CC BY
30
Получена: 19 июня 2019 / Принята: 2 июля 2019 / Опубликована online: 30 октября 2019 УДК 616-002.5; 577.21
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ M.TUBERCULOSIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ КАЗАХСТАНА
Айнур Ж. Ахметова12, http:// orcid.org/0000-0002-5557-3338 Айнур Р. Акильжанова12, http://orcid.org/0000-0001-6161-8355 Асхат Б. Молкенов1, http://orcid.org/0000-0003-2339-5204 Улыкбек Е. Каиров1, http://orcid.org/0000-0001-8511-8064 Венера Л. Бисмилда3, SCOPUS ID: 8441834800 Ляйля Т. Чингисова3, SCOPUS ID: 39261046300 Улан А. Кожамкулов1, http://orcid.org/0000-0002-9782-7631
1 National Laboratory Astana, Назарбаев университет, г. Нур-Султан, Республика Казахстан;
2 Евразийский национальный университет имени Л.Н. Гумилева, г. Нур-Султан, Республика Казахстан;
3 Национальный научный центр фтизиопульмонологии Республики Казахстан, г. Алматы, Республика Казахстан.
Резюме
Несмотря на то, что уровень заболеваемости туберкулезом снижается с каждым годом в Казахстане, широкое распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза ставит под угрозу борьбу против туберкулеза. По данным различных исследований, генотип W-Beijing M.tuberculosis ассоциирован с лекарственной устойчивостью и вызывает более тяжелые формы туберкулеза. Цель работы: оценка спектра мутаций в гене katG, промоторных областях fabG-inhA, oxyR-ahpC и rpoB отвечающих за лекарственную устойчивость M. tuberculosis к изониазиду и рифампицину и определение генетических семейств 103 мультирезистентных клинических изолятов M.tuberculosis распространенных в Казахстане по методу Сэнгера и сполиготипированию, соответственно. Среди 103 мультирезистентных штаммов M.tuberculosis в Казахстане преобладала мутация в 531 кодоне Ser^-Leu rpoB гена (87,4%) и в 315 кодоне Ser^Thr katG гена (97%) обуславливающих устойчивость к рифампицину и изониазиду, соответственно. Более 80% штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью были отнесены к наиболее вирулентному и широко распространенному в мире генотипу Beijing. Таким образом, штаммы семейства Beijing M.tuberculosis являются доминирующими среди мультирезистентных и лекарственно-устойчивых штаммов в Казахстане.
Ключевые слова: туберкулез, сполиготипирование, множественная лекарственная устойчивость.
Abstract
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF MULTIDRUG RESISTANT M.TUBERCULOSIS STRAINS DISTRIBUTED IN THE TERRITORY OF KAZAKHSTAN
Ainur Zh. Аkhmetova1■2, http:// orcid.org/0000-0002-5557-3338 Ainur R. Akilzhanova12, http://orcid.org/0000-0001-6161-8355 Askhat B. Molkenov1, http://orcid.org/0000-0003-2339-5204 Ulykbek E. Kairov1, http://orcid.org/0000-0001-8511-8064 Venera L. Bismilda3, SCOPUS ID: 8441834800 Lyailya T. Chingissova3, SCOPUS ID: 39261046300 Ulan A. Kozhamkulov1, http://orcid.org/0000-0002-9782-7631
1 National Laboratory Astana, Nazarbayev University, Nur-Sultan city, Republic of Kazakhstan;
2 L.N.Gumilyov Eurasian National University, Nur-Sultan city, Republic of Kazakhstan;
3 National Scientific Center for Phthisiopulmonology of the Republic of Kazakhstan, Almaty city, Republic of Kazakhstan.
In spite of that the rate of tuberculosis is decreasing every year in Kazakhstan wide distribution of drug-resistant tuberculosis threatens tuberculosis control. According to various studies, M.tuberculosis W-Beijing genotype is associated with drug resistance and more severe forms of tuberculosis. Aim of the study: estimation of mutations spectrum in katG, fabG-inhA, oxyR-ahpC and rpoB responsible for drug resistance of M. tuberculosis to isoniazid and rifampicin, and
determination of genetic families of 103 multidrug resistant clinical isolates of M.tuberculosis spread in Kazakhstan by Sanger method and spoligotyping, respectively. Among 103 multidrug resistant strains in Kazakhstan mutations at 531 codon Ser^-Leu of rpoB gene (87,4%) and at 315 codon Ser^Thr of katG gene (97%) responsible for resistance to rifampicin and izoniazid respectively were prevailed. More than 80% of multidrug resistant M.tuberculosis strains were referred to Beijing genotype, the most virulent and widely spread genotype in the world. M. tuberculosis Beijing family strains prevail among multidrug and drug resistant strains in Kazakhstan. Key words: tuberculosis, spoligotyping, multidrug resistance.
