CC BY
50
УДК 664
Е. В. Никитина
ИЗМЕНЕНИЯ МИКРОСТРУКТУРЫ КАРТОФЕЛЬНОГО КРАХМАЛА ПРИ МОДИФИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АМИЛАЗОЙ BACILLUS SUBTILIS В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА
Ключевые слова: ферментно модифицированные картофельные крахмалы, бактериальные амилазы, световая микроскопия.
С помощью бактериального мультиферментного препарата амилосубтилин получены ферментно модифицированные картофельные крахмалы. В работе варьировали концентрацию используемого для модификации фермента. В результате были получены крахмалы с различными свойствами. Были изучены особенности микроструктурных изменений в зависимости от времени нахождения в водном растворе. Предложена взаимосвязь изменений крахмального зерна и эмульгирующей ёмкости крахмальных клейстеров.
Keywords: enzyme modified potato starches, bacterial amylases, light microscopy.
Enzyme modified starches were prepared by means of a bacterial multienzyme preparation Amylosubtilin. Concentration of the enzyme used for modification was varied. Starches with various properties have been received. Features of microstructural changes depending on the time spent in water solution have been studied. The interrelation of changes of starched grain and the emulsifying capacity of starched pastes is offered.
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
Введение
Крахмал является основным запасающим веществом у многих растений, он является важным источником энергии для прорастания семян, и, конечно, крахмал - это ценный материал для продовольственных и непродовольственных отраслей промышленности. Ценность его обусловлена уникальными структурирующими свойствами.
Источником крахмала могут быть зерновые культуры, бобы, корни клубни, но главным источником в мировом масштабе является кукуруза. В Соединенных Штатах (производитель больше чем 60% мирового крахмала), это - почти единственный промышленный материал для извлечения крахмала.
В мировом производстве доля кукурузного крахмала составляет приблизительно 83%, на пшеницу приходится 7 %, картофель - 6 %, тапиоку - 4 %. В Европе увеличение использования кукурузы как сырье для производства крахмала стало увеличиваться. Причина этого состоит в том, что стали доступны сорта, подходящие для культивирование в европейских климатических условиях [1].
Почти 53% общего производства крахмала используются в пищевой промышленности (конфеты -18%, безалкогольные напитки - 11%, другая еда -24%). Из непродовольственного сектора (полная доля 46%), 28% используются для производства бумаги, картона и рифленого правления, и 13% используются для брожения [2].
Разнообразие сырья, используемого для извлечения крахмала, приводит к получению широкого спектра крахмалов, варьирующихся по гранулометрическому составу, морфологии и физико-химическим свойствам. Согласно размеру отдельных гранул, крахмалы могут быть сгруппированы в четыре класса [3]: крупные -выше 25 мкм, средние - от 10 до 25 мкм, маленьких -от 5 до 10 мкм, и очень маленький - ниже 5 мкм. В
некоторых случаях наблюдается бимодальное распределение размера (преобладание маленьких и больших гранул). Гранулы картофельного крахмала принадлежат первому классу; большинство зерновых крахмалов показывает бимодальный размер; овсяное зерно, гречневая крупа, рисовое просо представляют класс мелкого крахмала.
Рассматривая их морфологию, гранулы крахмала могут быть классифицированы как овальные, продолговатые, сферические, многоугольные, нерегулярные или формы линзы. Распределение размера гранул в экземпляре может быть основным фактором, ответственным за свойства крахмала: они могут представляться в скоплении или объединяться в регулярные группы, которые влияют на его поведение во время транспортировки и хранения, что в свою очередь может затронуть качество конечного продукта [4].
После нагревания крахмала в водном растворе его гидролизируют химически или ферментативно до мальтодекстринов, мальтозы и глюкозы. Ферментативная модификация крахмала в промышленных условиях, главным образом, основана на использовании ферментов для гидролиза крахмала, таких как амилаза, пуллуланаза и глюкоамилаза [5]. Ферментативно гидролиз протекает с разрушением а-1,4-или а-1,6-гликозидных связей в амилозе и амилопектине. Основным источником ферментов для процесса модификации крахмалов служат бактерии [6,7,8] и микроскопические грибы [9,10]. Ферментативные методы особенно интересны с той точки зрения, что они более безопасны для окружающей средой и потребителя, процессом гидролиза можно точнее управлять, проводить её в «мягких» условиях, а в результате реакции в меньшем количестве образуются побочные продукты [11].
Целью работы являлось выявление изменений, происходящих на структурном уровне в процессе ферментативной модификации бактериальным препаратом Амилосубитилин при варьировании концентрации фермента.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования выступали картофельные крахмалы: нативный (ГОСТ P 527912007). Для ферментной модификации использовали промышленный амилосубтилин (альфа-амилазная активность при 40 оС 600 U/г).
