Определение активности плазменно-коагуляционного звена системы гемостаза рыб клоттинговыми методами с использованием коагулометра Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 597. 612.115.2: 57.089

Ключевые слова: рыбы, кровь, свертывание, коагулометр, плазменно-коагуляционный гемостаз

Key words: fish, blood, coagulation, coagulometer, plasma coagulation hemostasis

Фомина Л.Л., Кулакова Т.С., Березина Д.И.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЕННО-КОАГУЛЯЦИОННОГО ЗВЕНА СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА РЫБ КЛОТТИНГОВЫМИ МЕТОДАМИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОАГУЛОМЕТРА

DETERMINATION OF PLASMA-COAGULATION UNIT ACTIVITY OF FISH HEMOSTASIS SYSTEM BY CLOTTING METHODS USING THE COAGULOMETER

ФГБОУ ВО «Вологодская государственная молочно-хозяйственная академия имени Н. В. Верещагина» Адрес: 160555, Россия, Вологда-Молочное, ул. Шмидта, д. 2

Vologda State Dairy Farming Academy named after N. V. Vereshchagin, Federal State Budget Institution of Higher Education

Address: 160555, Russia, Vologda-Molochnoe, Shmidt str., 2

Фомина Любовь Леонидовна, к. б. н., доцент каф. внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства.

E-mail: fomina-luba@mail.ru. Тел. +7-921-122-17-63

Fomina Lyubov' L., PhD in Biological Sciences, Associate Professor of the Dept. of Internal Non-communicable Diseases, Surgery and Obstetrics. E-mail: fomina-luba@mail.ru. Tel. +7-921-122-17-63 Кулакова Татьяна Сергеевна, к.с. -х. н., доцент каф. зоотехнии и биологии. E-mail: dofas@yandex.ru. Тел. +7-911-510-40-75 Kulakova Tatyana S., PhD in Agricultural Sciences, Associate Professor of the Dept. of Zootechnics and Biology.

E-mail: dofas@yandex.ru. Tel. +7-911-510-40-75 Березина Дарья Игоревна, студентка факультета ветеринарной медицины и биотехнологий. E-mail: reservoirdog.purple@yandex.ru. Тел. +7-981-421-10-22 Berezina Darya I., Student of Faculty of Veterinary Medicine and Biotechnology. E-mail: reservoirdog.purple@ya.ru. Tel. +7-981-421-10-22

Аннотация. В работе приведены результаты измерения некоторых показателей плазменно-коагуляционного звена системы гемостаза рыб разных видов клоттинговыми методами с использованием коагулометра. Установлено, что у представителей костных рыб (Cyprinus carpio) активность внутреннего пути свертывания крови выше, чем у такого представителя костно-хрящевых рыб, как осетр (Acipenser baerii) - активированное частичное тромбопласти-новое время (АЧТВ) составило (12,62±1,16) сек и (148,06±54,75) сек соответственно. В то же время, у последних быстрее происходит превращение фибриногена в фибрин - тромбиновое время (ТВ) составило (14,53±2,30) сек против (142,13±31,50) сек у карпов. При оценке содержания фибрин-мономерных комплексов (РФМК) в плазме крови рыб мы получили высокие, по сравнению с человеком и собаками, значения - (13±6,27) мг/100 мл у осетров, (13±3,14) мг/100 мл у карпов и (8,68±1,77) мг/100 мл у гибридов стерляди и севрюги.

Summary. The results of some parameter measurement ofplasma-coagulation unit of hemostatic system of different fish species by clotting methods with using a coagulometer are presented. It was found that blood coagulation internal way activity at representatives of one fishes (Cyprinus carpio) is higher than at such representatives of bone-cartilaginous fish as sturgeon (Acipenser baerii) - activated partial thromboplastin time (APTT) was (12.62 ± 1.16) sec and (148.06 ± 54.75) sec respectively. At the same time the conversion of fibrinogen to fibrin of latterones is faster - thrombin time (TT) is (14.53 ± 2.30) sec versus (142.13 ± 31.50) sec in carp. When assessing the content of fibrin-monomer complexes (SFMC) in fish blood plasma, we obtained high values, in comparison with humans and dogs, (13 ± 6.27 mg) / 100 ml in sturgeons, (13 ± 3.14) mg /100 ml in Carp and (8.68 ± 1.77) mg /100 ml in sterlet and stellate sturgeon hybrids.

