CC BY
75
УДК 639.2:574.24:574.625
Динамика уровня фибриногена в крови рыб под влиянием стресса
Березина Дарья Игоревна, аспирант
email: vetxwork@gmail.com
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина»
Фомина Любовь Леонидовна, кандидат биологических наук, доцент
email: fomina-luba@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина»
Аннотация. В работе представлены результаты исследования уровня фибриногена у карпов при воздействии стресс-факторов. В качестве комплексного стресс-фактора выступил вылов рыбы и манипуляции по забору крови, а также гипоксия в течение дней эксперимента. Было выявлено, что к последнему дню эксперимента процессы коагуляции под воздействием стресса очевидно ускоряются. Отмечено наличие корреляции средней и высокой степени между уровнем фибриногена и содержанием стресс-маркеров.
Ключевые слова: гемостаз, фибриноген, кортизол, рыбы, стресс, гипоксия, карп.
Актуальность
Данные исследования важны как в современной ветеринарии, относительно недавно перешедшей на новую ступень развития, - хирургии декоративных рыб, так и в промышленном рыбоводстве, заинтересованном в продолжительном сохранении жизни самых продуктивных животных. В связи с этим, актуальна альтернативная оценка состояния здоровья промысловых рыб по показателям системы гемостаза и предотвращение их смертности в промышленных и декоративных условиях [1, 2].
В качестве стресс-факторов у рыб выступают абиотические факторы внешней среды, факторы внутренней среды, социальные факторы, антропогенные факторы. Стресс-реакции у рыб вызываются в основном катехоламинами и кортизолом, которые действуют в течение двух различных, но соприкасающихся друг с другом отрезков времени [2]. Количественная характеристика кортикального ответа рыб остается недостаточно изученной.
Существует обширная база зарубежных исследований, касающихся влияния различных видов стресса на промысловых и диких рыб [3, 4, 5, 6, 7, 8], у большинства из которых было экспериментально зафиксировано изменение концентрации кортизола в плазме крови. Среди этих работ можно отметить эксперимент по воздействию на сазане C. carpió десяти различных видов загрязнителей в сублетальных концентрациях, в результате чего концентрация глюкозы и кортизола сыворотки крови быстро повышались [9]. Напротив, уровень кортизола, глюкозы и некоторых других гематологических показателей значительно не изменились в результате транспортировки обыкновенного карпа C. carpio, причем отмечено, что предшествующие ей манипуляции оказались гораздо более существенным стрессовым фактором [10]. Стоит также отметить исследования, в результате которых была отмечена активация гемостатических механизмов у рыбы при стрессе, включающая быстрое снижение времени свертывания крови с увеличением числа тромбоцитов. Из других источников известно, что стресс, воспроизводимый путем вылова и манипуляций, понижает уровень фибриногена в крови вместе с увеличением числа тромбоцитов. Такие результаты, по мнению исследователей, подтверждают, что время свертывания является хорошим индикатором стресса, а его уменьшение возможно из-за увеличения числа тромбоцитов крови, вызванного повышением уровня катехоламинов и кортизола, которые выделяются во время стресса [11].
Русскоязычные работы с оценкой кортизола крови рыб под влиянием стресса весьма немногочисленны, лишь в недавнем исследовании по воздействию гипоксического стресса на C. carpió, прослеживалось изменение уровня кортизола в соответствии со стадиями классического адаптационного синдрома [3].
В доступной отечественной литературе можно встретить утверждение, что у рыб время свертывания крови - довольно нестабильный показатель, который зависит не только от способа взятия крови, но и от факторов внешней среды, физиологического состояния рыбы [12].
Материалы и методы
Исследование проведено на кафедре ВНБ, хирургии и акушерства факультета ветеринарной медицины и биотехнологий Вологодской ГМХА имени Н. В. Верещагина. Для проведения эксперимента использовали 8 карпов (Cyprinus carpió).
В качестве комплексного стресс-фактора выступили манипуляции по забору крови у рыб, сопровождаемые тотальной гипоксией, а также дальнейшее перекрытие поступления растворенного кислорода в воду в течение следующих
дней эксперимента [3]. Забор крови проводился шприцем из хвостовой артерии для исследования уровня фибриногена - в пластиковые пробирки, содержащие 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 1:9 [1], для анализа стресс-маркеров - в пластиковые пробирки без антикоагулянта. Взятие крови согласно методике проведения острого эксперимента для рыб осуществлялось немедленно после акклиматизации и далее через 24, 48, 72 и 96 часов после влияния стресс-фактора. Исследование крови проводили не позднее двух часов после ее забора.
