритет отдавался данным, полученным культурально (табл. 1). Так, 38 штаммов, для которых при исследовании культуральным методом была определена устойчивость одновременно к изониазиду и рифампицину, но не были определены мутации в rpoB, обусловливающем устойчивость к рифампицину, были отнесены к категории МЛУ, так как использованные нами тесты для молекулярно-генетического определения ЛУ фиксируют только ограниченное число мутаций, поэтому генетические детерминанты устойчивости к рифампицину в этих случаях могли быть не выявлены. И наоборот, 29 штаммов с выявленными мутациями в rpoB, которые не имели фенотипического проявления в виде формирования устойчивости к рифампицину, были отнесены к категории ИР.
Среди устойчивых штаммов доминировали штаммы с МЛУ (см. табл. 1), однако штаммы с устойчивостью к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину также были достаточно широко представлены (502/3985; 12,60%).
Исследование динамики выявления M. tuberculosis с ИР за период 2011-2018 гг. показало, что в 2011-2012 и 2017-2018 гг. частота выявления ИР-ТБ среди всех исследованных за год случаев туберкулеза составила около 14%. В 2013-2016 гг. частота выявления этой формы ТБ была ниже (на уровне 10-11%). Линейный тренд показателя с достаточной степенью надежности описать не удалось (табл. 2).
Так как культуральные методы диагностики туберкулеза обладают меньшей чувствительностью, чем молекулярно-генетические, часть образцов не дали рост культуры M. tuberculosis на питательных средах. Поэтому фенотипическая чувствительность к ПТП была определена только для 260 изолятов M. tuberculosis с ИР (табл. 3). При классификации по характеру лекарственной резистентности изолятов M. tuberculosis с ИР опирались на следующие определения [1]: монорезистентность — устойчивость микобактерий туберкулеза только к одному из ПТП; полирезистентность — устойчивость микобактерий туберкулеза к двум и более противотуберкулезным препаратам, но не к сочетанию изониазида и рифампицина.
Изоляты с моноустойчивостью к изониазиду выделяли в 117/260 (45%) случаев. Остальные 143 (55%) образца относились к полирезистентным и были устойчивы к 2-6 препаратам. Среди полирезистентных изолятов приблизительно в равных долях обнаружены M. tuberculosis с устойчивостью к изониазиду в комбинации только с ПТП 1-го ряда (42/143; 29,37%) и в комбинации только с ПТП 2-го ряда (38/143; 26,57%), причем во втором случае почти всегда регистрировали устойчивость к этионамиду (31/38; 81,58%). Наибольшее число полирезистентных изолятов было устойчиво одновременно к препаратам 1-го и 2-го рядов (63/143; 44,06%). Из них устойчивость
одновременно к изониазиду, этамбутолу и этионамиду (HEEto), в том числе в сочетании с другими ПТП 2-го ряда, была выявлена в 20/63 (31,75%) случаев; устойчивость к изониазиду, пиразинамиду и этионамиду (HZEto), в том числе в сочетании с другими ПТП 2-го ряда, встречалась реже — в 9/63 (14,29%) случаев; и устойчивость к HEZEto — в 15/63 (23,81%) случаев. У 19/63 (30,16%) изолятов в спектрах резистентности были представлены другие сочетания препаратов (12 спектров резистентности, включающих от 3 до 5 ПТП).
Данные о мутациях в генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, были получены для 451 изолята M. tuberculosis с ИР (табл. 4). Чаще всего выявляли единичные однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) в одном из генов, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, — в 386/451 (85,59%) случаев; реже ОНП обнаруживали в двух генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, — в 65/451 (14,41%) случаев. Доминировали мутации в 315-м кодоне katG — 413/451 (91,57%), причем только в этом гене — в 348/413 (84,26%) случаев, реже в сочетании с ОНП в inhA — в 62/413 (15,01%) случаев, в единичных образцах — в сочетании с ОНП в ahpC.
Достаточно часто (94/451; 20,84%) регистрировали замену inhA15_C->T, которая в виде единичной мутации встречалась в 33/94 (35,11%) образцов, в остальных случаях эта мутация была сочетанной с ОНП в 315 кодоне katG.
