CC BY
16
DOI 10.24412/2074-5036-2021-3-9-13 УДК: 639.215.2:574.24:574.625
Ключевые слова: катехоламины, рыбы, кровь, стресс, диагностика, тиляпия Key words: catecholamines, fish, blood, stress, tilapia
Березина Д. И., Фомина Л. Л.
ИЗМЕНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КАТЕХОЛАМИНОВ В КРОВИ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ СТРЕССА КАК БИОМАРКЕР У ТИЛЯПИЙ OREOCHROMIS NILOTICUS
CHANGES IN THE CONCENTRATION OF CATECHOLAMINES IN THE BLOOD IN A CONDITION OF AN EXPERIMENTAL MODEL OF STRESS AS A BIOMARKER IN TILAPIA OREOCHROMIS NILOTICUS
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия имени Н.В. Верещагина» Адрес: 160555, Вологодская обл., г. Вологда, с. Молочное, ул. Шмидта, д. 2 Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Vologda State Dairy Farming Academy by N.V. Vereshchagin", Vologda Region, Vologda, Molochnoe, Shmidta Str., 2. Russia, 160555
Березина Дарья Игоревна, ассистент кафедры внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства, младший научный сотрудник «АкваБиоЦентр», e-mail vetxwork@gmail.com Berezina Daria Igorevna, Assistant at Dept of Internal Noninfectious Diseases, Surgery and Obstetrics,
Junior Researcher at "AquaBioCenter", e-mail vetxwork@gmail.com of Vologda SDFA Фомина Любовь Леонидовна, кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства ФГБОУ ВО Вологодской ГМХА им. Н.В. Верещагина,
e-mail fomina-luba@mail.ru Fomina Luybov Leonidovna, PhD of Biological Sciences, Associate Professor at Chair of Internal Noninfectious Diseases, Surgery and Obstetrics of Vologda SDFA, e-mail fomina-luba@mail.ru
Аннотация. В ихтиологической практике широко используется изучение стресс-реакций путем имитации стресса синтетическими кортикостероидами. В исследованиях экзогенного стресса у рыб интерпретация стрессового влияния, как правило, производится по повышению уровня эндогенного кортизола, однако синтетические кортикостероиды (дексаметазон, бетаметазон и др.) подавляют выработку эндогенного кортизола, в связи с чем возникает вопрос о том, является ли уровень катехоламинов крови рыб наиболее подходящим параметром для измерения уровня стресса в рамках таких исследований. В данной работе приведена динамика плазменного уровня катехоламинов (адреналина, норадреналина, дофамина и серотонина) при имитации острого и хронического стресса у тиляпии O.niloticus путем однократной инъекции дексаметазона первой экспериментальной группе и бетаметазона второй экспериментальной группе в сравнении с контрольной группой (без инъекции). Анализ сыворотки крови производился перед инъекцией, а также через 21 день после обработки. Выявлена широкая внутривидовая изменчивость уровней катехоламинов у тиляпий, а также не рекомендовано измерение уровня катехоламинов при гормональной модуляции стресса кортикостероида-ми за счет дороговизны, трудозатратности и чувствительности измерений, рекомендован дальнейший поиск стресс-маркеров в рамках исследований данного типа.
Summary. In ichthyologicalpractice, the study of stress responses by simulating stress with synthetic corticosteroids is widely used. In studies of exogenous stress in fish, stress effects are usually interpreted by increasing the level of endogenous cortisol. However, synthetic corticosteroids (dexamethasone, betamethasone, and others) suppress the production of endogenous cortisol, which raises the question of whether the catecholamine blood level offish is the most appropriate parameter to measure the stress level in such studies. This paper describes the dynamics of plasma levels of catecholamines (adrenaline, noradrenaline, dopamine, and serotonin) under simulated acute and chronic stress in tilapia O. niloticus by a single injection of dexamethasone to the first experimental group and betamethasone to the second one against the control group (without injection). Serum analysis was performed before injection and 21 days after treatment. A wide intraspecific variation of catecholamine levels in tilapias was revealed. At the same time, measurement of catecholamine levels during hormonal modulation of stress by corticosteroids was not recommended due to expensive, labor-intensive and sensitive measurements. Further search for stress markers in this type of study was recommended.