Препарат амилосубтилина получают путем высушивания культуральной жидкости после глубинного выращивания культуры Bacillus subtilis. Представляет собой однородный гигроскопичный порошок светло-бежевого или светло-серого цвета, растворимый в воде. Амилосубтилин Г3Х состоит из следующих ферментов: а-амилаза от 1000 до 600 U/г, глюкоамилаза - до 100 U/г, ß-глюканаза - до 500 ед/г, целлюлаза - до 30 ед/г, ксиланаза-до 10 ед/г, нейтральная протеаза - до 20 ед/г. Амилолитическая активность - 600 ед/г. Оптимальные условия действия: рН=4,5-7,0, температура 30-500С. Конечными продуктами действия амилосубтилина Г3х на крахмал являются декстрины различной молекулярной массы и олигосахариды, результатом действия глюкоамилаз и глюконаз является появление в среде глюкозы. Характеристика амилосубтилина представлена в таблице 1.
Таблица 1 - Основные характеристики амилосубтилина и условия действия
Модификацию осуществляли в воде при рН=7,0 в течение 1 часа. Концентрация крахмала в реакционной смеси 30 г/100 мл.
В случае Амилисубтилина активность в реакционной смеси была 8,3 и/г крахмала (для образца 5), что соответствует внесению 0,0067 г препарата/г крахмала (0,201 г/100 мл 30% крахмального раствора) (расчетная амилазная активность амилосубтилина в этом случае составляла 8,3 И/г крахмала), реакцию проводили при 40 оС.
Реакцию гидролиза останавливали путем добавления концентрированной серной кислоты до рН=2. Затем крахмал отделяли от жидкости фильтрованием, промывали дистиллированной водой с последующем фильтрованием и высушивали в сушильном шкафу с принудительной конвекцией при 40 оС. Полученные крахмалы применяли для исследований.
Таблица 2 - Концентрация вносимого в крахмальную суспензию препарата
амилосубтилина
Номер образца Наименование полученного крахмала Концентрация ферментного препарата, г/г крахмала
1 Нативный 0
2 AM-0,05 0,00033
3 AM-0,1 0,00067
4 AM-0,5 0,0033
5 AM-1 0,0067
6 AM-4 0,0268
7 AM-6 0,0402
8 AM-8 0,0536
Для микроскопирования использовали предварительно выдержанные при комнатной температуре в течение 60 мин и 24 часа 5% растворы крахмалов, которые окрашивали раствором Люголя (I2/KI раствор; 1:2 w/w). Немедленно после окрашивания просматривали под световым микроскопом Axio Imager в комплекте с видео камерой. Для просмотра использовали увеличение в 1000 раз под имерсионным маслом.
Эмульгирующая ёмкость. Измерение проводили методом Omojola и др [12] был использован с небольшими изменениями. Образец (1 г) диспергируют в 5 мл дистиллированной воды с помощью вихревой мешалки в течение 30 секунд. После полного диспергирования, 5 мл растительного масла (подсолнечное
рафинированное масло) добавляли постепенно и смешивание продолжают в течение еще 30 с. Суспензию центрифугировали при 1600 оборотах в минуту в течение 5 мин. Объем масла, отделенного от образца, оценивали непосредственно в пробирке. Эмульгирующая емкость - это количество масла, которое эмульгируется 1 гр образца.
Результаты исследований и обсуждение
Исследования микроструктуры нативного крахмала показали, что форма большинства гранул округлая, овальная иногда с ровными ломаными краями, поверхности гранулы были гладкими и без зазубрин, хорошо концентрирует раствор Люголя, окрашиваясь в интенсивно синий цвет (рис. 1.1).
В образцах ясно были видны синие области, которые соответствуют накоплений амилозы. После инкубации крахмальной суспензии 24 ч происходило набухание крахмальных зерен, о чем свидетельствовало увеличение размеров гранул и уменьшение интенсивности окраски (рис. 1.1а).