Для 209 изолятов M. tuberculosis с ИР, устойчивость которых к изониазиду была подтверждена фенотипически, получили подобное распределение мутантных вариантов: 152/209 (72,73%) имели единичную мутацию katG315_ Ser->Thr(1); 32/209 (15,31%) — сочетанные мутации
Таблица 1. Исследованные изоляты M. tuberculosis и методы установления лекарственной чувствительности
Характер лекарственной устойчивости Число изолятов, для которых получены данные о лекарственной чувствительности методами (абс.) Суммарное число изолятов M. tuberculosis, отнесенное к каждой категории на основании МГМ и культуральных методов
МГМ и культуральным Только культуральным Только МГМ абс. % (95% ДИ)
Чувствительные 478 207 673' 1358 34,08 (32,62-35,56)
МЛУ 1 1792) 256 613 2048 51,39 (49,84-52,94)
ИР 2093) 51 242 502 12,60 (11,60-13,66)
Другие варианты41 42 23 12 77 1,93 (1,55-2,41)
Всего 1908 537 1540 3985 100
Примечание: 1 — включены случаи, для которых не выявлены мутации в генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду, рифампицину и фторхинолонам; 2 — включая 38 изолятов M. tuberculosis, для которых не были выявлены мутации в rpoB (см. текст); 3 — включая 29 изолятов M. tuberculosis, имеющих мутации в rpoB без фенотипического проявления в виде формирования устойчивости; 4 — моноустойчивость к противотуберкулезным препаратам, кроме изониазида, или полирезистентность к противотуберкулезным препаратам, не включающая изониазид.
Таблица 2. Частота выявления M. tuberculosis с ИР за период 2011-2018 г
Год Число изолятов M. tuberculosis
Всего исследовано за год (абс.) с ИР
абс. % (95% ДИ)
2011 458 67 14,63 (11,69-18,16)
2012 355 52 14,65 (11,35-18,70)
2013 530 54 10,19 (7,89-13,06)
2014 554 65 11,73 (9,31-14,68)
2015 569 65 11,42 (9,06-14,30)
2016 502 56 11,16 (8,69-14,21)
2017 557 76 13,64 (11,04-16,75)
2018 460 67 14,57 (11,64-18,08)
каЮ3 15_8ег->Т1|г(1) + МЛ 15_С->Т; 17/209 (8,13%) — единичную /лЛЛ 15_С->Т. Оставшиеся 8 (3,83%) изолятов с подтвержденной фенотипической ИР несли мутации в других регионах генов, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду (единичные в афС10_С->Т, ка?в315_8ег->Аэп; сочетанные каЮ315_8ег->0!у + /л^Л 15_С->Т, ка?в315_8ег->Т1|г(1) + /лМ8_Т->0; ка1Э315_8ег->Т1|г(1) + + афС10_С->Т).
Таким образом, среди М. ?иЬегсиЬэ/э с ИР доминирующей мутацией была единичная мутация ка?6315_8ег->ТИг(1), которая соответствует нуклеотидной замене АЭС->АСС (333/451; 73,84%), далее по убыванию выявлены сочетанные мутации каЮ315_8ег->ТИг(1) + + /пМ15_С->Т (60/451; 13,30%) и единичная мутация /пМ15_С->Т (33/451; 7,32%). В целом, на долю этих трех мутантных вариантов приходилось 426/451 (94,46%) М. ЮЬегсиЬз/э с ИР.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Изучена частота встречаемости устойчивости к изониазиду с сохраненной чувствительностью к рифампицину у М. ?иЬегсиЬэ/э, выделенных от больных туберкулезом легких из клинических отделений ФГБНУ «ЦНИИТ» за период 2011-2018 гг.
Частота встречаемости этой формы ТБ и динамика распространения популяции в разных регионах мира имеют свою специфику. Так, при анализе данных по лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза, представленных в ВОЗ за период 1994-2009 гг. из 131-го противотуберкулезного учреждения со всего мира, наибольшая частота встречаемости ИР-ТБ была зарегистрирована в Восточной Европе (15%), меньше — в Западной и Центральной Европе (11%), а в остальных регионах ВОЗ не превышала 8% [11]. Для ряда регионов этими авторами была показана тенденция к снижению распространенности данной формы туберкулеза, для других, напротив, повышение, но в большинстве регионов не было установлено четкой линейной динамики показателя. Описанная нами частота встречаемости ИР М. ЮЬегсиЬз/э (12%) сходна с показателями, характерными для Восточной Европы, а динамика показателя, также как в большинстве регионов, была нелинейной.
