CC BY
59
УДК 664
М. С. Цыганов, Е. В. Никитина ВЛИЯНИЕ НАГРЕВАНИЯ НА ГИСТОЛОГИЧЕКИЕ СВОЙСТВА ТАПИОКОВЫХ КРАХМАЛОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАЗНЫМИ АМИЛОЛИТИЧЕКСИМИ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ
Ключевые слова: микроскопирование, амилосубтилин, амилаза, Bacillus licheniformis, тапиоковый крахмал, гистологические
свойства, физико-химические свойства.
Гистологические свойства ферментно модифицированного тапиокового крахмала были изучены после нагревания до 50 ° C. Ферментами для модификации служили промышленный амилосубтилин Г3Х и амилаза Bacillus licheniformis, которые использовали при варьировании концентрации. Наблюдаемое различное поведение гранул крахмалов при микроскопировании, вероятнее всего связано со специфичным механизмом действия ферментов. Амилосубтилиновый крахмал при максимальной концентрации фермента (А-1) демонстрировал потерю стойкости к температурной обработке, высвобождение содержимого гранулы и образование геля. Крахмал, модифицированный амилазой Bacillus licheniformis, (Bl-1), напротив, не терял полностью формы гранул, не образовывал гель и имел структуру, напоминающую волокна.
Key words: microscopy, amylosubtilin, amylase, Bacillus licheniformis, tapioca starch, histological properties, physico-chemical
properties.
The historical properties of enzymatically modified tapioca starch were studied after heating to 50 ° C. The enzymes for modification were industrial amylosubtilin G3X and amylase Bacillus licheniformis, which were used at varying concentrations. The observed different behavior of starch granules during microscopy is most likely associated with a specific mechanism of action of the enzymes. Amylosubtilin starch at the maximum concentration of the enzyme (A-1) showed a loss of resistance to temperature treatment, the release of granule contents and the formation of a gel. Starch modified with amylase Bacillus licheniformis, (Bl-1) - on the contrary, did not completely lose shape of the granules, did not form a gel and had a structure resembling fibers.
Введение
В процессе фотосинтеза крахмал в виде гранул накапливается в различных типах растительных тканей и органах растений: листьях, корнях, побегах фруктах, зернах и стеблях. Этот полисахарид является одним из самых распространенных углеводов, обнаруженных в природе, и является основным источником питания как для человека, так и для животных. О его значении в качестве продукта питания можно судить по тому, что на его долю приходится более 30 % среднего потребления по сухому весу в продуктах и более 25 % по энергетической ценности [1].
Из наиболее используемых в промышленных масштабах крахмалов можно выделить пшеничный, кукурузный, картофельный, тапиоковый [2].
Тапиоковый крахмал получают из маниоки (Manihot esculenta) - неприхотливой, легко выращиваемой культуры, обладающей высокой устойчивостью к засухе, что позволяет ей расти в районах с низким уровнем осадков или бесплодной почвой. Крахмал маниоки, как нативный, так и модифицированный, широко используется в качестве ингредиента в пищевых продуктах, в частности в качестве загустителя и стабилизатора, благодаря отсутствию запаха и вкуса, и способности мгновенно раскрывать вкус пищи, в которую он был добавлен [3]. Более того, переход на широкое потребление данного крахмала связан со стремлением пищевой промышленности удовлетворить потребителей, которые предпочитают питаться продуктами с низким содержанием жира, отсутствием глютена, а также
продуктами, не содержащие в своем составе химически модифицированные крахмалы [4].
Форма и размер гранул крахмала тапиоки широко варьируется: встречаются круглые, усеченные, цилиндрические, овальные и составные гранулы размерами 4-43 мкм и 3-32 мкм. Однако, гранулы нативного тапиокового крахмала в основном круглые, с плоской поверхностью с одной стороны, содержащую коническую ямку, которая простирается до четко определенного эксцентричного рубчика [5].
Содержание амилозы в тапиоковом крахмале находится в диапазоне от 8 до 27 % [6], температура желеобразования от 49 до 73 °С [7], степень (объем) набухания 46 - 71 мл/г [8], растворимость от 25 до 48 % [9]. Высокий диапазон желатинизации объясняется более высоким уровнем кристалличности, поэтому молекуле воды требуется большее количество времени для проникновения в кристаллические области [10]. Энтальпия желатинизации тапиокового крахмала (АН, термодинамический потенциал) находится в промежутке от 6,8 до 22 Дж/г [11].