Туйшдеме
КАЗАХСТАН ТЕРРИТОРИЯСЫНДА ТАРАЛГАН К0ПТ1К ДЭР1ГЕ Т0З1МД1 M.TUBERCULOSIS ШТАММДАРЫНЫН МОЛЕКУЛАЛЫКК СИПАТТАМАСЫ
Айнур Ж. Ахметова1,2, http:// orcid.org/0000-0002-5557-3338 Айнур Р. Акильжанова1'2, http://orcid.org/0000-0001-6161-8355 Асхат Б. Молкенов1, http://orcid.org/0000-0003-2339-5204 Улыкбек Е. Каиров1, http://orcid.org/0000-0001-8511-8064 Венера Л. Бисмилда3, SCOPUS ID: 8441834800 Ляйля Т. Чингисова3, SCOPUS ID: 39261046300 Улан А. Кожамкулов1, http://orcid.org/0000-0002-9782-7631
1 National Laboratory Astana, Назарбаев университет^ Нур-Султан к-, Казахстан Республикасы;
2 Л-Н.Гумилев атындагы Еуразия улттык университетi, Нур-Султан к-, Казакстан Республикасы;
3 КР ¥лттык фтизиопульмонология гылыми орталыгы, Алматы к-, Казакстан Республикасы.
^азакстанда туберкулез ауруыныч кврсеткiштерi жылдан жылга твмендеуЫе карамастан, дaрiге твзiмдi туберкулездiч кеч таралуы туберкулезге карсы KYpecKe каут твндiруде. Эр тYрлi зерттеулер м8лiметreрiне с8йкес W-Beijing M.tuberculosis генотипi дэртк твзiмдiлiк пен туберкулездiч ауыр формаларымен ассоциацияланган. Жумыстьщ максаты: изониазид пен рифампицинге M.tuberculosis дэртк твзiмдiлiгiн аныктайтын katG генi, fabG-inhA, oxyR-ahpC промоторлык аймактары мен rpoB геншдеп мутациялар спектрiн, жэне 103 мультирезистентт M.tuberculosis клиникалык изоляттарыныч генетикалык тукымдастарын с8йкесiнше Сэнгер 8дiсi мен сполиготиптеу эдгамен багалау жэне аныктау. ^азакстандагы 103 квптiк д8рiге твзiмдi M.tuberculosis штаммдарыныч арасында с8йкесiнше рифампицин мен изониазидке тезiмдiлiктi аныктайтын rpoB генУч 531 кодонындагы мутация Ser^Leu (87,4%) ж8не katG генiнiч 315 кодонындагы мутация Ser^Thr (97%) басымдылык кврсетп. Квптiк д8рiге твзiмдi M.tuberculosis штаммдарыныч 80% еч вируленттi, дYниежYзiнде кеч таралган Beijing генотипiне жататыны аныкталды. Beijing M.tuberculosis тукымдасыньщ штаммдары ^азакстанда таралган мультирезистенттi ж8не д8р^е твзiмдi штаммдар арасында басым.
TYuiH свздер: туберкулез, сполиготиптеу, кептк depiee тешд'тк.
Библиографическая ссылка:
Ахметова А.Ж., Акильжанова А.Р., Молкенов А.Б., Каиров У.Е., Бисмилда В.Л., Чингисова Л.Т., Кожамкулов УА. Молекулярная характеристика мультирезистентных штаммов M.TUBERCULOSIS, циркулирующих на территории Казахстана // Наука и Здравоохранение. 2019. 5 (Т.21). С. 45-52.
Akhmetova A.Zh., Akilzhanova A.R., Molkenov A.B., Kairov U.E., Bismilda V.L., Chingissova L.T., Kozhamkulov U.A. Molecular characterization of multidrug resistant M.TUBERCULOSIS strains distributed in the territory of Kazakhstan // Nauka i Zdravookhranenie [Science & Healthcare]. 2019, (Vol.21) 5, pp. 45-52.
Ахметова А.Ж., Акильжанова А.Р., Молкенов А.Б., Каиров У.Е., Бисмилда В.Л., Чингисова Л.Т., Кожамкулов УА. казакстан территориясында таралган квпш д8р^е тезiмдi M.TUBERCULOSIS штаммдарыныч молекулалык сипаттамасы // Гылым ж8не Денсаулык сактау. 2019. 5 (Т.21). Б. 45-52.
Введение
В настоящее время туберкулез (ТБ), вызываемый штаммами Mycobacterium tuberculosis все еще остается важной глобальной проблемой здравоохранения в мире. Несмотря на эффективную схему лечения в 2017 году в мире было зарегистрировано 10 миллионов новых случаев ТБ и 1,6 миллионов смертей среди больных ТБ, что меньше по сравнению с 2016г., когда было зарегистрировано 10,4 миллионов новых случаев
ТБ и 1,7 миллионов смертей [WHO, 2018; WHO, 2017]. Уровень заболеваемости снижается с каждым годом, однако, широкое распространение лекарственно-устойчивого ТБ, особенно мультирезистентного или ТБ с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ), ассоциированного с устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам первого ряда -изониазиду и рифампицину ставит под угрозу борьбу против туберкулеза. Проблема туберкулеза остается
актуальной и в Казахстане. По данным Национального научного центра фтизиопульмонологии (г. Алматы) в 2017 г. показатели заболеваемости и смертности от туберкулеза в Казахстане составили 52,2 и 3,0 случаев на 100 000 населения, соответственно [Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan, 2018]. Согласно данным ВОЗ, Казахстан входит в тридцатку стран с высокими показателями МЛУ-ТБ в мире [WHO, 2018].