В систематическом обзоре, посвященном связи первичной резистентности к изониазиду с приобретением резистентности к другим ПТП [12], было сделано заключение, что приобретенная устойчивость к любому ПТП (не только переход в МЛУ) у моноустойчивых к изониазиду штаммов возникает в 5,1 раз чаще по сравнению с лекарственно-чувствительными штаммами. Показанная в нашем исследовании высокая частота встречаемости полирезистентных штаммов (55% от всех ИР), устойчивых кроме изониазида дополнительно к 1-5 ПТП, подтверждает возможность амплификации лекарственной устойчивости у М. ЮЬегсиЬз/э с ИР.
Так как стандартный курс химиотерапии по I режиму, часто назначаемый эмпирически при новых случаях туберкулеза, включает в себя ПТП 1-го ряда — этамбутол и пиразинамид, логично было ожидать выявление высокой доли устойчивости М. ?иЬегсиЬэ/э с ИР именно к этим препаратам. Действительно, устойчивость к этамбутолу была выявлена почти у половины полирезистентных М. ЮЬегсиЬз/э (70/143, 48,95%; 95% ДИ: 40,89-57,06%) и чуть реже регистрировали устойчивость к пиразинамиду (57/143, 39,86%; 95% ДИ: 32,20-48,05%).
Однако еще чаще у полирезистентных М. ЮЬегсиЬз/з определяли устойчивость к препарату 2-го ряда этионамиду (80/143, 55,94%; 95% ДИ: 47,76-63,82%). Полученный результат можно объяснить тем, что этионамид является структурным аналогом изониазида и также угнетает синтез миколовых кислот, нарушая построение клеточной стенки микобактерий, поэтому эти два препарата могут иметь общие мишени и генетические детерминанты устойчивости [5, 13].
Таблица 3. Спектры резистентности штаммов M. tuberculosis, принадлежащих к категории ИР
Спектр резистентности Число штаммов M. tuberculosis
абс. % (95% ДИ)
Монорезистентность (Н) 117 45,00 (39,07-51,08)
Полирезистентность (Н + другие ПТП, кроме R): 143 55,00 (48,95-61,05)
К двум ПТП: 71 27,31 (22,25-33,02)
HE 17
HZ 16
H Eto 31
H Am 3
H Cp 1
H Lfx 3
К трем ПТП: 36 13,85 (10,17-18,57)
HEZ 9
HE Eto 13
HE Lfx 1
HZ Cp 1
HZ Eto 7
H AmCp 2
H EtoAm 3
К четырем ПТП: 21 8,08 (5,34-12,03)
HEZ Eto 6
HEZ Am 1
HEZ Lfx 3
HEAmCp 2
HE EtoAm 4
HE EtoLfx 2
HZ EtoCp 1
H EtoAmCp 1
H AmCpLfx 1
К пяти ПТП: 12 4,62 (2,66-7,89)
HEZ EtoAm 2
HEZ EtoLfx 4
HEZ AmCp 2
HE EtoAmLfx 1
HZ AmCpLfx 1
HZ EtoAmLfx 1
H EtoAmCpLfx 1
К шести ПТП: 3 1,15 (0,39-3,34)
HEZ EtoAmCp 2
HEZ EtoAmLfx 1
Всего 260 100
Примечание: при перечислении препаратов в спектрах резистентности препараты 1-го и 2-го рядов разделены пробелом.
Таблица 4. Изоляты M. tuberculosis с ИР с различными сочетаниями мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к изониазиду
' '—■——Мутации в katG Мутации в апрОи inhA '—■—________ Не выявлены В 315-м кодоне с заменой Ser на Всего
Arg Asn Gly Thr(1)* Thr(2)*
Не выявлены мутации в ahpO и inhA - 4 (0,89; 0,35-2,26) 7 (1,55; 0,75-3,17) 3 (0,67; 0,23-1,94) 333 (73,84; 69,59-77,68) 1 (0,22; 0,04- 348 (77,16; 73,07-80,80)
В ahpOc заменой нуклеотида в позиции 6 G->A - - - - 1 (0,22; 0,04-1,25) - 1 (0,22; 0,04-1,25)
10 C->A 1 (0,22; 0,04-1,25) - - - - - 1 (0,22; 0,04-1,25)
C->T 1 (0,22; 0,04-1,25) - - - 1 (0,22; 0,04-1,25) - 2 (0,44; 0,12-1,60)
12 C->T - - - - 1 (0,22; 0,04-1,25) - 1 (0,22; 0,04-1,25)
В inhA с заменой нуклеотида в позиции 8 T->A 2 (0,44; 0,12-1,60) - - - - - 2 (0,44; 0,12-1,60)
T->G - - - - 1 (0,22; 0,04-1,25) - 1 (0,22; 0,04-1,25)
15 C->G 1 (0,22; 0,04-1,25) - - - - - 1 (0,22; 0,04-1,25)
C->T 33 (7,32; 5,26-10,10) - - 1 (0,22; 0,04-1,25) 60 (13,30; 10,48-16,75) - 94 (20,84; 17,35-24,83)
Всего 38 (8,43; 6,20-11,35) 4 (0,89; 0,35-2,26) 7 (1,55; 0,75-3,17) 4 (0,89; 0,35-2,26) 397 (88,03; 84,70-90,71) 1 (0,22; 0,04-1,25) 451 (100)
Примечание: серым цветом выделены ячейки с ОНП только в одном гене, ассоциированном с устойчивостью к изониазиду, в других ячейках — сочетанные мутации. * ТИг(1) соответствует замене АвС->АСС, 8вг->ТИг(2) соответствует замене АвС->АСА.