Введение
В ихтиологической практике широко используется имитация стресса разной продолжительности для изучения тех или иных физиологических реакций, в основном иммунологических. Для этого вводят экзогенный кортизол [17], кортизон [3] или синтетические кортикостероиды - дексаметазон [1], триамцинолон [10], дезоксикортикостерон [4], бетаметазон [16].
В исследованиях естественного стресса у животных часто бывает трудно определить степень реакции в результате влияния различных стресс-факторов, и интерпретация этого влияния, как правило, производится по повышению уровня эндогенного кортизо-ла. Ввиду большой трудоемкости процесса определения уровня катехоламинов крови у рыб, кортизол также зачастую используют в качестве классического стресс-маркера. Однако исследования влияния гормональной модуляции стресса у карпов показали, что эндогенный кортизол не является пригодным для оценки напряженности стресса, поскольку используемые гормоны частично или полностью блокируют выработку эндогенного кортизола [6]. Может возникнуть закономерный вопрос о том, является ли уровень катехоламинов наиболее подходящим параметром для измерения уровня стресса в рамках таких исследований у рыб.
У рыб, как и у млекопитающих, первичной реакцией на воздействие стрессора являются эндокринные изменения, включающие, прежде всего, выработку катехоламинов (адреналин и норадреналин) и глюкокорти-коидов [8]. В результате возникают вторичные метаболические, осмотические и другие изменения [5]. Регулируется кортикальный ответ у костистых рыб гипоталамо-гипофи-зарно-интерренальной (НРА) осью [8].
Острый стресс приводит к массивному высвобождению катехоламинов из хромаф-финных клеток, за которым следует быстрое изменение некоторых функций основных физиологических систем: дыхательной и сердечно-сосудистой [12]. Необходимое количество катехоламинов для проявления этих воздействий у рыб редко известно, поскольку химическое определение количеств
адреналина и норадреналина затруднительно и требует больших объемов плазмы крови из-за их низкой концентрации. Их уровень чрезвычайно быстро реагирует на вылов и манипуляции (в пределах секунд), поэтому трудно количественно определить уровни ка-техоламинов без специального оборудования и животных, содержащихся в условиях лаборатории [14].
Кроме того, существует огромная межвидовая изменчивость уровней катехолами-нов, достигнутых во время стресса, а также огромные расхождения в степени адренер-гической нейрональной иннервации тканей среди различных видов рыб [13]. Как замечает L. S. Smith, полученные результаты концентрации катехоламинов столь отличны друг от друга, что их трудно сопоставить с данными млекопитающих или делать на их основании какие-либо обобщения. Соотношение адреналина и норадреналина у рыб также значительно варьирует. У карпа кате-холамины примерно на 70 % представлены норадреналином, у кижуча - адреналином, у некоторых рыб адреналина и норадренали-на содержится поровну [15].
В связи с этим целью нашего исследования стала оценка пригодности измерения ка-техоламинов крови рыб как стресс-маркера при гормональной модуляции стресса. Для решения были поставлены следующие задачи: (1) определить уровень катехолами-нов крови тиляпий при модуляции острого и хронического стресса и без гормональной обработки; (2) оценить динамику уровней катехоламинов с течением дней эксперимента у всех групп рыб; (3) оценить пригодность анализа катехоламинов для оценки степени напряженности гормониндуцированного стресса.
Материалы и методы
Работа выполнена в период 2019-2020 гг. в центре развития аквакультуры «АкваБио-Центр» Вологодской ГМХА имени Н. В. Верещагина в рамках реализации гранта РФФИ №19-34-90109. Эксперимент проводили на нильской тиляпии Oreochromis niloticus L., выращенной в условиях «АкваБиоЦентра». Рыб каждого вида предварительно раздели-
10
ли на три группы: рыбы с имитацией острого стресса (первая экспериментальная группа), рыбы с имитацией хронического стресса (вторая экспериментальная группа) и контрольные животные.
