Изменение биологических свойств в связи с приобретением антибиотикорезистентности у стафилококков Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

Paran'ko S. I., Gavriluk V. G., Golodok L. P.

Alteration of biologic properties during getting resistance to antibiotics by staphylococci

УДК 579.61:616-078+618.21

С. И. Паранысо, В. Г. Гаврилюк, Л. П. Голодок Днепропетровский национальный университет

ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ В СВЯЗИ С ПРИОБРЕТЕНИЕМ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ У СТАФИЛОКОККОВ

У результат! проведених дослвджень були отримаш 30 селевдцйованих eapiaHTÎB стаф1локок)в 3i стшк!стю до ряду антибютиюв, яка в 30-1000 разт перебшьшуе MIK для вихздних штам!в. Були встаиовлеш корелятвш зв'язкн у зниженш патогенност! i шдвищенш персистенци на фош придбання янтибютикоспйкосп. Отримаш дат про нгтенсифжащю окислювальних процессе у селекцшованих до антибштимв культур.

As a result of conducted research there were received 30 selected variants of staphylococci with antibioticresistance in 30 to 1000 times higher than the MIK for wild strains. It was determined correlative links between the pathogenecity reduction and persistence increase in conditions of antibioticresistance acquiring. It was recieved the data concerning the oxygenate processes intensification in cultures selected to antibiotics.

В последние десятилетия во многих странах мира наблюдается неуклонный рост бактериальных инфекций в структуре акушерско-гинекологических заболеваний. Частота этих инфекций в различных популяциях женщин варьирует от 30 до 80% обследованных. На общем фоне увеличения частоты специфических заболеваний (хламидиоз, трихомоноз, гонорея) наблюдается увеличение количества инфекций репродуктивного тракта, протекающих с участием микроорганизмов из состава нормальной микрофлоры влагалища. Стало очевидным, что нормальная микрофлора половых путей при определенных условиях способна проявлять патогенные свойства, а ее представители становятся возбудителями целого ряда болезней бактериальной этиологии. Это побуждает детально изучать влияние различных экзогенных и эндогенных факторов на состояние как микробиоценоза репродуктивного тракта в целом, так и на отдельных его представителей. Одним из самых мощных факторов отбора в популяции микроорганизмов, составляющих микробиоценоз слизистых оболочек макроорганизма, являются антибактериальные препараты. Широкое и, порой, нерациональное применение антибиотиков приводит к усугублению протекания заболевания, изменяет количественный и качественный состав микрофлоры, затрудняет диагностику и терапию инфекций. В связи с актуальностью проблемы, предметом исследования данной работы явилось изучение изменений биологических свойств представителей резидентной микрофлоры репродуктивного тракта женщин в результате приобретения антибиотикоустойчивости.

Материалы и методы исследования

Объектом исследований служили клинические штаммы стафилококков, выделенные из репродуктивного тракта беременных женщин, находящихся на стационаре с угрозой прерывания беременности. Определяли чувствительность выделенных штаммов стафилококков к антибиотикам методом высева на твердые

© Паранъко С. И,, Гаврилюк В. Г., Голодок Л. П., 2005 208

BicHHK ^HinponeTpoBCfcKoro ymBepcrneTy. Eionoria, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

питате.1рьн|.1 s jCjjíüUkV о1", 80!0<а0к?с?1Щие различные концентрации антибиотиков (МПА,

J pi^IeratiOnof^io^giC properties during getting resistance to antibiotics by staphylococci

Пассирование выделенных культур проводили на твердых средах (МПА, 1,8%, рН=7,2-7,4) с увеличивающимися концентрациями антибиотика. После проведения 20-30 пассажей определяли МИК у отселекционированных культур.

Сравнительный анализ биологических свойств исходных и селекционированных вариантов проводили по определению уровня гемолитической, лецитиназной, гиалуронидазной, желатиназной активностей, способности сбраживать маннит, а также антилизоцимной активности (фотометрическим методом).

Определяли интенсивность окислительных процессов в клетках стафилококков полярографическим методом с использованием электрода Кларка закрытого типа. Результаты регистрировали по убыванию кислорода за определенный промежуток времени в закрытой ячейке в присутствии экзогенного субстрата (глюкозы) и в отсутствии субстратов (эндогенное дыхание). Скорость дыхания расчитывали по формуле:

At х т

где, V - интенсивность дыхания, hMq^ / мг ■ мин ; AF0; - количество

использованного кислорода, нМ0^; At - время, мин; т - масса белка, мг.

Все эксперименты проводили в 3-5 повторностях. Количество белка в пробе определяли с помощью метода Лоури.