С помощью методов генотипирования определены и классифицированы 7 основных генетических линий микобактерий туберкулеза, среди которых в нашем регионе преобладают линия 2 (Восточно-Азиатская) и 4 (Евро-Американская), включающие множество генетических семейств M.tuberculosis таких как Beijing, Haarlem, CAS (Central Asian strain), LAM (Latin American Mediterranean) и другие. Результаты генотипирования показали, что в различных географических регионах распространены разные генотипы с разными характеристиками [Ramazanzadeh et.al., 2014]. Поэтому необходимо знать природу лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, циркулирующих на территории определенного географического региона. Одним из самых широко распространенных генотипов является китайский генотип Beijing. Этот генотип часто встречается в Азиатских странах, но в последнеее время распространяется на многих континентах мира. Генотип преобладает среди молодых индивидуумов и ассоциирован с лекарственной устойчивостью [European Concerned Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis, 2006]. Также молекулярно-эпидемиологические исследования показали, что штаммы генотипа Beijing M.tuberculosis вызывают более тяжелые формы туберкулеза и в большинстве случаев приводят к неудаче лечения по сравнению с другими штаммами [Mathuria et.al., 2016].
В настоящее время существует более 10 методов генотипирования. MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Variable Number Tandem Repeats) анализ и сполиготипирование являются наиболее широко используемыми методами генотипирования M.tuberculosis, так как дискриминирующая способность данных методов, почти такая же, как и у золотого стандарта IS6110-RFLP типирования.
Рифампицин в качестве противотуберкулезного препарата был впервые использован в 1972 г. Препарат имеет высокое бактерицидное действие. Рифампицин ингибирует элонгацию м-РНК [Nguyen et.al., 2016], и в большинстве случаев рифампицин-устойчивые микобактерий накапливают мутации ассоциированные с лекарственной устойчивостью в структурном регионе rpoB гена, который кодирует в-субединицу бактериальной РНК-полимеразы, в частности в так называемом RRDR (rifampicin resistance-determining region) регионе между кодонами 507-533. Среди всех рифампицин-устойчивых изолятов мутации в rpoB гене были найдены в 95% случаев [Prim et.al., 2015; Myo et.al., 2018]. Изониазид является пролекарством, активируется ферментом каталазы-пероксидазы (katG), который кодируется геном katG для создания никотинил-НАД продукта [Zhang et.al., 1992].
Активированный комплекс связывается с редуктазой белка переносчика еноил-ацила (inhA) и ингибирует синтез миколевой кислоты [Zhang et.al., 1992]. 50-95% изониазид-устойчивых изолятов имеют миссенс мутацию в 315 кодоне katG гена (S315T) [Miotto et.al., 2018; Chin et.al., 2018]. Нуклеотидная замена C-15T в промоторном регионе fabG-inhA приводит к повышенной экспрессии inhA и является второй наиболее распространенной мутацией среди изониазид-устойчивых образцов, данная нуклеотидная замена была найдена у 6-43% изониазид-устойчивых изолятов [Zhang et.al., 2009; Rattan et.al., 1998; Ahmad et.al., 2009; Sreevatsan et.al., 1997]. Также в 10-18% случаев были найдены мутации в промоторной области oxyR-ahpC. Ген ahpC кодирует алкил-гидропероксид редуктазу, которая вовлечена в клеточную регуляцию оксидативного стресса [Jagielski et.al., 2014; Liu et.al., 2018].
Цель данного исследования: оценка спектра мутаций в генах, отвечающих за лекарственную устойчивость M.tuberculosis к изониазиду и рифампицину и определение генетических семейств 103 клинических изолятов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) распространенных в Казахстане.
Материалы и методы
Объектами исследования являются 103 мультирезистентных клинических изолятов микобактерий туберкулеза из различных областей Казахстана, бактериальные референсные штаммы M.tuberculosis.
В исследование включены больные туберкулезом с положительным результатом посева мокроты на M.tuberculosis. Информированное согласие было подписано каждым пациентом. На каждого пациента была также заполнена информационная карта, в которую были занесены все эпидемиологические и клинические данные, результаты микробиологических тестов. Протокол исследования и информированное согласие, и все виды рекрутинга, были одобрены этическим комитетом Центра наук о жизни (протокол №20 от 22.09.2017г. Заседания этической комиссии Центра наук о жизни АОО "Назарбаев Университет"). Микробиологическая идентификация и выделение чистой культуры M.tuberculosis патогена проводились в референс-лаборатории Национального научного центра фтизиопульмонологии Республики Казахстан, г. Алматы.
Микробиологические методы исследования M.tuberculosis
Для роста микобактерий туберкулеза для посева была использована твердая питательная среда Левенштейна-Йенсена, все посевы инкубировались при 36-37°С до появления роста колоний. Из всех пробирок с выросшими колониями и отобранных для определения лекарственной чувствительности, готовились мазки для микроскопического исследования. Данные мазки окрашивались по Цилю - Нильсену.
Определение in vitro чувствительности к противотуберкулезным препаратам осуществлялась на плотной среде Левенштейна-Йенсена методом абсолютных концентраций и методом пропорций [WHO.,
1998; WHO., 2003] и с использованием системы BACTEC-MGIT 960 Mycobacteria Growth Indicator Tube (BD Diagnostic Systems, США). Лекарственная чувствительность подтверждалась молекулярно-генетическими тестами HAIN-тест (GenoType® MTBDR plus) и GeneXpert (Dx System).