Концентрацию кортизола в плазме крови устанавливали методом твердофазнового хемилюминесцентного иммуноанализа. Количественный анализ фибриногена определяли с помощью коагулометра «Thrombostat» производства Behnk Elektronik (Германия) [13].
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью програмного обеспечения Microsoft Excel и STATISTICA 6.0. Значения полученных результатов в работе представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M±m).
Достоверность различий показателей фибриногена и кортизола карпов с помощью критерия Вилкоксона для зависимых выборок. Результаты исследования со значением вероятности допущения альфа-ошибки, равные либо менее 5% (р < 0,05), расценивались как статистически значимые. Различие двух показателей считали достоверным, если оно равнялось или превышало свою среднюю ошибку разности в два и более раз.
Качественную интерпретацию силы связи между стресс-реакциями и показателями коагулограммы выполняли по полученному значению R на основе шкалы Чеддока.
Результаты исследований
В целях оценки стрессорной реакции карпов при снижении уровня кислорода в воде были определены два показателя (стресс-маркера): кортизол и гемоглобин.
В результате проведенного эксперимента было отмечено, что уровень кортизола плазмы на 1-й и 3-й дни после воздействия стресс-факторов достоверно отличается от 2-го дня, а к 4-му дню уровень кортизола заметно снизился (табл. 1). Данные изменения можно сопоставить с классической стадийностью стресса, в которой 1-й и 2-й дни эксперимента соответствуют первой стадии (тревоги), в 3-й день при значительном увеличении уровня кортизола плазмы проявляется стадия резистентности, а резкое его снижение к 4-му дню согласуется со стадией истощения, когда компенсаторные процессы организма исчерпаны, а полезно-приспособительный эффект не достигнут [3].
Таблица 1 - Динамика уровня кортизола и гемоглобина крови рыб в ходе эксперимента (с первого по четвертый дни)
Показатель 1 день, n=8 2 день, n=8 3 день, n=8 4 день, n=8
Кортизол, нг/мл 287,2±28,9** 118,9±56,6* *** 333,6±65,2** 211,8±112,2
Гемоглобин, г/л 89,1±2,12** **** 80,3±9,8* **** 52,9±1,9* **
* - различия достоверны с первым днем исследований (р<0,05) ** - различия достоверны со вторым днем исследований (р<0,05) *** - различия достоверны с третьим днем исследований (р<0,05)
**** - различия достоверны с четвертым днем исследований (р<0,05).
Также было установлено, что концентрация гемоглобина крови на 1-й, 2-й и 4-й дни исследований (см. табл. 1) в условиях гипоксии, в результате которых в 1-й день она достоверно отличалась от 2-го и 4-го дня. Можно заметить очевидное снижение этого хромопротеида в крови подопытных животных с течением дней эксперимента. Скорее всего, данный эффект вызван кровопотерей, связанной с взятием крови на исследования ежедневно, вместе с этим не исключается влияние кортикостероидов на уровень этого показателя.
Следующей задачей было изучение динамики уровня фибриногена в крови карпов при гипоксии. Фибриноген - важный функциональный показатель системы плазменного гемостаза, обеспечивающий образование сгустка, у исследованных животных в 3-й день эксперимента имел достоверные отличия от 1-го и 4-го дня. Из данных таблицы 2 видно, что к 4-му дню воздействия стресс-факторов количество фибриногена крови значительно выросло.
Таблица 2 - Динамика уровня фибриногена крови рыб в ходе эксперимента
Показатель 1 день, п=8 2 день, п=8 3 день, п=8 4 день, п=8
Фибриноген, г/л 1,3±0,2** 1,3±0,4 1,0±0,2* *** 2,0±0,1**
* - различия достоверны с первым днем исследований | ** - различия достоверны с третьим днем исследований *** - различия достоверны с четвертым днем исследов; :р<0,05) 1 (р<0,05) аний (р<0 05).
I ^ V V/ ^ V/
Корреляционный анализ выявил наличие тесной обратной корреляционной связи между показателями стресс-реакций - гемоглобином и кортизолом, где коэффициент корреляции составил -0,7. Модель регрессии при анализе зависимости этих показателей получилась наиболее качественной (Я2 составил 0,44). Графическое изображение корреляционной зависимости стресс-маркеров представлено на рисунке.
Рисунок. Графическое изображение корреляционной зависимости и регрессионные модели, описывающие взаимодействия стресс-маркеров
Анализируя эти данные, можно заключить, что оба стресс-маркера достаточно сильно взаимосвязаны, что делает возможным применение любого из них для идентификации стрессовых условий.