Физико-химические свойства крахмалов напрямую зависит от содержания амилозы и амилопектина. При нагревании от комнатной температуры (26 °С) до различного диапазона температур может происходить несколько процессов: адсорбция с поглощением молекул воды на поверхности гранул крахмала, солюбилизация и набухание с проникновением молекул воды во внутренние слои и увеличением объема гранул, желатинизация с разрушением молекулярного порядка в гранулах крахмала, приводящего к
необратимым изменениям свойств [12]. Растворенный (10-20 %) и слегка набухший крахмал в холодной воде за счет диффузии в аморфных частях гранулы при дальнейшем нагревании утрачивает первоначальный структурный порядок. Происходит расширение гранул и вымывание амилозы в межкристальную фазу (процесс клейстеризации), повышается вязкость. Последующее нагревание приводит к желатинизации [13]. Во время желатинизации, крахмальные гранулы необратимо набухают, утрачивают первоначальный
молекулярный порядок и образуют гель. Данный гель состоит из разбухших гранул, основу которых составляет амилопектин, и непрерывной фазы, образующейся в результате диффузии (вымывания) амилозы из гранул во внешнюю среду [14].
Такое различное поведение крахмалов при нагревании, а также их широкая вариация физико-химических свойств привела к повсеместному использованию крахмала и его производных во многих промышленных процессах, особенно в пищевой промышленности в качестве многофункционального ингредиента [15], что, в свою очередь, привело к разработке многочисленных методик обработки и разрушения крахмала. Первоначально производство модифицированного крахмала выполнялось с использованием химических реагентов, однако в последние годы данная модификация была в значительной степени заменена ферментативными методами. Это изменение было частично связано с тем, что ферменты являются более безопасными и экологически чистыми, как и для окружающей среды, так и для потребителей крахмалопродуктов. Более того, использование ферментов экономически выгодно, поскольку они выполняют специфичные реакции гидролиза, дают более высокие выходы целевого продукта, а также создают меньше побочных продуктов и, следовательно, требуют меньшей очистки [16].
Целью данной работы являлся анализ гистологических свойств нагретого до 50 °C, нативного и ферментно модифицированных тапиоковых крахмалов, при варьировании концентрации ферментов, в качестве которых использовали амилосубтилин и амилазу Bacillus licheniformis.
Материалы и методы исследования
Используемые крахмалы. В качестве объектов исследования выступал нативный тапиоковый крахмал (ГОСТ Р 51953-2002) и крахмалы, ферментированные амилосубтилином и препаратом амилазы B. licheniformis.
Модификацию осуществляли в дистиллированной воде при pH=7,5, Т=40 °C и продолжительности 60 мин с регулярным перемешиванием смеси крахмала и фермента в воде. Концентрация крахмала в реакционной смеси 30г/100мл. Реакцию гидролиза останавливали путем добавления концентрированной серной кислоты до pH=2. Затем крахмал отделяли от жидкости фильтрованием и высушивали при 40 °C в сушильном шкафу с дальнейшим высушиванием при комнатной температуре.
Крахмалы после модификации были названы согласно используемого фермента и его активности, которая варьировала от 8,3 U/г до 0,415 U/г крахмала. Образцы, полученные в результате ферментации амилосубтилином, обозначили А-1; А-0,5; А-0,25; А-0,1; А-0,05 [17], а крахмалы, модифицированные амилазой B. licheniformis - Bl-1; Bl-0,5; Bl-0,25; Bl-0,1; Bl-0,05 [18].
Для световой микроскопии использовали предварительно растворенные в дистиллированной воде в течение 10 мин 5 % растворы крахмалов, которые медленно нагревали на водяной бане до 50 °C, до загустевания клейстера и осветления массы, затем окрашивали раствором Люголя (I2/KI раствор; 1:2 w/w). Немедленно просматривали под световым микроскопом Axio Imager Carl Zeiss, Германия в комплекте с видеокамерой. Для просмотра использовали увеличение в 400 раз.
Результаты исследования
Гранулы нативного тапиокового крахмала, нагретого до 50 °C, имели правильную округлую или овальную форму, ровные контуры, гладкую поверхность. Раствор Люголя интенсивно окрашивал гранулы в темно-фиолетовый цвет, что может свидетельствовать о высоком содержании амилопектина (рис. 1).
Нагревание экспериментальных образцов крахмалов, обработанных в малых дозах амилосубтилином (А-0,05; 0,1), привело к набуханию крупных гранул, их частичному сегментированию. Визуализируются радиальные линию, вдоль которых проявлялись расколы зерна. мелкие гранулы ввиду свей большей компактности сохранили округлую форму и ровный край.