Лекарственная чувствительность к рифампицину и изониазиду проводились по методу абсолютных концентраций в соответствии с рекомендациями ВОЗ на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 40 pg/ml рифампицина или 0,2-1pg/ml изониазида, соответственно [WHO., 2003]. Результаты микробиологических исследований записывались через 28 дней после посева культуры. Изоляты считаются устойчивыми в случае, когда более 20 колоний выросло на средах, содержащих противотуберкулезные препараты.
Сполиготипирование клинических изолятов M.tuberculosis
Для проведения сполиготипирования микобактерий туберкулеза использовали протокол по подготовке образцов, регенерации мембран, подготовке буферов, расходного материала, по разработанному протоколу в микобактериологической лаборатории Wadsworth center (штат Нью-Йорк, США).
Для амплификации изучаемых участков ДНК использовали праймеры соответствующие спейсерным последовательностям. Проводилась Саузерн-блот-гибридизация т.е. гибридизация олигонуклеотидов соответствующего состава, нанесенных на мембрану с уникальными спейсерными последовательностями для определения наличия или отсутствия спейсерных последовательностей.
Ампликоны, включающие спейсерные промежутки DR-региона, полученные с использованием биотинилирован-ных праймеров, гибридизовались со специфическими зондами, закрепленными на нейлоновой мембране. Для сполиготипирования использовался набор «Spoligotyping Kit» (Isogen Lifescience) с биотинилироваными праймерами и мембраной.
Для амплификации DR-региона использовались нижеописанные праймеры:
DRa : 5'-GGT TTT GGG TCT GAC GAC-3', DRb : 5'-CCG AGA GGG GAC GGA AAC-3' ПЦР-амплификацию DR-региона проводили при температуре отжига 550С. Качественную оценку полученных продуктов амплификации осуществляли путем электрофореза в 1,5% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием.
Для каждого клинического изолята M.tuberculosis записывалось наличие или отсутствие сигнала в двоичном формате, где для каждого из 43 спейсерных промежутков DR-региона единицей (1) обозначалось наличие гибридизационного сигнала, а нулем (0) - его отсутствие. Обработку мембраны после гибридизации и визуализацию продуктов реакции проводили в соответствии с рекомендациями производителя.
Клинические изоляты M.tuberculosis с одинаковыми сполиготипами группировались в кластеры, в результате подсчитывалось количество как уникальных (единичных), так и кластеров с двумя и более изолятами.
Анализ полученных данных сполиготипирования проводили с использованием ранее опубликованной
базы SpolDB3 и SpolDB4. Международный сполиготип (Spoligotype International Type; SIT) каждого штамма определялся путем сравнения полученных результатов с базой данных SITVIT web (ММе Pasteur de Guadeloupe). При необходимости проводилась постановка сполиготипирования в 2-3 повторностях.
Секвенирование генов, обуславливающих устойчивость к базовым противотуберкулезным препаратам изониазиду и рифампицину
ПЦР-амплификацию фрагментов генов клинических штаммов M.tuberculosis, определяющих генетическую лекарственную устойчивость к рифампицину - rpoB; изониазиду - katG, промоторную область inhA-fabG, oxyR-ahpC оперона проводили при температуре отжига 630С. Для оценки полученных амликонов проводили визуализацию продуктов амплификации путем электрофореза в 1,5% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием.
Далее осуществляли дефосфорилирование 5'-концевых фосфатных групп дНТФ в реакционной смеси путем внесения в нее 5 мкл смеси, содержащей 10х ПЦР буфер, 2,5 мМ MgCl2 и 0,5 ед. щелочной фосфатазы (Shrimp Alkaline Phosphatase (Fermentas, Литва). Проводилась инкубация в течение 30 минут при 370С с последующей инактивацией фермента прогреванием в течении 15 минут при 850С. Далее эти образцы дополнительно обрабатывали экзонуклеазой E.coli (ExoI, Fermentas, Литва), добавляя к вышеописанной реакционной смеси 5 ед. ExoI, с аналогичными условиями инкубации.
Затем была проведена очистка сиквенс-ПЦР продуктов и осаждение ДНК ацетат Na-спиртовой смесью. Денатурацию проводили в течение 2 минут при 950С.
Определение нуклеотидных последовательностей локусов генома, принимающих участие в формирование устойчивости, проводили с использованием ABIPrism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit на приборе ABI 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителя. Для проведения реакции секвенирования использовались те же праймеры, что и в реакции амплификации. Выравнивание и сравнительный анализ полученных
последовательностей генов rpoB, katG, fabG-inhA, oxyR-ahpC проводили с референсной последовательностью штамма M.tuberculosis H37Rv (NC_000962) с помощью программного пакета Geneious.
Результаты
Проведена оценка профиля мутаций в генах, определяющих лекарственную чувствительность M.tuberculosis к изониазиду и рифампицину и генотипирование 103 клинических изолятов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью или мультирезистентных (MDR), циркулирующих в Республике Казахстан. Мультирезистентные клинические изоляты M.tuberculosis от больных с впервые выявленным туберкулезом из разных регионов Казахстана были собраны в референс-лаборатории Национального научного центра фтизиопульмонологии Республики Казахстан.