I ^ V W V U
Корреляционным анализ также выявил наличие связей средней и высокой степени между уровнем фибриногена и содержанием стресс-маркеров в сыворотке крови у карпов. Так, коэффициент корреляции (R) между фибриногеном и кортизолом составил -0,30, что указывает на обратную зависимость между количеством кортизола и фибриногена. Данный факт может указывать на снижение свертывающей способности крови рыб под влиянием стресса, когда уровень кортизола растет.
В то же время, чем ниже содержание гемоглобина, тем ниже и уровень фибриногена (R= 0,7), что опять же приведет к снижению скорости остановки кровотечения при стрессе.
Выводы
Анализируя динамику уровня кортизола крови после воздействия комплекса стресс-факторов на исследуемых рыб (в 1-й день эксперимента - 287,2±28,9 нг/ мл; во 2-й день - 118,9±56,6 нг/мл; в 3-й день - 333,6±65,2 нг/мл и в 4-й день -211,8±112,2 нг/мл), можно провести соответствие его колебаний с классической стадийностью стресса. Также было установлено очевидное снижение концентрации гемоглобина в крови в течение эксперимента (в 1-й день - 89,1±2,12 г/л, во 2-й день - 80,3±9,8 г/л, в 4-й день - 52,9±1,9 г/л). По увеличению количества фибриногена крови в течение дней эксперимента (в 1-й день - 1,3 г/л, 2-й день -1,3 г/л ; 3-й день - 1,0 г/л и 4-й день - 2,0 соответственно) можно заключить, что процессы коагуляции ускорились под воздействием гипоксии.
Корреляционно-регрессионный анализ показал, что оба стресс-маркера (кортизол и гемоглобин) достаточно сильно взаимосвязаны, что делает возможным применение любого из них для идентификации стрессовых условий.
Также важно отметить наличие связей средней и высокой степени между показателем вторичного звена гемостаза и содержанием стресс-маркеров в сыворотке крови у карпов, а именно - обнаружена прямая корреляция гемоглобина с уровнем фибриногена и обратная связь кортизола с уровнем фибриногена, при этом коэффициент корреляции 0,7 и -0,3 соответственно. В связи с этим количество фибриногена также можно использовать в качестве биоиндикатора критических для рыб условий.
Список литературных источников:
1. Фомина, Л.Л. Функциональное состояние системы гемостаза рыб [Электронный ресурс] / Л.Л Фомина, А.Э. Вайцель, Д.И. Березина // Мол.-хоз. вестник. - 2015. - №2 (18). - Режим доступа: http://molochnoe.ru.
2. Березина, Д. И. Динамика уровня кортизола при стрессе у рыб [Электронный ресурс] / Д.И. Березина // Молодые исследователи агропромышленного и лесного комплексов - регионам: материалы II междунар. молодеж. науч.-практ. конф., Вологда-Молочное, 27 апр. 2017 г. / ФГБОУ ВО ВГМХА им. Н.В. Верещагина. - Вологда, 2017. - Т. 3 (2). - Режим доступа: https:// molochnoe.ru.
3. Strange, R.J., Schreck C. B., Golden J. T. (1977) Corticoid stress responses to handling and temperature in salmonids. Transactions of the American Fisheries Society, 106 (3), pp. 213-218.
4. Barcellos, L. J. G., Nicolaiewsky, S., De Souza, S. M. G., & Lulhier, F. (1999) Plasmatic levels of cortisol in the response to acute stress in Nile tilapia,
Oreochromis niloticus (L.), previously exposed to chronic stress. Aquaculture Research, 30 (6), pp. 437-444.
5. Grutter, A. S., & Pankhurst, N. W. (2000) The effects of capture, handling, confinement and ectoparasite load on plasma levels of cortisol, glucose and lactate in the coral reef fish Hemigymnus melapterus. Journal of Fish Biology, 57(2), pp. 391-401.
6. Pottinger, T. G. (1998) Changes in blood cortisol, glucose and lactate in carp retained in anglers' keepnets. Journal of fish biology, 53(4), pp. 728-742.
7. Ruane, N. M., Huisman, E. A., & Komen, J. (2001) Plasma cortisol and metabolite level profiles in two isogenic strains of common carp during confinement. Journal of Fish Biology, 59 (1), pp. 1-12.
8. Ruane, N. M., Carballo, E. C., & Komen, J. (2002) Increased stocking density influences the acute physiological stress response of common carp Cyprinus carpio (L.). Aquaculture Research, 33 (10), pp. 777-784.
9. Gluth, G., & Hanke, W. (1985) A comparison of physiological changes in carp, Cyprinus carpio, induced by several pollutants at sublethal concentrations: I. The dependency on exposure time. Ecotoxicology and environmental safety, 9 (2), pp. 179-188.
10. Dobsikova, R., Svobodova, Z., Blahova, J., Modra, H., & Velisek, J. (2009) The effect of transport on biochemical and haematological indices of common carp (Cyprinus carpio L.). Czech J Anim Sci, 54 (11), pp. 510-518.