Результаты и их обсуждение

Былй отобранны 5 клинических штаммов стафилококков, идентифицированных как Staphylococcus epidermidis. Для каждой культуры были определены МИК ряда антибиотиков: бензил пенициллин, нетилмицин, цефипим, офлоксацин, эритромицин, тетрациклин.

С целью изучения изменения биологических свойств в зависимости от приобретения устойчивости к антибиотикам провели селекционирование изучаемых культур путем многократного пассирования на средах с возрастающими концентрациями антибиотиков. В результате были получены 30 вариантов с более высоким уровнем^устойчивости к антибиотикам (табл. 1). Были получены штаммы с максимальным уровнем устойчивости к цефипиму и тетрациклину - 250 мкг/мл, к бензилпенициллину - 240 мкг/мл. С более низким уровнем устойчивости удалось отселекционировать варианты к нетилмицину и офлоксацину. Тем не менее, для всех полученных мутантов МИК исследуемых антибактериальных препаратов возросли в 30-1000 раз.

По данным ряда авторов были выявлены корреляционные закономерности в снижении патогенности и усилении персистентности у антибиотикоустойчивых штаммов различных микроорганизмов [2; 5]. В связи с этим было изучено проявление ряда свойств, относящихся к факторам патогенности и персистентности.

У селекционированных вариантов, устойчивых к антибиотикам, было отмечено снижение активности ряда ферментов, отвечающих за патогенность, по сравнению с исходными штаммами (рис. 1).

209

Вкник Дтпропетровського утверситету. Бюлопя, еколопя.

Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seriä Biologiä, ekologiä Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology.

Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol.

2005. 13(1).

ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

Таблица I

МИК антибиотиков для селекционированных штамммов

Антибиотики МИК исходных вариантов, мкг/мл __________—--- ______--:—г- МИК селекционированных вариантов, мкг/мл

] 2 3 4 5

Бензилпени-циллин 2 ^^ ^^ 60 1,5 240 0,4 50

Нетилмицин 0,01 10 0,05 30 0,8 40 0,1 ^^^^ 90

Цефимим 0,01 ^^ 10 1.2 ^^^ ^^^ 250 ^^^ьо" 1,2 ...............' 250 2,5 ^^^ 110

Офяоксацин 0,01 ^^Л ^^ 10 2 ^^^ 60 0,8 50

Эритромицин 0,01 ^^ ^^ 10 1,2 ^^^ 60

Тетрациклин ккГ 2 ^^^ ___—^^ ^о" 1,5 ^^^ 250 190

% 100 f-

90 L-

80 tl

70

60

50 j

40 i

30 —

20 1 4— I

10 j__ i

0 i l

I

__Рис. 1. Динамика изменения биологических свойств у стафилококков:

ЯН - исходные клинические штаммы, проявляющие данное свойство; I -! - селекционированные варианты; 1 - гиалуронидазная активность; 2 - лецитиназная активность: 3 - гемолитическая активность; 4 - желатиназная активность; 5 - расщепление маннита

Расщепление гиалуроновой кислоты было отмечено у 80% исходных вариантов; а у 25% резистентных штаммов, полученных от исходных, обладающих гиалуронидазной активностью, этот признак отсутствовал. Лецитиназная активность проявлялась у 40% исходных стафилококков и у 75% вариантов, полученных от лецитиназоположительных исходных культур. Редуцированная гемолитическая активность наблюдалась только у 62% резистентных культур. Способность ферментировать желатин была подавлена у 33% селекционированных вариантов по сравнению со 100% желатиназной активностью исходных штаммов.

210

BicHHK ^HinponeTpoBCfcKoro ymBepcrneTy. Eionoria, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

Способность расщеплять маннит была установлена для 80% исходных и 70% селекционированных от них вариантов. Наибольшее количество штаммов с редуцированнными биологическими свойствами было отмечено у вариантов, устойчивых к цефипиму и офлоксацину (37% и 42% соответственно).

Способность бактерий специфически инактивировать лизоцим хозяина была определена как их антилизоцимная активность и оценена в персистенции микроорганизмов. Выяснилось, что этот признак встречается у большого количества видов микроорганизмов с преимущественным наличием у грамотрицательных бактерий. Закономерно встречался этот признак у носительских штаммов стафилококков. Экспериментальным путем было доказано, что антилизоцимный признак можно рассматривать как маркер персистенции бактерий, способных к внутриклеточному паразитированию. Антилизоцимный признак бактерий оказался конститутивным, секретируемым фактором, специфически взаимодействующим с лизоцимом и инактивирующим его. Как известно, широкий круг хозяев распологает лизоцимом как средством защиты, что в свою очередь стимулирует выработку антилизоцимного фактора у бактерий, способных к персистенции. Большое значение для селекции наиболее стойких клонов с высоким уровнем антилизоцимной активности имеет среда обитания, включая фагоцитирующие клетки организма. Способность паразита уклоняться от встречи с профессиональными фагоцитами хозяина общеизвестна, но в этом случае микробы пытаются проникнуть в иммунологически слабо защищенные клетки. Такой подходящей для них мишеныо служат различные эпителиальные выстилки внутренних органов, защищенные лишь лизоцимом, где бактерии обосновываются.