Введение

В настоящее время происходит эффективное развитие рыбного хозяйства, которое предусматривает получение высококачественной, экологически безопасной рыбной продукции.

Известно, что рыбы как в естественных, так и в искусственных условиях выращивания подвергаются множественному воз-

действию различных по природе и происхождению стресс-факторов, а усиление свертываемости крови у всех позвоночных отражает защитную реакцию организма на любое экстремальное взаимодействие, главным образом, на стресс.

Подробное изучение механизмов свертывания, а также определение нормированных

параметров гемостатической системы промысловых рыб позволит оценить физиологический статус животного, уровень его адаптации, влияние на его здоровье заводских условий выращивания. Полученные данные дадут начало изучению различных особенностей, а также патологий гемостаза, приводящих к гибели этих гидробионтов: изменение времени свертывания может быть показателем проблем коагуляции, которые могут быть вызваны дефицитом витаминов, сосудистыми аномалиями, повреждениями печени или другими факторами [10, 14].

Некоторые исследования, проведенные на костистых рыбах, указывают на то, что процесс коагуляции крови рыб принципиально схож с другими позвоночными, такими как млекопитающие, но в то же время многие факторы, относящиеся ксистеме свертывания крови у млекопитающих, до сих пор неизвестны у рыб [3, 7, 8].

В связи с тем, что рыбы являются пой-килотермными животными, методы оценки гемостаза, принятые в ветеринарной и гуманной медицине, могут не подходить для оценки гемостаза рыб, но поскольку гемо-стазиологические оценки постепенно становятся важными для диагностики здоровья рыб, адаптированная и стандартизированная методология анализа свертывания крови рыбы важна и срочно необходима [13].

Поэтому цель нашего исследования -определение и оценка показателей плазмен-но-коагуляционного звена гемостаза рыб разных видов клоттинговыми методами при помощи коагулометра.

Материалы и методы

Исследования проводили на карпах (Сурттш еагрюЬтпавш, 1758), осетрах (Аегретет Ъавтп £гап^,1869) и гибридах стерляди и севрюги (Ас1рвтвг ги^впш^в1Шш). Рыба выращена в промышленных условиях в рыбоводческом хозяйстве ООО РТФ «Диана» Кадуйского района Вологодской области. Забор крови проводился шприцем из хвостового гемального канала в пластиковые пробирки, содержащие в качестве стабилизатора 3,8 %-й раствор цитрата натрия в соотношении 1:9. Все исследования крови проводили в первые

два часа после ее забора. Показатели плазменного гемостаза исследовались в бедной тромбоцитами плазме, для получения которой кровь рыб центрифугировали на лабораторной центрифуге со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 20 минут.

Параметры плазменно-коагуляционно-го гемостаза определяли на коагулометре «Thrombostat» производства Behnk Elektronik (Германия). Для оценки состояния плазмен-но-коагуляционного гемостаза определяли следующие показатели: АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время), ПВ (протромбиновое время), ТВ (тромбино-вое время) c использованием человеческого тромбина, количественный анализ фибриногена. Фибринолитическую активность в плазме измеряли с помощью обнаружения растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) в о-фенантролиновой пробе (планшетный вариант).

Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и STATISTICA 6.0. Значения результатов, полученных в работе, представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M±m). Достоверность различий показателей коагулограммы карпов, осетров и гибридов оценивали с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок.

Результаты исследований и обсуждение

Первую фазу свертывания крови (образование протромбиназы) характеризует активированное частичное тромбопластиновое время -тест, выявляющий исключительно плазменные дефекты активации Х-фактора у млекопитающих. АЧТВ характеризует внутренний путь - протромбиназообразование и представляет собой многоступенчатый процесс, в результате которого в крови накапливается комплекс факторов, способных превратить протромбин в тромбин [4]. Для определения АЧТВ прогревали раствор кальция хлористого до + 37 °С и в течении всего анализа сохраняли при этой температуре. В пластиковую пробирку на 0,1 мл с исследуемой плазмой рыб вносили 0,1 мл раствора АЧТВ-реагента (АЧТВ-тест), тщательно перемешивали и прогревали её при + 37 °С в

течение 3-х минут. В кювету добавляли 0,1 мл рабочего раствора кальция хлорида, отмечали время образования сгустка [2].

По результатам нашего исследования, АЧТВ и некоторые другие показатели коа-гулограммы достоверно отличались у всех представленных видов костных рыб и хрящевых ганоидов (табл. 1).