Для имитации острого стресса использовали дексаметазон-фосфат (4 мг/мл) [1], который метаболизируется в течение 4 часов. Животных однократно обрабатывали Декса-метазоном (Эллара, Россия) путем парентеральных инъекций в дозе G,2 мл или G,S мг активного вещества дексаметазон-фосфата на особь.
В качестве глюкокортикоида, имитирующего хронический стресс, однократно применяли суспензию бетаметазона (2,63 мг бетаметазона натрия фосфата + 6,43 мг бе-таметазона дипропионата/мл), период выведения которого более 1G дней. Рыбам инъецировали Дипроспан (Schering-Plough Labo N.V., Бельгия) по G,5 мл на особь, что соответствует 3,5 мг активного вещества. Данные синтетические гормоны обладают аналогичным кортикостероидам эффектом. Контрольная группа оставалась интактной.
Рыб содержали в экспериментальной установке с обеспечением непрерывной циркуляции воды между аквариумами и принудительной аэрацией при температуре воды 2S-3G°C.
Взятие крови у животных, участвующих в эксперименте, проводилось сразу же после акклиматизации, и далее через 21 день после инъекции препаратов.
Перед забором крови рыб анестезировали при помощи добавления в воду гвоздичного масла в дозе G,G33 мл/л [9] с последующей выдержкой в ней 15 минут.
Забор крови проводился пункцией хвостового гемального канала в пластиковые пробирки с гепарином и пластиковые пробирки с активатором свертывания и гелем. После забора крови осуществляли индивидуальное мечение рыб. Концентрацию катехоламинов в сыворотке крови устанавливали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории ООО «Центр лабораторных исследований».
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью про-
граммного обеспечения Microsoft Excel и STATISTICA 12.0. Значения полученных результатов в работе представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M±m). Достоверность различий показателей крови для парных зависимых выборок использовали непараметрический критерий Вилкоксона.
Результаты исследований
Катехоламиновый ответ тиляпий на инъекции гормонов был неоднозначным и количественно представлен в таблице 1.
Содержание адреналина и норадреналина между рыбами одной группы очень сильно варьировалось (для адреналина 65-22500 пг/мл, для норадреналина 115—5500 пг/мл), однако их уровни претерпели резкое снижение: адреналина - на 97,9-99 % (рисунок 1), норадреналина - на 80-92,2 % у всех групп рыб (рисунок 2) к 21 дню эксперимента.
При оценке изменений дофамина, обращала на себя внимание динамика концентрации дофамина: у контрольной группы она снизилась к концу эксперимента на 17 %, а у экспериментальных групп - повысилась на 5-15 %, хотя содержание данного гормона играет незначительную роль при оценке стрессорного воздействия в рамках данного эксперимента.
Обсуждение результатов
Как отмечают другие авторы, катехола-миновый ответ рыб на стресс в данный момент является наиболее трудозатратным для изучения, а также очень чувствительным к состоянию рыбы, транспортировке проб и методам количественного измерения концентраций катехоламинов. Уровень катехо-ламинов рыб чрезвычайно быстро реагирует на вылов и манипуляции (в пределах секунд), поэтому затруднительно оценить катехола-миновый ответ в спокойном состоянии до забора крови.
По нашим данным отмечается огромная внутривидовая вариабельность концентраций адреналина и норадреналина, особенно до стрессового воздействия.
Возможно, в результате анестезии и кратковременного хэндлинг-стресса (венепункция)
Таблица 1
Катехоламины тиляпий в ходе эксперимента
До обработки 21-й день
Наименование контрольная группа (п=6) первая экспе- вторая экспе- контрольная группа(п=6) первая экспе- вторая экспе-
показателя риментальная группа (п=6) риментальная группа(п=6) риментальная группа (п=6) риментальная группа (п=6)
Адреналин, 11315,5± 3149,33± 7117,0± 83,50± 65,25± 92,50±
пг/мл 11097,5 3066,87 6041,44 23,50 4,23* 14,50
Норадрена- 1628,5± 728,0± 2219,0± 132,50± 17,50 140,25± 172,50±
лин, пг/мл 1486,5 603,03 1723,65 15,91 57,50
Дофамин, пг/ 36,00± 27,50± 29,50± 30,00± 31,75± 31,00±
мл 7,00 0,50 2,50 3,00 1,11 4,00
Серотонин, г/мл <3 <3 <3 <3 <3 <3
Примечание. Различия с показателем первой экспериментальной группы в тот же день эксперимента достоверны (р<0,05); * - Различия с показателем второй экспериментальной группы в тот же день эксперимента достоверны (р<0,05).