11. Tavares-Dias, M., & Oliveira, S. R. (2009) A review of the blood coagulation system of fish. Revista Brasileira de Biociencias, 7(2).
12. Иванов, А.А. Физиология рыб [Текст]: учебное пособие для студентов вузов / А.А. Иванов. - СПб [и др.]: Лань, 2011. - 279 с.
13. Фомина, Л.Л. Определение активности плазменно-коагуляционного звена системы гемостаза рыб клоттинговыми методами с использованием коагулометра / Л.Л Фомина, Т.С. Кулакова, Д.И. Березина // Актуальные вопросы вет. биологии. - 2017. - Т. 35. - №. 3. - С. 54-58.
References:
1. Fomina L.L., Vaitsel A.E., Berezina D.I. Functional state of fish hemostasis system. Molochnohozyaystvennyy vestnik [Dairy Bulletin], 2015, no. 2, Vol.18, pp.41-45. (in Russian)
2. Berezina D.I. Dynamics of cortisol level under stress in fish. Materialy 2 Mezhdunarodnoy Molodezhnoy Nauchno-Prakticheskoy Konferentsii Molodye issledovateli agropromyshlennogo i lesnogo kompleksov - regionam [Proc.2nd Int. Youth Scientific and Practical Conference "Young researchers of agro-industrial and forest complexes for regions], Vologda-Molochnoe, 2017, pp. 1217. (in Russian)
3. Strange R.J. Schreck C. B., Golden J. T. (1977) Corticoid stress responses to handling and temperature in salmonids. Transactions of the American Fisheries Society, 106 (3), pp. 213-218.
4. Barcellos L. J. G., Nicolaiewsky S., De Souza S. M. G., Lulhier, F. (1999) Plasmatic levels of cortisol in the response to acute stress in Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.), previously exposed to chronic stress. Aquaculture Research, 30 (6), pp. 437-444.
5. Grutter A. S., Pankhurst N. W. (2000) The effects of capture, handling, confinement and ectoparasite load on plasma levels of Cortisol, glucose and lactate in the coral reef fish Hemigymnus melapterus. Journal of Fish Biology, 57(2), pp. 391-401.
6. Pottinger T. G. (1998) Changes in blood cortisol, glucose and lactate in carp retained in anglers' keepnets. Journal of fish biology, 53(4), pp. 728-742.
7. Ruane N. M., Huisman E. A., Komen J. (2001) Plasma cortisol and metabolite level profiles in two isogenic strains of common carp during confinement. Journal of Fish Biology, 59 (1), pp. 1-12.
8. Ruane N. M., Carballo E. C., Komen J. (2002) Increased stocking density influences the acute physiological stress response of common carp Cyprinus carpio (L.). Aquaculture Research, 33 (10), pp. 777-784.
9. Gluth G., Hanke W. (1985) A comparison of physiological changes in carp, Cyprinus carpio, induced by several pollutants at sublethal concentrations: I. The dependency on exposure time. Ecotoxicology and environmental safety, 9 (2), pp. 179-188.
10. Dobsikova R., Svobodova Z., Blahova J., Modra H., Velisek J. (2009) The effect of transport on biochemical and haematological indices of common carp (Cyprinus carpio L.). Czech J Anim Sci, 54 (11), pp. 510-518.
11. Tavares-Dias, M., & Oliveira, S. R. (2009) A review of the blood coagulation system of fish. Revista Brasileira de Biociencias, 7(2).
12. Ivanov A.A. Fiziologiya ryb [Physiology of fish]. St. Petersburg, Lan' Publ., 2011. 279p.
13. Fomina L.L., Kulakova T.S., Berezina D.I. Determination of activity of plasma-coagulation unit of the hemostasis system in fish by clotting methods using a coagulometer. Aktual'nye voprosy veterinarnoy biologii [Actual issues of veterinary biology], 2017, Vol. 35, no. 3, pp. 54-58. (in Russian)
Blood fibrinogen dynamics in fish under stress
Berezina Dar'ya Igorevna, postgraduate student
e-mail: vetxwork@gmail.com
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Vereshchagin State Dairy Farming Academy of Vologda
Fomina Lyubov' Leonidovna, Candidate of Science (Biology), associate professor
e-mail: fomina-luba@mail.ru
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education the Vereshchagin State Dairy Farming Academy of Vologda
Abstract. The paper presents the research results of blood fibrinogen in carps under stress. It is established that the coagulation processes have accelerated under hypoxic stress by the 4th day of the experiment.
Keywords: hemostasis, fibrinogen, cortisol, fish, stress, hypoxia, carp