Гранулы образцов А-0,25 и А-0,5 после нагревания до 50 °C потеряли свою форму, что проявлялось в набухании с последующим расплыванием крупных гранул, потере четких границ, в большом числе присутствуют осколки с обрезанным краям. В случае мелких гранул еще просматриваются границы, однако, увеличившаяся прозрачность гранул, свидетельствует об их набухании.
В случае образца А-1, обработанного наибольшей дозой фермента, отсутствовали границы гранул, видимо, происходило частичное желирование зерен, что визуализируется под микроскопом в виде полупрозрачных тяжей.
Что касается крахмалов, модифицированных амилазой Bacillus licheniformis, то гранулы, обработанные невысокой дозой (0,415 до 0,83 U/г крахмала, что соответствовало образцам Bl-0,05, Bl-0,1 и Bl-0,25), при термическом воздействии набухали, появлялись полупрозрачные структуры, в некоторых частицах просматривались кристаллы амилозы в виде темно-синих гранул.
Дальнейшее увеличение количества вносимого при модификации фермента приводило к получению крахмалов (образцы Bl-0,5 и 1), у которых при нагревании в воде гранулы разбухали, появлялись выбоины и щели. Однако в отличие от «амилосубтилинового» крахмала Bl-образцы
дефрагментировались на мелкие осколочные структуры, не теряли размытости границ, не образовывали гели. Более того, крахмал, обработанный максимальной дозой фермента (В1-1), после температурной обработки имел структуру, напоминающую волокна, мицеллы, что может служить основой для проявления эмульгирующих свойств.
Нативный
Рис. 1 - Морфологические свойства нативного и ферментно модифицированных тапиоковых крахмалов при температуре 50 °C
Обсуждение
Морфогистологическое исследование двух типов крахмалов, гидролизованных амилолитическими препаратами Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, выявило различия в характере поведения гранул крахмалов при нагревании до температур близкой к желитинизации. Ранее нами были проведены исследования гистологических характеристик этих же крахмалов в условиях комнатной температуры [19].
Окраска гранул нативного тапиокового крахмала, нагретого до 50 °C, - интенсивная, практически равномерная, что свидетельствует о взаимодействии крахмала и раствора Люголя и образовании комплексных соединений включений (клатратов) канального типа, в которых амилоза и амилопектин являются «молекулой-хозяином», а йод - «молекулой-гостем». Данная реакция сопровождается изменением бурой окраски раствора Люголя на сине-фиолетовую [20]. Интенсивность окраски, полученной в ходе температурной обработки и последующем взаимодействии с I2 (раствором Люголя), возможно может быть объяснена повышенным взаимодействием связанной (структурной) амилозы, содержащейся в нативном крахмале. После нагревания на водяной бане и взаимодействии с раствором Люголя гранулы модифицированных тапиоковых крахмалов, напротив, практически не окрасились, однако, появилась четкая область просветления по периферии, что может быть следствием разрушения структурной амилозной фракции и высвобождением ее в межгранульное пространство, а также концентрированием амилопектина на поверхности гранул [21].
Гранулы амилосубтилинового тапиокового крахмала при нагревании до температуры 50 °C набухают и разрушаются с высвобождением содержимого во внешнюю среду (рис. 1). При этом количество фермента, вносимого для получения экспериментальных образцов тапиокового крахмала из нативного, существенно влияет на интенсивность процессов. Амилосубтилин является комплексным препаратом и состоит из ß-глюканазы - до 500 ед/г, а-амилазы от 1000 до 1600 U/г, глюкоамилазы - до 100 U/г, целлюлазы - до 30 ед/г, нейтральной протеазы - до 20 ед/г, ксиланазы - до 10 ед/г [22], благодаря чему способен разрушать амилозу и амилопектин, преимущественно проникая через поры на поверхности гранул [23]. Кроме того, данный фермент способен, непосредственно, разрушать клеточную стенку высших растений, в основном состоящую из целлюлозы и гемицеллюлозы [24]. Продуктами ферментной модификации является комплекс соединений: смесь линейных и разветвлённых олигосахаридов, мальтозы, глюкозы, широкий ряд а-предельных декстринов, изомальтоза и мальтотриоза [25]. Данный механизм действия фермента, возможно, объясняет наблюдаемое при термической обработке интенсивное набухание, разрушение,
высвобождение содержимого гранул, модифи-
цированных тапиоковых крахмалов, во внешнюю среду и образование неокрашиваемого раствором Люголя геля у образцов А-0,5 и А-1 (рис. 1).