произошел всплеск катехоламинов у исследованных нами тиляпий, о чем говорит динамика к последнему дню эксперимента не только экспериментальных, но и контрольных значений. В связи с этим можно также предположить, что к концу эксперимента организм исследуемых животных адаптировался к кратковременным стрессовым условиям, или по каким-либо другим причинам, на что указывает падение уровня основных катехоламинов (адреналина и норадреналина) относительно первоначального у всех групп рыб.
В опытах по воздействию на рыб экзогенных стресс-факторов до стресса уровни катехола-
минов у рыб обычно менее 10 нМ (100 пг/мл), после стресса колеблются от 4 до более 300 нМ (40-3000 пг/мл) [7]. По другим данным концентрации адреналина и норадреналина у рыб, испытывающих стресс от отлова, в среднем составляли более 36 000 пмоль/л (6 000 пг/мл), тогда как значения в состоянии покоя для обоих катехоламинов были менее 200 пмоль/л (35 пг/мл) [11]. На примере карпа: адреналин (эпинефрин) до стресса - 0,5 нМ (5 пг/мл), после - 16,2 нМ (162 пг/мл) соответственно; но-радреналин (норэпинефрин) до стресса - 5,3 (53 пг/мл), после - 30,7 нМ (307 пг/мл) соответственно [7]. Й. Жигмонд при исследовании
ч г—
2. 100000
с
<
X 10000
<
X ш 1000
1
-С X 100
С£3
О 10
О.
>
1
контрольная группа
первая экспериментальная группа
вторая экспериментальная группа
■
ДО ОБРАБОТКИ 21 ДЕНЬ
ХОД ЭКСПЕРИМЕНТА
■ контрольная группа
¡первая экспериментальная группа
Iвторая экспериментальная группа
10000
< х
о
X -О
X
ш
со
О
о.
>■
1000
100
10
ДО ОБРАБОТКИ 21 ДЕНЬ
ХОД ЭКСПЕРИМЕНТА
Рис. 1. Динамика уровня адреналина у тиляпий в ходе Рис. 2. Динамика уровня норадреналина у тиляпий в эксперимента. ходе эксперимента.
12 Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 3 (51), 2021
различных стресс-стимулов также отмечал 2-х и 3-х кратное увеличение уровней адреналина и норадреналина в органах, тканях и плазме крови карпа [2], что противоречит результатам нашего исследования и, вероятно, связано с длительной продолжительностью выдержки рыб после первого взятия крови.
Авторский коллектив также советует помнить, что методы, применимые для исследования катехоламинов млекопитающих, могут не соответствовать реальному гормональному фону, так как эти методы высокочувствительны к условиям обработки проб и не стандартизированы для рыб.
Заключение
Обобщая основные результаты исследования, можно сказать, что, во-первых, у тиляпии (Oreochromis niloticus) существует огромная внутривидовая изменчивость уровней кате-холаминов (адреналина и норадреналина). Во-вторых, при гормональной модуляции стресса кортикостероидами измерение уровня катехоламинов не является пригодными для установления напряженности вызываемых стресс-реакций по следующим причинам: дороговизна, трудозатратность и чувствительность к хэндлинг-стрессу, в связи с чем необходим дальнейший поиск стресс-маркеров в рамках исследований данного типа. Возможным вариантом таковых стресс-маркеров может стать уровень глюкозы крови, также довольно чувствительный к различным факторам, но более экономически выгодный.