В целом, терапия ИР форм ТБ препаратами 1-го ряда по стандартной схеме приводит к неоптимальным результатам терапии (неэффективное лечение, рецидивы, приобретенная МЛУ). Кроме того, стандартизованное эмпирическое лечение ИР-ТБ может в значительной степени способствовать развитию эпидемии ТБ с МЛУ, особенно в тех регионах, где часто встречается ИР-ТБ [7]. В то же время своевременная коррекция терапии при получении данных о наличии устойчивости к изониазиду и применение модифицированных схем гарантировали успех лечения и не приводили к рецидивам [14- 16].
В связи с этим следует упомянуть два клинических исследования, задачей которых было установить зависимость от мутаций в геноме возбудителя эффективности терапии высокими дозами изониазида ИР формы ТБ [17, 18]. Известно, что мутации в katG (доминировали в нашем исследовании) приводят к высокому уровню резистентности к изониазиду, а мутации только в inhA — к низкому уровню резистентности [5]. По итогам клинических исследований, терапия изониазидом была эффективна в том случае, если у возбудителя выявляли мутации на уровне inhA, а неблагоприятные исходы лечения были при мутациях на уровне katG [17, 18].
Все вышесказанное свидетельствует о том, что необходима отработка эффективных схем терапии ИР-ТБ [8, 19]. Кроме того, важно уделять внимание ускоренной диагностике ЛУ к изониазиду. Быструю специфичную и чувствительную диагностику ЛУ M. tuberculosis могут обеспечить только молекулярно-генетические методы (1-2 дня по сравнению с несколькими неделями культуральной диагностики), которые также дают возможность получить информацию о мутации и об уровне резистентности к изониазиду возбудителя [1]. Это делает МГМ наиболее востребованными в диагностике туберкулеза и определении лекарственной устойчивости возбудителя. Применяемые в крупных диагностических центрах фтизиатрического профиля тесты, основанные на аллель-специфичной ПЦР, биочипах или ДНК-стрипах,
позволяют провести диагностику в кратчайшие сроки, но предъявляют высокие требования к квалификации персонала и инфраструктуре лабораторий.
В настоящее время единственным молекулярным тестом, который можно применять в лабораториях всех уровней, является Xpert MTB/RIF на платформе GeneXpert [20]. Но так как диагностика сегодня сосредоточена на выявлении МЛУ, маркером которой служит устойчивость к рифампицину, этот тест диагностирует только генотипическую устойчивость к рифампицину. Следовательно, устойчивость только к изониазиду без устойчивости к рифампицину (12% в нашем случае) не будет определена с использованием этого метода диагностики, а при невозможности применения дополнительных диагностических тестов никогда не будет установлена и, следовательно, из-за неадекватной химиотерапии может способствовать появлению новых случаев МЛУ. Поэтому актуальна разработка простого молекулярно-генетического теста, который может быть внедрен повсеместно и по удобству использования будет подобен Xpert MTB/RIF.
ВЫВОДЫ
Туберкулез с ИР возбудителя можно рассматривать как потенциального предшественника туберкулеза с МЛУ. Поэтому важно контролировать распространение первичной устойчивости к изониазиду и предотвращать амплификацию устойчивости. Анализ частоты встречаемости устойчивости к изониазиду с сохраненной чувствительностью к рифампицину у M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких, показал достаточно высокий уровень встречаемости ИР-ТБ (более 12% от всех проанализированных случаев) — как правило с мутациями, приводящими к высокому уровню резистентности к изониазиду. Полученные данные подчеркивают важность ускоренного определения молекулярно-генетическими методами лекарственной чувствительности M. tuberculosis одновременно к рифампицину и изониазиду в лабораториях
всех уровней. Для обеспечения этой возможности необходима разработка новых простых тестов в формате
Литература
1. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 29 декабря 2014 № 951 «Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания».