На активность внешнего пути свертывания указывают показатели протромбинового времени. Протромбиновое время характеризует первую (образование протромбиназы) и вторую (образование тромбина) фазы свертывания крови и отражает активность протромбиново-го комплекса (факторов VII, V, X и собственно протромбина - фактора II). Для определения данного показателя прогревали реактив (ренам-пластин) до + 37 °С в течение 30-ти мин. Прогревали пробирку при температуре + 37 °С и вносили в нее 0,1 мл исследуемой цитратной плазмы. Прогревали 1 мин при температуре + 37° С. Вносили 0,2 мл раствора реагента, прогретого при температуре + 37 °С. Отмечали время образования сгустка фибрина [2].

При оценке внешнего пути свертывания крови (ПВ), имеющего преобладающее значение для рыб [6, 12], можно отметить, что костные рыбы (Cyprinus carpió) обладают достоверно более быстрым образованием сгустка при добавлении тканевого фактора, чем такие костнохрящевые, как Acipenser baerii, однако показатели костно-хрящевого гибрида (Acipenser ruthenus/stellatus) достоверно не отличались от костных рыб (Cyprinus carpió).

В то же время, данный показатель у рыб намного превышал нормативные значения

для человека (14-18 сек), собаки (6-11 сек), коровы (20-24 сек) и других млекопитающих. Это можно объяснить тем, что активация внешнего пути свертывания у рыб происходит с помощью слизи кожи, которая является богатым источником протромбокиназы [3].

Третью фазу свертывания крови (образование фибрина) оценивали с помощью показателей фибриногена и тромбинового времени.

Фибриноген (фактор I) - белок, синтезирующийся в основном в печени. В крови он находится в растворенном состоянии, но в результате ферментативного процесса под воздействием тромбина и фактора ХШа может превращаться в нерастворимый фибрин. Для оценки количества фибриногена в крови рыб исследуемую плазму крови разводили буферным раствором (1:9). Прогревали пробирки до + 37 °С, вносили 0,2 мл анализируемой плазмы пациента, разведенной в 10 раз буферным раствором. Инкубировали кюветы с раствором при температуре + 37 °С точно 2 мин. Вносили 0,1 мл раствора тромбина (Фибриноген-тест), имеющего комнатную температуру. Отмечали время образования сгустка. По калибровочному графику определяли содержание фибриногена в исследуемых пробах [2].

Этот важный функциональный показатель системы плазменного гемостаза, обеспечивающий образование сгустка, - количественное содержание фибриногена в плазме крови, также не имел достоверных отличий у всех исследованных животных. Это говорит о том, что функционирование ведущего фактора гемокоагуляции у этих позвоночных, предположительно произошедших от одного общего предка [11], остается

Таблица 1.

Параметры плазменно-коагуляционного гемостаза у костных (Cyprinus carpió) и костно-хрящевых рыб (Acipenser baerii, Acipenser ruthenus/stellatus)

Показатель Acipenser baerii n=9 Cyprinus carpió n=16 Acipenser ruthenus/ stellatus n=6

ТВ (сек) 14,53±2,30 142,13±31,50*/* 28,85±5,39

ПВ (сек) 251,05±30,65 161,7±23,48* 201,13±55,49

АЧТВ (сек) 148,06±54,75 12,62±1,16*/* 8,4±1,08

Фибриноген (г/л) 2,9±0,50 4,8±0,71 4,38±0,84

РФМК (мг/100 мл) 13±6,27 13±3,14 8,68±1,77

Примечание: * - различия с Acipenser baerii достоверны (р < 0,05); /* - различия с Acipenser ruthenus/stellatus достоверны (р < 0,05).

на постоянном уровне и, вероятно, подвергается воздействию стабилизирующего отбора.

Тромбиновое время (ТВ) - скрининг-тест последней стадии свертывания крови, отражающий скорость превращения фибриногена в фибрин. Для оценки скорости общего пути свертывания (ТВ) прогревали пробирки до + 37 °С, вносили 0,2 мл анализируемой плазмы. Прогревали в течение 2-х мин при температуре + 37 °С. Вносили в ту же пробирку 0,2 мл рабочего раствора тромбина (Тромбин-тест), имеющего комнатную температуру +(18-25) °С. Отмечали время образования сгустка [2].