Показатель Норма
Амилолитическая активность, ед/г препарата 600 ±100
Массовая доля влаги, %, не более 8,0
Оптимальные условия действия: рН температура 4,5 - 7,0 30 - 50 °С
Рис. 1 - Микроструктурная картина ферментно модифицированных крахмалов в сравнении с нативным картофельным крахмалом: 1 -Нативный, 2 - АМ-0,05, 3 - АМ-0,1, 4 - АМ-0,5, 5 -АМ-1, 6 - АМ-4, 7 - АМ-6, 8 - АМ-8. Без инкубации, Инкубация 24 ч при комнатной температуре (а)
После обработки крахмала невысокими дозами фермента (рис. 2, 3, 4) у гранул малого размера появилась четкая область просветления по периферии, что свидетельствует о снижении способности связываться с раствором Люголя. Форма малых гранул стала неправильной, с обрезанными краями. После инкубации (рис. 2а, 3 а, 4а) области просветления становятся еще более заметными, видимо, вследствие проникновения воды и разбухания крахмального зерна. На крупных гранулах ферментно обработанных крахмалов появлялись радиальные линии, не характерные для нативного крахмала, возможно, их появление обусловлено частичной ферментацией
поверхностного слоя зерен крахмала. Проявления всех описанных эффектов увеличивались по мере увеличения концентрации крахмала.
Начиная с образца № 5, когда концентрация фермента была 0,0067 г/г крахмала, резко ухудшается способность крахмальных зерен удерживать йод, что может быть следствием разрушения амилозной фракции. Микроструктура сильно изменяется в сторону потери формы гранул, они становятся ломаными, со множеством выбоин, щелями (рис.1.5-7). А в случае образца 8, крахмал представляет из себя обломки крахмальных зерен с ломаными формами. Образцы 5-8 (рис.1.5а-8а) после инкубации с водой набухли и приобрели округлые формы, кроме того разрушенные зерна приобрели волокнистую структуру, которая может служить основой для проявления эмульгирующих свойств высоко гидролизованного крахмала.
Исследования эмульгирующейся ёмкости крахмальных клейстеров показало, что этот показатель резко отличается от нативного только в случае 6 образца (рис. 2).
Рис. 2 - Эмульгирующая ёмкость ферментно модифицированных крахмалов в сравнении с нативным картофельным крахмалом: 1 -Нативный, 2 - АМ-0,05, 3 - АМ-0,1, 4 - АМ-0,5, 5 -АМ-1, 6 - АМ-4, 7 - АМ-6, 8 - АМ-8
Интересно, что у этого образца есть сочетание низкого содержания амилозы (плохо удерживание раствор Люголя) и достаточно хорошей сохранности крахмальных зерен. Видимо, такое сочетание физико-химических характеристик обуславливает хорошие эмульгирующие свойства этого ферментно модифицированного картофельного крахмала.
Литература
1. Baere H.D. // Starch, 1999, 51, 189-193.
2. Bergthaler W.J. The status of wheat starch and gluten production and uses in Europe. 2004, in: Starch: Progressin Structural Studies, Modifications and Applications. Chapter 31 (eds. P. Tomasik , V.P. Yuryev, E. Bertoft).PSFT Malopolska Branch, pp. 417-436.
3. Lindeboom N., Chang P.R., Tyler R. // Starch, 2004, 56, 89-99.
4. Knowlton T. M., Carson J. W., Klinzing G. E., Wen-Ching Yang, T// Chem. Engin. Progress, 1994, 90, 4, 44-54.
5. Molenda M., Stasiak M., Horabik J., Fornal J., Blaszczak W., Ornowski A. // Pol. J. Food Nutr. Sci. 2006, Vol. 15/56, No 2, pp. 161-168.
6. Auh J.-H., Chae H. Y., Kim Y.-R., Shim K.-H., Yoo S.-H, Park K.-H. // J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2314-2319
7. Nikitina E.V., Gabdukaeva L.Z., Egkova M.S. // Вестник Казанского технологического университета, 2015, T.18, № 16, С.265-269
8. Li D., Ma Y. // African J. Biotechnology. 2011. V. 10, №17, 3430-3435
9. Kasprzak M. M., Larke H. N., Larsen F. H., Knudsen K.E. B., Pedersen S., Jorgensen A. S. // Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 929-942
10. Yadav, B.S., Sharma, A., Yadav, R.B., // J. Agric. Technol. 2007. 3 (1), 21-27.
11. Le, Q.T.; Lee, C.K.; Kim, Y.W.; Lee, S.J.; Zhang, R.; Withers, S.G.; Kim, Y.R.; Auh, J.H.; Park, K.H. // Carbohydr. Polym. 2009, 75, 9-14.
12. A. Kato, K. Minaki, K. Kobayashi, J. Agric. Chem, 1993, 41, 540-543.
13. Omojola M. O., Akinkunmi Y. O., Olufunsho K. O., Egharevba H. O. and Martins E. O. // African Journal of food, agriculture, nutrition and development. 2010, 10(7): 2884 - 2900
© Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, ev-nikitina@inbox.ru. © E. V. Nikitina - PhD, associate Professor of Technology of food production KNRTU, ev-nikitina@inbox.ru/