Изучаемые таргетные гены rpoB, katG, промоторные
области fabG-inhA и oxyR-ahpC оперона M.tuberculosis были секвенированы на автоматизированном генетическом анализаторе ABI 3730 (Applied Biosystems). Определение генетических семейств M.tuberculosis проводили одним из широко используемых методов - методом сполиготипирования. Сполиготипирование проводили с помощью коммерчески доступного набора «Ocimum Biosolutions Inc» с использованием стандартного протокола.
Результаты генотипирования показали, что преобладающим генетическим семейством среди 103 мультирезистентных штаммов является генотип Beijing, который идентифицирован в 89 случаях (86,4%). Остальные семейства, которые были определены: LAM - 7 (6,8%), Haarlem - 3 (2,9%), T - 3 (2,9%) и U - в 1 (0,9)
случае.
В настоящем исследовании, W-Beijing был преобладающим генотипом среди штаммов с множественной лекарственной устойчивостью M.tuberculosis, выделенных в Казахстане. На рисунке 1 показаны результаты сполиготипирования некоторых казахстанских изолятов M.tuberculosis. Клинические изоляты M.tuberculosis семейства Beijing, гибридизационный паттерн которых характеризуется отсутствием сигналов между 1 и 34 спейсерными последовательностями на рисунке показаны под номерами 7-10, 13-15, 17, 19-21, 25-27, 31-33, 35, 36, 40, положительные контроли - референтный штамм M. tuberculosis H37Ra и BCG-bovis под номерами 1 и 2, соответственно.
Рисунок 1. Пример снимка сполигопрофиля при сполиготипировании казахстанских изолятов M.tuberculosis.
Наиболее частым сочетанием мутаций в генах, обуславливающих устойчивость одновременно к изониазиду и рифампицину стала комбинация мутаций в 315 кодоне гена katG Ser^Thr (AGC^ACC) и 531 кодоне гена rpoB Ser ^Leu (TCG^TTG) в 87 случаях (84,47%) (таблица 1).
Стоит отметить, что у одного мультирезистентного штамма не обнаружены мутации в изучаемых генах (0,97%), в одном случае определены мутации только в гене rpoB (Ser531Leu), обуславливающих устойчивость к рифампицину и в трех случаях (2,91%) определены мутации только в гене у katG (Ser315Thr), определяющих устойчивость к изониазиду.
Секвенирование гена rpoB, обуславливающего лекарственную устойчивость к рифампицину, выявил
мутации в 4 кодонах: Ser531, Asp516, His526 и Leu533. Миссенс-мутация гена rpoB кодона 531 с заменой Ser/Leu была наиболее распространенной среди мутаций, ответственных за резистентность к рифампицину - у 89 (87,4%) изолятов.
В случае резистентности к изониазиду наиболее распространенной (97,0%) мутацией была нуклеотидная замена в кодоне 315 Ser/Thr, включая 5 случаев (4,8%) с двойной мутацией, когда замена одновременно происходило у гена katG и в -15 позиции промоторной области fabG-inhA оперона. Мутация в положении - 15 промоторной области fabG-inhA оперона была обнаружена в шести случаях (5,8%).
Таблица 1.
Мутации в генах, определяющих устойчивость к рифампицину и изониазиду среди 103 мультирезистентных клинических изолятов M. Tuberculosis.
Мутации в генах, обуславливающих Позиция Нуклеотидная Количество
устойчивость к INH - изониазиду (katG, fabG-inhA), и аминокислотная замена замена изолятов %
RIF - рифампицину (rpoB)
Нет мутаций - - 1 0,97
Только в гене katG Ser315Thr AGC-ACC 3 2,91
Только в гене rpoB Ser531Leu TCG-TTG 1 0,97
katG Ser315Thr AGC-ACC 87 84,47
rpoB Ser531Leu TCG-TTG
katG Ser315Thr AGC-ACC 1 0,97
rpoB His526Leu CAC-CTC
fabG-inhA -15 C-T 1 0,97
rpoB Ser531Leu TCG-TTG
katG Ser315Thr AGC-ACC 2 1,94
rpoB Ser531Trp TCG-TGG
katG Ser315Thr AGC-ACC 1 0,97
rpoB Asp516Val GAC-GTC
katG Ser315Thr AGC-ACC 1 0,97
rpoB Leu533Pro CTG-CCG
katG Ser315Thr AGC-ACC 5 4,85
rpoB His526Leu CAC-CTC
fabG-inhA -15 C-T
Всего: 103 100
Обсуждения
Demay et.al в своей статье описали общедоступную международную базу данных SITVITWEB, которая включала в себя информацию по генотипированию 62582 клинических изолятов M. tuberculosis комплекса из 153 стран происхождение пациентов (105 стран изоляции) [Demay et.al., 2012]. В SITVITWEB включены данные генотипирования по 3 широко распространенным методам - сполиготипирование, MIRU-VNTR анализ по стандартным 12 локусам и 5 ETR локусам.
Анализ результатов сполиготипирования в базе данных SITVITWEB показал, что в Северной Америке почти все генотипы (LAM, Beijing, T, X, Haarlem) были найдены в одинаковых пропорциях (около 20%). В Южной Америке превалирует генотип LAM - 49,3%, генотипы T и Haarlem встречаются в 26,7% и 15,7% случаев, соответственно.