Гипотеза о возможном влиянии связанной (структурной) амилозы в грануле тапиокового крахмала на интенсивность окрашивания при взаимодействии с раствором Люголя в процессе термической обработки подтверждается данными о содержании свободной амилозы в нативном крахмале по отношению к ферменто модифицированному в среднем 1:4 (табл. 1).
Таблица 1 - Влияние ферментной обработки на физико-химические и технологические свойства тапиоковых крахмалов
Исследования эффекта температурной обработки на гранулы ряда тапиоковых крахмалов, полученных при модификации различной концентрацией амилазы B. licheniformis, выявили иную тенденцию, отличную от обработки амилосубтилином.
Различное поведение гранул крахмалов, обработанных амилосубтилином и амилазой Bacillus licheniformis при нагревании, несмотря на схожесть физико-химически свойств (табл. 1), может быть объяснено различными механизмами действия мультиферментных препаратов, их минорными активностями.
Экспериментальный термостабильный
ферментный препарат в виде культуральной жидкости B. licheniformis, напротив, обладает ведущей а-амилазной активностью 250 U/мл (40 °C). Фермент, возможно, активен преимущественно по отношению к амилозе, разрушая гранулы крахмала, образует глюкозу и олигосахариды, при этом обнажая структурный «амилопектиновый скелет» [26]. Подтверждением данной гипотезы является замедленное по сравнению с «амилосубтилиновым» крахмалом видимое набухание гранул, при равной активности фермента. Кроме того, отсутствуют крайне мелкие гранулы и «амилозный» гель, выявлено наличие темного окрашенного йодно-крахмального клатрата, в виде разбухших амилопектиновых осколков, что свидетельствует о разрушении амилозы и увеличении доли амилопектина на поверхности гранул, при температурной обработке экспериментальных образцов (рис. 1).
Другими подтверждениями ведущей роли механизма действия фермента на физико-химические свойства ферментно
модифицированного тапиокового крахмала, в процессе температурного воздействия, являются данные относительно технических свойств, исследуемых крахмалов. Так, желатинизированный крахмальный гель, полученный в ходе нагревания на водяной бане, у «амилосубтилиновых» образцов имел повышенную динамическую вязкость, густую непрозрачную текстуру, прозрачность которой повышалась с уменьшением активности фермента, а у крахмалов, модифицированных амилазой Bacillus licheniformis, наоборот, гель был жидким и прозрачным (табл. 1) [17,18]. Наблюдаемый эффект был замечен и рядом других исследователей, которые также сделали вывод, что увеличение содержания амилозы и снижение вязкости происходят из-за перехода амилопектина в мальтодекстрины, которые обладают более короткими цепями и образуют более жидкие растворы [27, 28]. Очевидно, по той же причине происходит и увеличение температуры желатинизации для В1 образцов: оставшиеся после ферментной модификации гранулы с преобладанием амилопектиновой фракции при нагревании разрушаясь образуют мальтодекстрины, имеющие большее количество водородных связей, требующих более высокие энергозатраты на желатинизацию [29].
Таким образом, данные о влиянии термической обработки на полученные в ходе исследования гистологические свойства тапиоковых крахмалов, модифицированных промышленным
амилосубтилином Г3Х и амилазой Bacillus licheniformis, выявили очевидное различие в специфичности механизма действия ферментов. Эти различия заметны тем более, чем выше концентрация ферментов для модификации крахмалов, и это вносит значительные корректировки в физико-химические, а стало быть, и в технологические свойства ферментно модифицированных крахмалов.
Литература
1. Galliard T. // Starch: properties and potential. - 1987. -P.1-15.
2. Statistics. FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fao.org/statistics/en/, свободный. - Проверено 23.06.2017.
3. Breuninger W.F., Piyachomkwan K., Sriroth K. // Starch. - 2009. - P.541-568.
4. FAO - News Article: Cassava's huge potential as 21st Century crop [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fao.org/statistics/en/, свободный. - Проверено 01.07.2017.
5. Jane J.L., Kasemsuwan T., Leas S., Zobel H. & Robyt J.F. // Starch-Starke. - 1994. - V. 46. - №. 4. - P. 121-129.
6. Gallant D.J., Bewa H., Buy Q.H., Bouchet B., Szylit O. & Sealy L. // Starch-Starke. - 1982. - V. 34. - №. 8. - P. 255262.