Анализируя полученные нами характеристики плазменно-коагуляционного звена свертывающей системы костных рыб и сравнивая их с соответствующими у костно-хрящевых, можно сказать, что скорость образования фибринового сгустка (ТВ) у костных рыб (Cyprinus carpid) достоверно меньше, чем у костно-хрящевых (Acipenser baerii, Acipenser ruthenus/stellatus), в то время как между показателями последних нет достоверных различий.

Также нами было проведена оценка содержания фибрин-мономерных комплексов (РФМК) в плазме крови рыб. Механизм образования (увеличения количества) фибрин-мономерных комплексов заключается в том, что в период активации процессов свертывания и нарастания содержания тромбина образуется большое количество фибрин-мономеров, часть которых не успевает полимеризовать-ся, но соединяется с фибриногеном, образуя макромолекулярные растворимые комплексы - растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). Интересно заметить, что растворимые фибрин-мономерные комплексы являются маркерами тромбинемии при вну-трисосудистом свертывании крови у человека и в норме не превышают (3,0 ± 0,1) мг/100мл (А. П. Момот, А. Н. Мамаев, 2008). Для определения количества РФМК к 0,1 мл исследуемой плазмы крови рыб, взятой в пробирку, добавляли 0,1 мл раствора фенантролина. Немедленно включали секундомер. При непрерывном покачивании пробирки в проходящем свете регистрировали время от момента добавления реагента до начала появления первых зерен фибрина. Отмечали время их

появления в секундах и по таблице определяли количество РФМК в исследуемой плазме.

Анализ полученных данных показывает, что как костные, так и костно-хрящевые рыбы имеют достоверно одинаковое количество РФМК, намного превышающее количество РФМК у собак и человека, но ниже, чем у коров - животных с многокамерным желудком (рис. 1).

По данным доступной нам литературы о хрящевых рыбах, можно выделить J. H. Lewis [9], охарактеризовавшую некоторые показатели функционального состояния вторичного гемостаза нескольких видов акул и скатов, являющихся типовыми представителями хрящевых рыб. Согласно этим исследованиям, ТВ с использованием бычьего тромбина составило: 57,4 сек (Squalus acanthias), 33,8 сек (Carcharhinus maculipinnis), 29,8 сек (Prionace glauca), 44,4 сек (Raja eglanteria).

Исследование внешнего пути свертывания плазмы проводилось с различными тканевыми экстрактами и составило: при использовании мозгового - 8,6 сек (Squalus acanthias), 38,4 сек (Carcharhinus maculipinnis), 27,8 сек (Prionace glauca), 44,4 сек (Raja eglanteria); жаберного - 10,3 сек (Squalus acanthias), 32,4 сек (Carcharhinus maculipinnis), 25,4 сек (Prionace glauca), 68,2 сек (Raja eglanteria); и кожного - 31,4 сек (Squalus acanthias), 51,7 сек (Carcharhinus maculipinnis), 51,7 сек (Prionace glauca), 57,2 сек (Raja eglanteria).

Активация внутреннего пути свертывания крови (АЧТВ) составила более 120-ти сек.

В более ранних исследованиях [6, 13] также упоминается количественное содержание протромбина в плазме хрящевых рыб (M. canis). И J. H. Lewis, и Doolittle было показано, что

РФМК (мг/100 мл)

V"

Рис. 1. Растворимые фибрин-мономерные комплексы у рыб в сравнении с собакой [1], коровой [5] и человеком (А. П. Момот, А. Н. Мамаев, 2008).

кальций при высоких концентрациях ускоряет процесс коагуляции как у костных, так и у хрящевых рыб.

К сожалению, ввиду фрагментарности данных иностранных авторов, а также различий в методологических условиях и рабочей среде, комплексно сравнить исследованный нами плазменно-коагуляционный гемостаз у костных и костно-хрящевых рыб с хрящевыми рыбами не представляется возможным.

Заключение

При определении показателей вторичного гемостаза рыб разных видов возможно применение клоттинговых методов, применяемых в ветеринарной и гуманной медицине. Полученные значения являются достоверными и сопоставимыми.

В результате сравнительного анализа плазменно-коагуляционного звена системы гемостаза у различных видов рыб нами было выявлено, что у представителей класса костных рыб (C. carpió) по сравнению с кост-но-хрящевыми (A. baerii) наиболее активна первая фаза гемокоагуляции (и внутренний, и внешний пути), на что указывают укороченные протромбиновое время и активированное частичное тромбопластиновое время.