Список литературы
1. Балабанова Л. В. Реакция лейкоцитов карпа Cyprinus carpio на гормониндуцируемый стресс / Л. В. Балабанова, Д. В. Микряков, В. Р. Микряков // Биология внутренних вод. 2009. №. 1. С. 91.
2. Жигмонд Й. Влияние стрессорных факторов рыбоводства на некоторые физиолого-биохимические показатели карпа: автореф. дис. ... к. б. н.: 03.00.18 / Й. Жигмонд. М.: МГУ им. Ломносова, 1990. 23 с.
3. Микряков В. Р. Реакция лейкоцитов стерляди Acipenser ruthenus на гормониндуцируемый стресс / В. Р. Микряков, Л. В. Балабанова, Д. В. Ми-кряков // Вопросы ихтиологии. 2009. Т. 49. №. 4. С. 554-557.
4. Микряков Д. В. Влияние некоторых кортикосте-роидных гормонов на структуру и функцию иммунной системы рыб: автореф. дис. ... к. б. н.: 03.00.10, 14.00.36 / Д. В. Микряков. Москва, 2004. 24 с.
5. Barton B. A. Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids / B. A. Barton, G. K. Iwama // Annual Review of fish diseases. 1991. Vol. 1. P. 3-26.
6. Berezina D. I. Evaluation of hormone-induced stress responses using endogenous cortisol in carp (Cyprinus carpio) / D. I. Berezina, L. L. Fomina // KnE Life Sciences. DonAgro: International Research Conference on Challenges and Advances in Farming, Food Manufacturing, Agricultural Research and Education. 2021. P. 47-56.
7. Gamperl A. K. Experimental control of stress hormone levels in fishes: techniques and applications / A. K. Gamperl, M. M. Vijayan, R. G. Boutilier // Reviews in Fish Biology and Fisheries. 1994. Vol. 4. №. 2. P. 215-255.
8. Gorissen M. The endocrinology of the stress response in fish: an adaptation-physiological view / M. Gorissen, G. Flik // Fish physiology. Academic Press, 2016. Vol. 35. P. 75-111.
9. Hamackova J. Clove oil as an anaesthetic for different freshwater fish species / J. Hamackova, J. Kouril, P. Kozak, Z. Stupka // Bulgarian Journal of Agricultural Science. 2006. Vol. 12. №. 2. P. 185.
10. Houghton G. Immunosuppression in juvenile carp, Cyprinus carpio L.: the effects of the corticosteroids triamcinolone acetonide and hydrocortisone 21-hemisuccinate (cortisol) on acquired immunity and the humoral antibody response to Ichthyophthirius multifiliis Fouquet / G. Houghton, R. A. Matthews // Journal of Fish Diseases. 1990. Vol. 13. №. 4. P. 269-280.
11. Ling N. Plasma catecholamines and erythrocyte swelling following capture stress in a marine teleost fish / N. Ling, R. M. G. Wells // Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology. 1985. Vol. 82. №1. P. 231-234.
12. Pavlidis M. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time and fibrinogen values in Mediterranean marine teleosts / M. Pavlidis, M. Berry, C. Kokkari, M. Kentouri // Fish Physiology and Biochemistry. 1999. Vol. 21. №. 4. P. 335-343.
13. Perry S. F. The acute humoral adrenergic stress response in fish: facts and fiction / S. F. Perry, N. J. Bernier // Aquaculture. 1999. Vol. 177. №1-4. P. 285-295.
14. Schreck C. B. The concept of stress in fish / C. B. Schreck, L. Tort // Fish physiology. Academic Press, 2016. Vol. 35. P. 1-34.
15. Smith L. S. Introduction to fish physiology / L. S. Smith. TFH, 1982. 352 p.
16. Swift D. J. Changes in selected blood component values of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, following the blocking of the cortisol stress response with betamethasone and subsequent exposure to phenol or hypoxia / D. J. Swift // Journal of Fish Biology. 1982. Vol. 21. №. 3. P. 269-277.
17. Van Weerd J. H. The effects of chronic stress on growth in fish: a critical appraisal / J. H. Van Weerd, J. Komen // Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 1998. Vol. 120. № 1. P. 107-112.
13