7. Perez E.E., Breene W.M., Bahnassey Y.A. // Starch-Starke. - 1998. - V. 50. - №. 2-3. - P. 70-72.
Вид крахмала Содеражание амилозы, % Дестрозный эквивалент, г глюкозы/100 г крахмала Динамическая вязкость, Т Температура желирования, °C
Нативный 5,22 10,55 8,43 52,7
А-0,05 20,22 4,26 2,74 55,1
А-0,1 22,69 4,77 3,17 52,1
А-0,25 24,99 5,49 2,03 52,3
А-0,5 23,54 4,26 4,52 51,8
А-1 22,26 1,73 4,85 50,9
Bl-0,05 22,69 3,89 3,08 55,0
Bl-0,1 25,33 6,27 1,44 54,8
Bl-0,25 23,71 5,10 2,40 55,8
Bl-0,5 20,47 5,31 3,98 57,5
Bl-1 16,47 3,97 4,33 59,9
8. Farhat I.A., Oguntona T., Neale R.J. // Journal of the Science of Food and Agriculture. - 1999. - V. 79. - №. 15. -P. 2105-2112.
9. Woolfe J.A. // Cambridge University Press. - 1992. - P. 643.
10. Hoover R., Sosulski F. // Starch-Starke. - 1986. - V. 38. -№. 5. - P. 149-155.
11. Wootton M., Bamunuarachchi A. // Starch-Starke. - 1979. -V. 31. - №. 6. - P. 201-204.
12. Hermansson A.M. Developments in the understanding of starch functionality / A.M. Hermansson, K. Svegmark // Trends in Food Science & Technology. - 1996. - V. 7. - №. 11. - P. 345-353.
13. Hoover R. Effect of heat-moisture treatment on the structure and physicochemical properties of cereal, legume, and tuber starches / R. Hoover, T. Vasanthan // Carbohydrate Research. - 1994. - V. 252. - P. 33-53.
14. Lelievre J. // Journal of Applied Polymer Science. - 1974. -V. 18. - №. 1. - P. 293-296.
15. Thomas W.R., Imeson A. // Konjac gum. - 1997. - P.169-179.
16. Kennedy J.F., Knill C.J., Taylor D.W. // Handbook of Starch Hydrolysis Products and their Derivatives. - Boston, MA: Springer US, 1995. - P. 65-82.
17. HuKHTHHa E.B., UtiraHOB M.C. // BecTHHK TexHonoranecKoro yHHBepcmeTa. - 2017. - T.20. - №2, -C.156-158.
18. Никитина Е.В., Цыганов М.С., Вафина А.И. // Вестник технологического университета. - 2017. - Т.20. - №13, -C.133-136.
19. Цыганов М.С., Никитина Е.В. // Вестник технологического университета. - 2017. - Т.20. -№16, -С. 145-148.
20. Fadeev G.N., Sinkevich V.V., Bogatov N.A. // Russ. J. Phys. Chem. A. 2013. - V.87. - N.1. - P.35-39.
21. Никитина Е.В. // Вестник технологического университета. - 2016. - Т 19. - №7, - С.133-136.
22. ГОСТ Р 57232-2016 Препарат ферментный амилосубтилин ГЗХ. Технические условия. М.: Стандартинформ, 2016. - 7 с.
23. Gallant D.J., Bouchet B., Baldwin P.M. // Carbohydr. Polym. - 1997. - V.32. - N.3-4. - P.177-191.
24. Averous L., Fringant C., Moro L. // Polymer. - 2001. -V.42. - N.15. - P.6565-6572.
25. Kenyon M. // Encapsulation and Controlled Release Food Ingredients. - 1995. - V.590. - P.42-50.
26. Pen J., Molendijk L., Quax W.J., Sijmons P.C., Van Ooyen A.J., Van Den Elzen P.J., Rietveld K., Hoekema A. // Nat. Biotechnol. Nature Publishing Group. - 1992. - V.10. -N.3. - P.292-296.
27. Englyst H.N., Kingman S.M., Cummings J.H. // European J Clinical Nutrition. - 1992. - V.46. - P.33-50.
28. McPherson R. // Tappi J. - 1991. V.74. - N.7. - P.244-246.
29. Rong Y., Sillick M., Gregson C.M. // J. Food Sci. - 2009. - V.74. - N.1. - P.33-40.
© М. С. Цыганов - магистрант каф. технологии пищевых производств КНИТУ, refuser@inbox.ru; Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, НОЦ фармацевтики КФУ, ev-nikitina@inbox.ru.
© M. S. Tsyganov - the student of the department of technology of food production KNRTU, refuser@inbox.ru; E. V. Nikitina -PhD, Assoc. of prof. of Dep. of Meats and dairy foods technologies KNRTU, REC pharmacy, Kazan (Volga Region) Federal University, ev-nikitina@inbox.ru