В Европе генотип Т является самым распространенным генотипом (35%), данный генотип преобладает в Северной, Южной и Западной Европе. В то время как генотип Haarlem преобладает в Восточной Европе и является вторым по значимости генотипом распространенным в Европе (24%).
В субрегионах Африки (кроме Западной Африки и Центральной Африки, где доминирует M.africanum -37% и 7,3%, соответственно) наиболее распространенным генотипом является LAM. Изоляты малоизученного семейства T присутствуют во всех субрегионах Африки в одинаковом количестве ~20%. Штаммы семейства Beijing были найдены в трех Африканских субрегионах (Северная, Восточная и Южная Африка) в разной степени, в самой высокой степени (21,5%) были идентифицированы в Южной Африке. Изоляты семейства CAS были найдены в
Восточной и Северной Африке в 11,8% и 7,2%, соответственно. Генотип S был выявлен в Северной Африке (8%) и Южной Африке (5,8%).
По результатам анализа данных сполиготипирования в базе данных SITVITWEB 51,20% изолятов из России («Северная Азия») принадлежали генотипу Beijing, самому распространенному генотипу в Центральной, Восточной и Юго-Восточной Азии (~50%). По классификации стран по регионам авторы статьи отнесли Россию к новому субрегиону (Северная Азия) вместо того, чтобы включить Россию в Восточную Европу. Это связано с географическим расположением страны и со схожим распространением специфических ТБ генотипов в России (в большинстве случаев китайского генотипа Beijing) и в Центральной, Восточной и Юго-Восточной Азии. Генотип EAI является самым часто встречающимся генотипом в Юго-Восточной и Южной Азии (37,6% и 33%, соответственно). Изоляты семейства CAS были выявлены в Южной и Западной Азии в 30,1% и 9,6% случаях, соответственно. Генотип Т является самым распространенным генотипом в Западной Азии (35,4%).
Было опубликовано несколько работ по изучению генотипов M.tuberculosis, распространенных в Казахстане [Kubica et.al., 2005; Skiba et.al., 2015; Akhmetova et.al., 2015].
Kubica и др. [Kubica et.al., 2005] в своей работе провели генотипирование 142 устойчивых клинических изолятов M.tuberculosis, которые были собраны в 2001 г. из 9 различных областей Казахстана. Результаты сполиготипирования показали, что 100 (70,4%) из 142 изолятов были отнесены к генотипу Beijing.
Skiba и др. [Skiba et.al., 2015] генотипировали 151 клинических изолятов M.tuberculosis из различных областей Казахстана, выделенных от ТБ пациентов в
2008 г. методами MIRU-VNTR анализа и сполиготипи-рования. Генотип Beijing был выявлен в 72,2% случаях (n=109), доминирующий класстер 94-32 (n=101). Другие семейства, которые были определены -LAM (n=17), Ural (n=8), NEW-1 (n=3) и новый кластер KAZ-1 (n=8). Мультирезистентные штаммы в значительной степени преобладали среди штаммов Beijing (64/109) и LAM (7/17) по сравнению с другими семействами (1/25; Р=0.0006 и 0.01, соответственно) [Skiba et.al., 2015].
В нашей предыдущей статье [Akhmetova et.al., 2015] среди 77 пиразинамид-устойчивых и пиразинамид-чувствительных клинических изолятов M.tuberculosis, собранных в 2011 г. из разных регионов Казахстана 78,4% изолятов принадлежали генотипу Beijing.
В работе Luo D и др. [Luo et.al., 2019], проведенной в провинции Цзянси Китая по результатам генотипирова-ния 157 мультирезистентных изолятов 84,1% всех образцов были отнесены к генотипу Beijing. Мутации, ассоциированные с устойчивостью к рифампицину и изониазиду были найдены в 93,6% случаях в rpoB гене и 88,5% случаях в katG гене, промоторной области fabG-inhA и oxyR-ahpC, соответственно среди мультирезистентных изолятов. Преобладала мутация Ser531Leu в гене rpoB (55,4%) и Ser315Thr в гене katG (56,3%). В другой работе [Afanas'ev et.al., 2011] было собрано 115 изолятов M.tuberculosis в Москве (Россия), в выборке преобладали МЛУ-ТБ образцы. Мутации в RRDR регионе rpoB гена были обнаружены у 64 (83,1%) из 77 рифампицин-устойчивых изолятов, наиболее распрастраненной мутацией была Ser531Leu (76,5%). Среди изониазид-устойчивых изолятов мутации были найдены в гене katG и промоторной области fabG-inhA у 79 (84%) из 94 изолятов.
В исследованиях Hillemann и др. [Hillemann et.al., 2005] было проведено секвенирование генов katG, промоторных областей fabG-inhA и oxyR-ahpC, и гена rpoB, отвечающих за лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам первого ряда изониазиду и рифампицину, соответственно 92 МЛУ-ТБ, 50 только изониазид устойчивых (INHr/RMPs) и 10 чувствительных изолятов M.tuberculosis из Казахстана. Анализ rpoB гена МЛУ-ТБ изолятов выявил 10 разных мутаций в 5 кодонах, где наиболее часто мутации встречались в кодоне 531 (65,2%), 526 (23,9%) и 516 (7,6%). В значительно высокой степени мутация rpoB S531L была найдена среди штаммов генотипа Beijing по сравнению с другими генотипами (71,2% vs. 46,2%, P=0.027). Среди всех 92 МЛУ-ТБ изолятов вне зависимости от их генотипа, мутация в кодоне 315 katG гена (S315T) была определена в 100% случаях. Однако, в контрольной группе INHr/RMPs S315T мутация в значительной степени преобладала среди штаммов семейства Beijing по сравнению с другими семействами (96,9% vs. 71.4%, P=0.012).