2. World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. Geneva: World Health Organization; 2018. (WHO/CDS/ TB/2018.20).
3. Нечаева О. Б. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в России. Туберкулез и болезни легких. 2018; 96 (8): 15-24.
4. World Health Organization. WHO consolidated guidelines on drug-resistant tuberculosis treatment. Geneva: World Health Organization; 2019 (WHO/CDS/TB/2019.33).
5. Zhang Y, Yew WW. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2009; (13): 1320-30.
6. Sandgren A, Strong M, Muthukrishnan P, Weiner BK, Church GM, Murray MB. Tuberculosis drug resistance mutation database. PLoS Med. 2009; 6 (2): e2.
7. Gegia M, Winters N, Benedetti A, van Soolingen D, Menzies D. Treatment of isoniazid-resistant tuberculosis with first-line drugs: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2017; 17 (2): 223-34.
8. World Health Organization. WHO treatment guidelines for isoniazid-resistant tuberculosis: Supplement to the WHO treatment guidelines for drug-resistant tuberculosis. Geneva: World Health Organization; 2018 (WHO/CDS/TB/2018.7).
9. Siddiqi SH, Rusch-Gerdes S. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB System. 2006.
10. Черноусова Л. Н., Смирнова Т. Г., Ларионова Е. Е., и др. Стандартные операционные процедуры. Определение чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда с использованием системы BACTEC MGIT 960/320. Москва, 2015.
11. Jenkins HE, Zignol M, Cohen T. Quantifying the Burden and Trends of Isoniazid Resistant Tuberculosis, 1994-2009. PLoS ONE. 2011; 6 (7): e22927.
12. Menzies D, Benedetti A, Paydar A, Martin I, Royce S, Pai M, et al.
point-of-care, не предъявляющих высоких требований к инфраструктуре лаборатории.
Effect of duration and Intermlttency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: a systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 2009; 6 (9): e1000146.
13. Jeon CY, Hwang SH, Min JH, Prevots DR, Goldfeder LC, Lee H, et al. Extensively drug-resistant tuberculosis in South Korea: risk factors and treatment outcomes among patients at a tertiary referral hospital. Clin Infect Dis. 2008; (46): 42-9.
14. Bang D, Andersen PH, Andersen AB, Thomsen V0. Isoniazid-resistant tuberculosis in Denmark: mutations, transmission and treatment outcome. J Infect. 2010; 60 (6): 452-7.
15. Salindri AD, Sales RF, DiMiceli L, Schechter MC, Kempker RR, Magee MJ. Isoniazid monoresistance and rate of culture conversion among patients in the state of Georgia with confirmed tuberculosis, 2009-2014. Ann Am Thorac Soc. 2018; 15 (3): 331-40.
16. Cattamanchi A, Dantes RB, Metcalfe JZ, Jarlsberg LG, Grinsdale J, Kawamura LM, et al. Clinical characteristics and treatment outcomes of patients with isoniazid-monoresistant tuberculosis. Clin Infect Dis. 2009; 48 (2): 179-85.
17. Tolani MP, D'souza DT, Mistry NF. Drug resistance mutations and heteroresistance detected using the GenoType MTBDRplus assay and their implication for treatment outcomes in patients from Mumbai, India. BMC Infect Dis. 2012; (12): 9.
18. Huyen MN, Cobelens FG, Buu TN, Lan NT, Dung NH, Kremer K, et al. Epidemiology of isoniazid resistance mutations and their effect on tuberculosis treatment outcomes. Antimicrob Agents Chemother. 2013; 57 (8): 3620-7.
19. Stagg HR, Harris RJ, Hatherell HA, Obach D, Zhao H, Tsuchiya N, et al. What are the most efficacious treatment regimens for isoniazid-resistant tuberculosis? A systematic review and network metaanalysis. Thorax. 2016; 71 (10): 940-9.
20. World Health Organization. WHO meeting report of a technical expert consultation: non-inferiority analysis of Xpert MTB/RIF Ultra compared to Xpert MTB/RIF. Geneva: World Health Organization; 2017. WHO/HTM/TB/2017.04. Available from: https://www.who. int/tb/publications/2017/XpertUltra/en/. Accessed: 18 May 2019.
References
1. Order of the Ministry of Health of the Russian Federation of 9 December 2014 «Ob utverzhdenii metodicheskikh rekomendatsiy po sovershenstvovaniyu diagnostiki i lecheniya tuberkuleza organov dykhaniya». Russian.
2. World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. Geneva: World Health Organization; 2018. (WHO/CDS/TB/2018.20).
3. Nechaeva OB. TB situation Russiania. Tuberculosis and Lung Diseases. 2018; 96 (8): 15-24. Russian.
4. World Health Organization. WHO consolidated guidelines on drug-resistant tuberculosis treatment. Geneva: World Health Organization; 2019 (WHO/CDS/TB/2019.33).
5. Zhang Y, Yew WW. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2009; (13): 1320-30.
6. Sandgren A, Strong M, Muthukrishnan P, Weiner BK, Church GM, Murray MB. Tuberculosis drug resistance mutation database. PLoS Med. 2009; 6 (2): e2.
7. Gegia M, Winters N, Benedetti A, van Soolingen D, Menzies D. Treatment of isoniazid-resistant tuberculosis with first-line drugs: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2017; 17 (2): 223-34.
8. World Health Organization. WHO treatment guidelines for isoniazid-resistant tuberculosis: Supplement to the WHO treatment guidelines for drug-resistant tuberculosis. Geneva: World Health
Organization; 2018 (WHO/CDS/TB/2018.7).
9. Siddiqi SH, Rusch-Gerdes S. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB System. 2006.
10. Chernousova LN, Smirnova TG, Larionova EE, i dr. Standartnyye operatsionnyye protsedury. Opredeleniye chuvstvitel'nosti mikobakteriy tuberkuleza k protivotuberkuleznym preparatam vtorogo ryada s ispol'zovaniyem sistemy BACTEC MGIT 960/320. Moscow, 2015. Russian.
11. Jenkins HE, Zignol M, Cohen T. Quantifying the Burden and Trends of Isoniazid Resistant Tuberculosis, 1994-2009. PLoS ONE. 2011; 6 (7): e22927.
12. Menzies D, Benedetti A, Paydar A, Martin I, Royce S, Pai M, et al. Effect of duration and intermittency of rifampin on tuberculosis treatment outcomes: a systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 2009; 6 (9): e1000146.
13. Jeon CY, Hwang SH, Min JH, Prevots DR, Goldfeder LC, Lee H, et al. Extensively drug-resistant tuberculosis in South Korea: risk factors and treatment outcomes among patients at a tertiary referral hospital. Clin Infect Dis. 2008; (46): 42-9.
14. Bang D, Andersen PH, Andersen AB, Thomsen V0. Isoniazid-resistant tuberculosis in Denmark: mutations, transmission and treatment outcome. J Infect. 2010; 60 (6): 452-7.
15. Salindri AD, Sales RF, DiMiceli L, Schechter MC, Kempker RR, Magee MJ. Isoniazid monoresistance and rate of culture
conversion among patients in the state of Georgia with confirmed tuberculosis, 2009-2014. Ann Am Thorac Soc. 2018; 15 (3): 331-40.
16. Cattamanchi A, Dantes RB, Metcalfe JZ, Jarlsberg LG, Grinsdale J, Kawamura LM, et al. Clinical characteristics and treatment outcomes of patients with isoniazid-monoresistant tuberculosis. Clin Infect Dis. 2009; 48 (2): 179-85.
17. Tolani MP, D'souza DT, Mistry NF. Drug resistance mutations and heteroresistance detected using the GenoType MTBDRplus assay and their implication for treatment outcomes in patients from Mumbai, India. BMC Infect Dis. 2012; (12): 9.
18. Huyen MN, Cobelens FG, Buu TN, Lan NT, Dung NH, Kremer K,
et al. Epidemiology of ¡soniazid resistance mutations and their effect on tuberculosis treatment outcomes. Antimicrob Agents Chemother. 2013; 57 (8): 3620-7.
19. Stagg HR, Harris RJ, Hatherell HA, Obach D, Zhao H, Tsuchiya N, et al. What are the most efficacious treatment regimens for isoniazid-resistant tuberculosis? A systematic review and network metaanalysis. Thorax. 2016; 71 (10): 940-9.
20. World Health Organization. WHO meeting report of a technical expert consultation: non-inferiority analysis of Xpert MTB/RIF Ultra compared to Xpert MTB/RIF. Geneva: World Health Organization; 2017. WHO/HTM/TB/2017.04. Available from: https://www.who. int/tb/publications/2017/XpertUltra/en/. Accessed: 18 May 2019.