В то же время, образование нерастворимого фибрина из фибриногена у последних происходит намного быстрее, хотя количество фибриногена у представителей различных классов не отличается.

Необходимо отметить, что количество растворимых фибрин-мономерных комплексов у разных видов рыб находится на одинаковом уровне, но значительно превышает таковое у собак и человека, и вместе с тем заметно ниже, чем у коров.

Из условного сравнения данных доступной нам литературы о гемостазе хрящевых рыб следует вывод, что по показателям вторичного гемостаза эти позвоночные более сходны с кост-но-хрящевыми, нежели с костными рыбами.

Список литературы

1. Баруздина, Е. С. Некоторые аспекты системы гемостаза у здоровых взрослых собак в условиях севера европейской части России [Текст] / Е. С. Баруздина, Ю. Л. Ошуркова // Новая наука: Теоретический и практический взгляд. - 2016. - № 3-2 (69). - С. 12-17.

2. Козлов, А. А. Пособие для врачей-лаборантов по методам исследования плазменного гемостаза. АЧТВ, протромбиновый комплекс, тромбиновое время, фибриноген [Текст] / А. А. Козлов, А. Л. Берковский, Н. Д. Качалова, Т. М. Простакова. - Москва, 2006.

3. Кудряшов, Б. А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния крови и ее свертывания [Текст] /Б. А. Кудряшов. - И. : Медицина, 1975. -488 с.

4. Ткачева, Е.и С. Влияние акупунктуры на реологические свойства крови крупного рогатого скота [Текст] / Е. С. Ткачева, Ю. Л. Ошуркова // Молочнохо-зяйственный вестник. - 2015. - №3 (19). - С. 53-58.

5. Ошуркова, Ю. Л. Сравнительная оценка гемостаза у коров в хозяйствах Вологодской области [Текст] / Ю. Л. Ошуркова, Е. Н. Соболева, Л. Л. Фомина // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета. - 2011. - №2, Ч.1. - С. 193-196.

6. Doolittle, R. F. Blood coagulation in fish [Текст] / R. F. Doolittle, D. M. Surgenor // American Journal of Physiology. - 1962. - Vol. 203 (5). - Р. 964-970.

7. Herwald, H. Hemostasis in Invertebrates and Vertebrates: An Evolutionary Excursion [Текст] / H. Herwald, U. Theopold // J Innate Immun. - 2011. -Vol. 3. - P. 1-2.

8. Jagadeeswaran, P. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and throm-bosis [Текст] / P. Jagadeeswaran, M. Gregory, K. Day, M. Cykowski, B. That-taliyath // Thrombosis and Haemostasis. - 2005. - Vol. 3 (1). -P. 46-53.

9. Lewis, J. H. The Cartilaginous Fish [Текст] / J. H Lewis // Comparative Hemostasis in Verte-brates. -1996. - Р. 43-56.

10. Ranzani-Paiva, M. J. T. Clotting time and hematocrit of "dourado", Salminus maxilosus, and carp, Cyprinus carpio [Текст] / M. J. T. Ranzani-Paiva, V. R. Silveira, E. R. Almeida-Dias, E. L. Rodrigues // Boletim Instituto Pesca. - 2000. - Vol. 26. - P. 113-116.

11. Rowley, A. F. Haemostais in fish. An evolutionary perspective [Текст] / A. F. Rowley, D. J. Hill, C. E. Ray, R. Munro // Thrombosis and Haemostasis. - 1997. -Vol. 77. - Р. 227-233.

12. Sheehan, J. Demonstration of the extrinsic coagulation pathway in tele-ostei: identification of zebrafish coagulation factor VII [Текст] / J. Sheehan, M. Templer, M. Gregory, R. Hanumanthaiah, D. Troyer, T. Phan, B. Thankavel, P. Jagadeeswa-ran // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - Vol. 15. - Р. 8768-8773.

13. Tavares-Dias, M. A review of the blood coagulation system of fish [Текст] / M. Tavares-Dias, S. R. Oliveira // Revista Brasileira de Biociencias. - 2009. - Vol. 7, n. 2 -P. 205-224.

14. Van Pittius, M. G. Effects of chromium during pH change on blood coagulation in Tilapia sparrmanii (Cichlidae) [Текст] / M. G.Van Pittius, J. H.Van Vuren, H. H. Du Preez. // Comparative Biochemistry and Physiology. - 1992. - Vol. 101. - P. 371-374.