В нашей предыдущей работе, проведенной в 2009 г. [Kozhamkulov et.al., 2011] анализ мутаций в генах katG, промоторных областей fabG-inhA и oxyR-ahpC, и гене rpoB 323 лекарственно-устойчивых клинических изолятов M.tuberculosis (включая 259 МЛУ-ТБ, 59 изониазид-устойчивых и 13 рифампицин-устойчивых) идентифицировал мутации в S531L (82,7%) и S315T (98.4%) кодонах rpoB и katG генах ассоциированных с
рифампицин - и изониазид-устойчивостью являются самыми часто встречаемыми. В 526 (8,4%), 533 (1,5%) и 516 (1,1%) кодонах rpoB гена мутации были найдены в меньшей степени. И в 6,2% случаев мутации не были выявлены в rpoB гене рифампицин-устойчивых изолятов. Также как и в исследованиях Hillemann и др. [Hillemann et.al., 2005] мутации в промоторных областях fabG-inhA и oxyR-ahpC были определены менее чем в 10% случаев (включая двойные мутации).
Анализ литературных данных по лекарственной устойчивости и мутациям в генах, ассоциированных с мультирезистентностью показал, что в Казахстане и соседних странах отмечается преобладание мутаций S531L и S315T в rpoB и katG генах, соответственно с незначительным отклонением в частоте встречаемости в разных странах. Это подтверждает, что в данном регионе циркулируют и доминируют штаммы с мультирезистентной устойчивостью и представляют семейство Beijing.
Выводы
Была проведена оценка спектра мутаций в генах, отвечающих за лекарственную устойчивость M. tuberculosis к изониазиду и рифампицину и генотипирование 103 мультирезистентных (MDR) клинических изолятов M. tuberculosis распространенных в Казахстане. В настоящее время для популяции мультирезистентных штаммов M. tuberculosis, циркулирующей на территории Казахстана, характерна высокая частота встречаемости мутаций с аминокислотной заменой в 531 кодоне Ser^Thr гена rpoB, обуславливающая устойчивость к рифампицину и преобладание мутаций в 315 кодоне katG гена Ser^Thr, определяющем устойчивость к изониазиду. Более 80% мультирезистентных штаммов M.tuberculosis составляют штаммы семейства Beijing, наиболее вирулентного и распространенного штамма во многих регионах мира. В данном исследовании было определено, что в настоящее время штаммы семейства Beijing M.tuberculosis являются доминирующими среди мультирезистентных и лекарственно-устойчивых штаммов в Казахстане и являются основными генотипами.
Работа выполнена в рамках проекта «Изучение генетических особенностей лекарственно-устойчивых MDR и XDR клинических изолятов M.tuberculosis на основе данных полногеномного секвенирования и генотипирования» по грантовому финансированию №АР05134737 на 2018-2020 гг.
Конфликт интересов не заявлен.
Все авторы в равной мере принимали участие в проведении исследования и написании статьи.
Литература:
1. Afanas'ev M., Ikryannikova L., Il'ina E., Kuz'min A, Larionova E., Smirnova T, Chernousova L., Govorun V. Molecular typing of Mycobacterium tuberculosis circulated in Moscow, Russian Federation // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011. 30 (2): 181-91.
2. Ahmad S., Mokaddas E. Recent advances in the diagnosis and treatment of multidrug-resistant tuberculosis // Respir Med. 2009. №103. P. 1777-1790. 10.1016/j.rmed.2009.07.010.
3. Akhmetova A., Kozhamkulov U., Bismilda V., Chingissova L., Abildaev T., Dymova M., Filipenko M.,
Ramanculov E. Mutations in the pncA and rpsA genes among 77 Mycobacterium tuberculosis isolates in Kazakhstan // Int J Tuber Lung Dis. 2015. 19 (2): 179-184.
4. Chin K.L., Sarmiento M.E., Norazmi M.N., Acosta A. DNA markers for tuberculosis diagnosis // Tuberculosis. 2018. №113. P.139-152.
5. Demay C., Liens B., Burguiere T., Hill V., Couvin D., Millet J., Mokrousov I., Sola C., Zozio T., Rastogi N. SITVITWEB - A publicly available international multimarker database for studying Mycobacterium tuberculosis genetic diversity and molecular epidemiology // Infection, Genetics and Evolution. 2012. №12. P. 755-766.
6. European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis. Beijing/W genotype Mycobacterium tuberculosis and drug resistance // Emerg Infect Dis. 2006. №12. P. 736-743.
7. Jagielski T, Bakuta Z., Roeske K., Kaminski M., Napiórkowska A., Augustynowicz-Kopec E., Zwolska Z., Bielecki J. Detection of mutations associated with isoniazid resistance in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J Antimicrob Chemother. 2014. №69 (9). P. 2369-75. doi: 10.1093/jac/dku161. Epub 2014 May 22.
8. Hillemann D., Kubica T., Agzamova R., Bismilda V., Rusch-Gerdes S., Niemann S. Rifampicin and isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis strains isolated from patients in Kazakhstan // Int J Tuber Lung Dis. 2005. 9 (10): 1161-1167.
9. Kozhamkulov U., Akhmetova A., Rakhimova S., Belova E., Alenova A., Bismilda V., Chingissova L., Ismailov S., Ramanculov E., Momynaliev K. Molecular characterization of rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Kazakhstan // Jpn J Infect Dis. 2011. 64 (253-255).
10. Kubica T., Agzamova R., Wright A., Aziz M.A., Rakishev G., Bismilda V., Richter E., Rusch-Gerdes S., Niemann. The Beijing genotype is a major cause of drug-resistant tuberculosis in Kazakhstan // Int J Tuberc Lung Dis. 2005. №9 (6). P. 646-653.
11. Liu L., Jiang F., Chen L., Zhao B., Dong J., Sun L., Zhu Y., Liu B., Zhou Y, Yang J, Zhao Y, Jin Q., Zhang X. The impact of combined gene mutations in inhA and ahpC genes on high levels of isoniazid resistance amongst katG non-315 in multidrug-resistant tuberculosis isolates from China // Emerg Microbes Infect. 2018. №7 (1). P. 183. doi: 10.1038/s41426-018-0184-0.
12. Luo D., Chen Q., Xiong G., Peng Y., Liu T., Chen X., Zeng L., Chen K. Prevalence and molecular characterization of multidrug-resistant M.tuberculosis in Jiangxi province, China // Sci Rep. 2019. 9 (1): 7315.
13. Mathuria J.P., Srivastava G.N., Sharma P., Mathuria B.L., Ojha S., Katoch V.M. et al. Prevalence of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype and its association with drug resistance in North India // J Infect Public Health. 2016.
14. Ministry of Health of the Republic of Kazakhstan. Statistic TB Review (Editor Adenov M.M.). National TB Center, Almaty, 2018. P. 75 (in Russian).
15. Miotto P., Zhang Y, Cirillo D.M, Yam W.C. Drug resistance mechanisms and drug susceptibility testing for tuberculosis // Respirology. 2018. №23. P. 1098-1113.
16. Myo T. Zaw, Nor A. Emran, Zaw Lin. Mutations inside rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis // Journal of Infection and Public Health. 2018. №11. P. 605-610.
17. Nguyen L. Antibiotic resistance mechanisms in M. tuberculosis an update // Arch. Toxicol. 2016. №90. P. 1585-604.
18. Prim R.I., Marcos M.A., Senna S.G., Nogueira C.L., Figueiredo A.C.C. and de Oliveira J.G. Molecular profiling of drug resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis // Mem Inst Oswaldo Cruz. 2015. №110. P. 618-623.
19. Ramazanzadeh R., Sayhemiri K. Prevalence of Beijing family in Mycobacterium tuberculosis in world population: systematic review and meta-analysis // Int J Mycobacteriol. 2014. №3 (1). P. 41-45.
20. Rattan A., Kalia A., Ahmad N. Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspectives // Emerg Infect Dis. 1998. №4. P. 195-209.
21. Skiba Y., Mokrousov I., Ismagulova G., Maltseva E., Yurkevich N., Bismilda V., Chingissova L., Abildaev T, Aitkhozhina N. Molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population in Kazakhstan: a country-wide study // Tuberculosis. 2015. №95. P. 538-546.
22. Sreevatsan S., Pan X., Zhang Y., Deretic V., Musser J.M. Analysis of the oxyR-ahpC region in isoniazid-resistant and-susceptible Mycobacterium tuberculosis complex organisms recovered from diseased humans and animals in diverse localities // Antimicrob Agents Chemother. 1997. №41. P.600-606.
23. Zhang Y., Heym B., Allen B., Young D., Cole S. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis // Nature. 1992. №358. P. 591-3.
24. Zhang Y., Yew W.W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Int J Tuberc Lung Dis. 2009. №13. P. 1320-1330.
25. World Health Organization (1998): Laboratory services in tuberculosis control. Part III: culture. Global Tuberculosis Programme (WHO/TB/98.258). Geneva: World Health Organization, 1998, P.10-28.
26. World Health Organization (2003): Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis: Second edition World Health Organization. Global Tuberculosis Programme (WHO/CDS/TB/2003.320). Geneva: World Health Organization, 2003, P.8-12.
27. World Health Organization. Global tuberculosis report
2017. Geneva: World Health Organization, 2017. P.21
28. World Health Organization. Global tuberculosis report
2018. Geneva: World Health Organization, 2018. P.1-4.
Контактная информация:
Ахметова Айнур Жармухамбетовна - MSc, научный сотрудник Лаборатории геномной и персонализированной
медицины, ЧУ «National Laboratory Astana», Назарбаев университет.
Почтовый адрес: 010000, г. Нур-Султан, проспект Кабанбай батыра, 53, блок S1, кабинет 409.
E-mail: ainur.akhmetova2@nu.edu.kz;
Телефон: +7 7172 70 93 18