В отношении факторов персистенции у селекционированных вариантов установлена прямая зависимость: с увеличением уровня устойчивости ко всем антибиотикам возрастала антилизоцимная активнсть. Так, среднее значение АЛА у исходных вариантов составило 2,06 мг/мл, а у устойчивых - 2,73 мг/мл (р < 0,05).

Огромная неисследованная область открывается перед клиническими микробиологами, врачами, использующими антибиотики в качестве терапевтических средств для лечения больных в плане регулирующего их воздействия на персистентные свойства патогенов. Реальные субингибиторные концентрации антибиотиков в отношении патогенов, как правило, ограничиваются модификацией его характеристик, включая и персистентные свойства. Отсюда, необходимо сформулировать новый принцип отбора наиболее эффективных лекарственные средств, основаный на оценке действия препаратов на факторы персистенции бактерий. Подавление антибактериальным препаратом персистирующих свойств возбудителя затрудняет его паразитирование и тем самым повышает эффективность лекарственного воздействия. Представленная порция должна быть интересна для врача тем, что позволяет с иной стороны (проблемы персистенции патогена) подойти к возможной ревизии применяемых средств антибактериальной терапии, которая в ряде случаев нуждается в безусловном пересмотре в связи с расширением наших знаний о механизмах персистенции микроорганизмов.

Как известно, условно патогенные микроорганизмы рода Staphylococcus обладают высокими адаптивными способностями, что в первую очередь обусловлено большой лабильностью процессов энергетического метаболизма. По данным ряда исследователей были установлены факты изменения активности ферментов катаболизма от присутствия в клетках стафилококков детерминант антибиотикорезистентности [ 1; 3; 4]. В связи с этим нам представилось интересным

211

Вюник Дтпропетровського утверситету. Бюлогы, еколопя.

Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seriä Biologiä, ekologiä Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology.

Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol.

2005. 13(1).

ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

изучить интенсивность эндогенного дыхания и катаболического расщепления глюкозы у антибиотикорезистентных вариантов в сравнении с исходными клиническими штаммами. В результате проведеных исследований было установлено, что интенсивность эндогенного дыхания у резистентных штаммов составила в среднем 31,57 нМ02 / мг ■ мин , а у исходных - 22,28 нМ0г / мг ■ мин

(р<0,05), что показывает разницу 42%. При изучении окислительных процессов при расщеплении глюкозы также была отмечена интенсификация процессов потребления кислорода на 30% - у устойчивых вариантов по сравнению с исходными штаммами (36,77 и 28,38 нМ0г / мг ■ мин соответственно).

На основе полученных результатов можно заключить, что формирование устойчивости к антибактериальным препаратам коррелируют с изменением различных биологических свойств у стафилококков в сторону снижения патогенности и увеличения персистентности и приводит к интенсификации процессов как эндогенного, так и экзогенного дыхания.

Библиографические ссылки

1. Гаврилюк В. Г. Энергетические процессы плазмидосодержащих штаммов и их роль в обеспечении конъюгации у стафилококков: Дисс. ... канд. биол. наук. - Днепропетровск, 1994.

2. Дерябин Д. Г., Шагинян И. А. Вирулентность и персистенция стафилококков: фенотипические проявления и механизмы генетического контроля // Журн. микробиология. - 2000. - № 4. - Приложения. - С. 36-43.

3. Козицкая С. Н. Особенности процессов катаболизма углеводов у плазмидосодержащих штаммов стафилококков / С. Н. Козицкая, JI. П. Голодок, А. И. Винников // Укр. биохим. журнал. - 1999. - Т. 71, № 3. - С. 26-29.

4. Крисенко О. В., Вшнжвв А. I. Актившсть ферменпв циклу трикарбонових кислот у стшких та чутливих до антибютиив штамм ¡в Neisseria gonorrhoeae // Мшробюл. журн. - 2004. - Т. 66, № 6. - С. 3-9.

5. Von Eiff С. A site-directed Staphylococcus aureus hemB mutant is a small-colony variant which persists intracellularly / Heilmann С., Proctor R. A., Woltz C., Peters G., Götz F.11 J Bacteriol. - 1997 Aug. -V. 179. -№. 15. - P. 4706-4712.

Надшьила до редкалеги 14.02.05

212

Вюник Дтпропетровського утверситету. Бюлогы, еколопя. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua