CC BY
9
УДК 577 :
О. А. Кручиненко, Г. О. Ушакова
Дшпропетровсъкий нацюнальний ушверситет
3MIHA СТУПЕНЯ БОЛЮ П1Д ВПЛИВОМ МЕТАЛОТЮНЕШУ-П
Визначено вплив металотюнеУну-П на щур1в в умовах шсляоперацшного соматогенного болю. Збудження глутаматних pencmopie с одним h головних мехашзупв вичуття болю. Отримаж даш дають можливкть припустити, що зниження шсляоперацтноУ ппералгези пщ впливом металоттнеТну-П пов'язане 3i зв'язуванням ¡ошв цинку, яю rioipiuni для активацп НМДА-рецептор1в.
It was studied the effect of metallotionein-II to rats under postoperative somatogenic pain conditions. The main mechanism of pain is excitement of the glutamate receptors. The data obtained allow to suggest that decrease of postoperative hyperalgesia under metallotionein-II effect is connected with binding of the zink ions that stimulate NMDA-receptors.
Учет почали все бшьше звертати увагу на властивють цинку активувати НМДА (N-метил-О-аспартат) рецептори. НМДА-рецептори - це трупа юнотропних глутаматних рецептор1в, KOTpi беруть участь у багатьох формах синаптично'У TpaHCMicii. Цинк взаемод1е з багатьма нетрансмтерними рецепторами, але гальмування НМДА-рецептор1в особливо цжаве, бо дае можливють з'ясування рол! цинку, який здатен запасатися у синаптичних пухирцях. Вш звшьняеться пщ час синаптично'У активацп i його концентращя в синаптичнш щшиш зростае до мжромолей [5].
У реашзацц больового вадчутгя велику роль вщграють 6ioxiMi4Hi фактори. Дослщження ocxaHHix рок1в показали, що передача больовоУ шформащ'У в1д одшеУ нервово'У клгтини до друго'У проходить за допомогою молекул нейропептадн'в. Припускають, що метал отюне'Уни беруть участь у збшьшенш порога больовоУ чутливост1 [3].
У пошуках компонента тканини, який вщповщае за природну акумулящю кадм!ю у нирках ссавшв. у 1957 рощ Margashes та Vallee вщкрили металотюнеУни (МТ) [12]. Це родина низькомолекулярних протеУшв, як1 локал1зоваш в цитоплазм! та ядрк Складаються з 61-62 амшокислот; серед них цисте'ш, серин, л1зин, apriHiH, аланш, вал1Н, аспараг1нова кислота, acnapariH, глютамшова кислота, глютамш, пролш, треон1н, метюнш (не мають ароматичних амшокислот та пстидину). ЦистеУнов1 залишки складають 25-30%. Молекулярна вага цих бшюв становить 6,5-7 кДа. У нативному стан! бшок не мае дисульфщних зв'язив. МеталотюнеУни виявляють чималий р1вень пол1морф1зму. Притаманний винятковий ряд гомологи, який свщчить про високу консерватившсть первинноУ структури. За допомогою метода пол1меразно'У ланцюговоУ реакцп була видшена послщовшсть гена МТТЬ. Цей ген складаеться з двох 1нтрон1в (575 bp та 602 bp) та трьох екзошв (22 bp, 77 bp, 78 bp) [10]. На сьогодшшнш день В1Д0М1 чотири ¡зоформи МТ: MT-I, MT-II - в ештел1альних тканинах (imcipa, слизова оболонка кишечника, печшка), МТ-1П - у мозку, MT-IV - в ештелп язика, шлунково-кишковому TpaKTi.
Бшьше 17 пщтишв МТ видшеш за допомогою хроматографп, але тшьки десять ¡з них ппотетично «функцюнують» у людському opraHi3Mi [3; 6].
© Кручиненко О. А., Ушакова Г. О., 2005
Вксник Дншропетровського утверситету. Бюлопя, еколопя.
Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Sena Biologia, ekologia 123
Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua
Металотюне'ши мають великий р1вень зв'язування з металами (7-10 ГЭТ07М0ЛЬ). Подал ыш експерименти показали, що цисте'шов1 залишки не е безпосередньо метал-зв'язуючими л^андами, а кожен ¿он металу вмонтований у тетраедричний комплекс чотирьох тюлових лиащцв.
Дослщи ЯМР-спектроскот1, змшеними вщстанями метал-слрка, але такими ж кутами зв'язку над кадм!ем, показали, що <мм метал ¿в (С<1, Zn, Си, Ag, Аи, Hg, Рф, яю були знайдеш в МТ, з!браш у два кластери: 1) чотириатомний кластер А та 2) триатомний кластер В. Поява металу в кластер! А супроводжуеться кооперативно появою в кластер! В. Порядок звшьнення вщ металу йде зворотшм шляхом. Коли зв'язуеться Си, координацшна упаковка, мабуть, шша 1 тут залучаеться бшьше атом!в на моль. Ця вщмшшсть ще обговорюеться.
Для розумшня мехашзму зв'язування метал ¡в метал оттнеУном важливо знати точну структуру активного центра цього бшка. Методами рентгешвсько!' дифракцп було виявлено, що Сё-гп-металотюне'ш складаеться з двох глобул а та р. а-глобула мае МедСуэп кластер, а (3-глобула - МезСувд кластер. В шших роботах методом ЯМР-спектроскопп була визначена трим1рна структура всього бшка з атомами Сс1 в активних центрах, а методом рентгешвсько! дифракцц - структура Сй£пг металотюне'шу [4].
Ц1 битки зв'язують атоми металгв виключно в результат! створення зв'язюв метал-слрка залишюв цисте'шу, що передбачае просторове зближення вщповщних залицшв цисте'шу даного полшептидного ланцюга у його нативнш трим1рн1Й структур!. У дослщнш структур! (металотюне'шу людини) маеться 20 залишюв цисте'шу в!д усього числа амшокислотних залишюв (61). Ам!нокислотн! залишки цього бшка створюють дв! групи, як! складаються з 9 та 11 залишк!в цисте'шу кожна та зв'язують три або чотири атоми металу (Хп, Сс1, Си, А§, Аи, Ну, Рс1) вщповщно. Частина атом!в с!рки виступае в рол! спейсер!в м!ж тетраедрами з атом!в с!рки навколо кожного з атом!в металу. За допомогою ХА1\гЕ8-спектроскогш була отримана довжина зв'язку м1ж атомами цинку та арки металотюнешу, котра становила 29 еВ при вщсташ м!ж атомами цинку та арки 2,50 ангстрем та 34 еВ -при вщсташ 2,35 ангстрем. *
Будуючи просторову структуру металотюне'шу людини (без атом!в металу), згщно з теор!ею Е. Г. Арутюняна та А. А. Замятн!на, виявилось, що пол!пептидний ланцюг д!йсно формуе два домени. Кожен з цих домен!в мае один кластер, який м!стить чотири та п'ять дисульфщних м!стик!в вщповщно та по одному просторово зближеному з ними !зольованому залишку цисте'шу. Меж! домешв, конф!гурацн ланцюга (положения лшшних та нерегулярних и частин, повороти! дшянки) сп!впадають ¡з результатами структурних досл!д!в [2].
Яким же чином проходить зв'язування метатв, якщо бшышсть залишк!в цистеТну беруть участь у створенш В-Б-мостшав? Була створена ппотеза, яка, можливо, надал! подтвердиться. Унаслщок просторово"! зближеност! залишк!в цисте'шу, як! беруть участь у формуванш р!зних дисульф!дних м!стик!в, можливе альтернування Б-З-зв'язмв. Оскшьки число БН-груп у кластерах непарне, завжди кожний кластер мае вшьну БН-групу, котра може катал!зувати руйнування сусщшх дисульфщних мостик!в. Таким чином, у кожний момент часу кожна з цих БН-груп може бути чи зайнятою, чи вшьною. Останш можуть зв'язувати атоми меташв.
Проведена нами експериментальна робота направлена на дослщження впливу МТ-Н на щур!в в умовах шсляоперацшного болю.
BicHHK ^mnponeTpoBctKoro yHiBepcHTeTy. Eionom, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua
Матер1али та методи
Експериментальну частину робота було проведено на 42 бших лабораториях щурах 2-3-мкячного вшу масою 180-220 г. Тварини знаходилися в стандартних умовах ¡з циюичнютю доби: свило - 12 годин, шч - 12 годин.
Експериментальна модель тсляоперацшного болю була створена згщно з Бреннаном та сшвавторами [8]. На плантарнш частит задньоУ право!' кшщвки щура, анестезованого еф1ром, шсля обробки пшри розчином йоду та пешцшину, прово дився розр!з шк!ри, фасци та м'яз1в довжиною 10 мм. Шел я чого на рану накладали 2 шовкових шви. Рану повторно обробляли йодом. Експерименти проводили у вщповщносп до етичних принцитв експериментальних дослщжень на тваринах.
Оперованим тваринам уводили МТ-П в доз! 100 мкг/на тварину дв!ч! на добу за два дш до операщУ та 100 мкг/на тварину дв1ч1 на добу протягом двох дшв теля операци. Yci препарата були введенш ¡нтраперитонеально. Щури були роздшеш на групи, по 5-6 тварин у кожнш rpyni: 1 - контрольна, 2 - оперована (без застосування MT-1I), 3 - група з уведенням MT-II до операци, 4 - ¡з уведенням МТ-П теля операци. Декаштацто тварин проводили через 24 години теля операци (термш найгостр!шоУ rinepanreaii) та наприкшщ сьомоТ доби (термш зниження гшералгез1У та заживления рани). Для подалыиих дослщжень використовували мозок та сироватку Kpoei тварин.
Дослщження ф1зюлопчноУ активност1 проводили за допомогою тестування у вщкритому nojii за Бурешом [1]. Yci тести проводили протягом одшеУ й Tiei ж фази евгглового циклу. Для формування груп були o6paHi щури 3i схожою поведшковою актившетю, виключаючи занадто активних та пасивних тварин. Тестування у вщкритому пол! дозволяе одночасно дослщити локомоторну, дослщницьку актившеть та емощйний стан тварин.
Июля декаштаци щур1в для подальших дослщжень були взят! довгастий мозок та таламус. Тканини головного мозку гомогешзували в 10 об'емах буфера А (25 мМ трис-НС1,рН=7,4; 1 мМ ЕДТО; 2 мМ 2-меркатоетанол; 0,2 мМ ФМСФ та 0,01% мертиолята) та центрифугували 60 хвилин при 50000g.
Кшькюне визначення MT-II у дослщжуваних пробах проводили методом твердофазного конкурентного ¡муноферментного анализу з використанням моноспециф1чних полгклональних антитш (Дашя). Для побудови кашбровки використовували чистий бшок MT-II (Sigma). Вим^ри оптичноУ густини проводили при 492 нм на pwepi Anthos 2010. Загальну кшькють битв у зразках визначали за методом Бредфорд [7]. Статистичну обробку результат проводили з допомогою програми Statwin, використовуючи t-критерш Стьюдента. В1рогщними вважали результати, якщо р<0,01.
Результата та i'x обговорення
Результата тестування щур ¡в у «вщкритому полЬ> показали, що шеляоперацшна гшералгезш призводить до значно'У змши поведшки дослщних uiypie: знижуються показники юлькост1 пройдених квадрата, перетнутих лшш (рухлива актившеть), кшькють вертикальних положень (дослщницька актившеть), збшьшуються акти дефекащУ (сомато-вегетативш реакщТ) (рис.1). При введенш MT-II щурам до чи теля операщУ визначаеться покращення стану тварин у шеляоперацшний термш, що евщчить про зменшення больового синдрому.
Вюник Днiпропетровського утверситету. Бiологiя, еколопя. 125
Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology.
Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol.
2005. 13(1).
ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua
(а) перетинання лМй
(с) вертикалью положения
50 i
45 -
40 -
35
1 30
M 25
20
¡5
15
10
5
0
у. i - £ -
i
f4
0 1 2 3 4 5 6 Доба глсяя операцЯ
0 1 2 3 4 5 6 ДобашсляоперацИ
(6) проходження центральних квадра-пв
1
-в— 2
3
4
0 1 2 3 4 5 6 Доба теля операцп
ж л
с;
SS
(д) дефекаци
О 1 2 3 4 5 6 Доба шсля операцй'
•1 !
—{Щ—2
3
!
.. 4|
Рис. 1. Результата фЫолопчних тестш щур1в у «вщкритому полЬ>:
0 - дш до операцп, 1-6 - дш ш'сля операцй": 1 - контроль; 2 - операщя; 3 та 4 - ¡н'екщя 0,2 мл ({нзюлопчного розчину з 100 мкг МТ-П на тварину дв1ч1 за добу протягом 2 дшв до та шсля операцп вщповщно
Кращий ефект спостер1гаеться при введенш МТ-Н дозою 100 мкг/на тварину дв1ч1 за добу протягом двох дшв теля операцп.
У в'ддшах мозку (довгастий мозок, таламуе) визначеш дуже мал1 кшькосп МТ-11 (0,01-0,025 мкг/мг загального бкпка) з великою розб1жшстю результат ¡в вщносно кожно1 окремоТ тварини. Це можна пояснити двома причинами: 1) МТ-И не е головною ¡зоформою, притаманною мозку; 2) уведений МТ-И не проходить через юнуючий гематоенцефал1чний бар'ер.
ГПсляоперацшний больовий синдром, викликаний порушеннями цшсност1 шюри та фасцп заднього м'яза у щур1в, призводить до зниження вмюту МТ-И у сироватщ кров! оперованих щур1в на фот збшьшення кшькост! загального бщка.
BicHUK ^mnponeTpoBctKoro yHiBepcHTeTy. Eionom, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua
Нав1ть на шосту добу теля операцп концентращя MT-II у сироватщ Kpoei даних тварин була нижчою у 1,46 раза пор1вняно з контрольними щурами (0,161±0,013 та
0.11.±0,024 мкг/мл вщповщно). Це свщчить про швидке його використання у тканинах оргашзму в pa3¡ травми.
Ефекти дй' metajiotíone'íhíb були обран1 для пошуку нових метод!в лжування експериментального аутсимунного енцефалом1ел1ту, множинного склерозу. MT-I та MT-II можуть захищати юнтини вщ активних форм кисню, пригшчувати апоптоз клпин у центральнш нервовш систему допомагати при формуванш ппальних рубщв, протид1яти зменшенню маси тканини та судинному набряку, покращувати функцюнальний стан теля фокально!' церебрально!' iineMii" [9; 11].
Отримаhí нами даш свщчать про зниження вщчуття болю у шсляоперацшний термш за участю MT-II. Цей феномен, можливо, пов'язаний ¡з регулящею концентрацп íohíb цинку, що впливають на активацш НМДА-рецептор1в i спсциф1чно зв'язуються цим бшком.
Б1блшграф1чш посилання
1. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д. Хьюстон. - М.: Высшая школа, 1991. - С. 119-122.
2. Замятнин А. А. Протоколы испытаний теории нового кода. - М., 1999. - С. 28-36.
3. Касиль Г. Н. Боль и обезболивание. - М.: Наука, 1965. - С. 55-57.
4. Смоленцев Г. Ю. Определение геометрии активных центров тионеика с помощью XANES спектроскопии // Биофизика. - Ростов. - 2000. - № 4. - С. 14-16.
5. Удр1с Г. А. Биологическая роль цинка / Г. А. Удрю, Н. Г. Нейланд. - Рига, 1981,-
C. 31-33.
6. Alan В. G. Metallotioneins potential therapeutic aids for wound healing in the skin // Wound Healing Society. -2002. -Vol. 31.-P. 130-132.
7. Bradford M. Rapid and sensitive methods for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1985. - Vol. 72. -P. 248-254.
8. Brennan T. J. Characterization of a rat model of incisional pain I T. J. Brennan, E. P. Vandermeulen, G. F. Gebhart. // Pain. - 1996. - Vol. 64, № 3. - P. 493-521.
9. Giralt M. Metallotionein I+II protect the CNS after a focal brain injury / M. Giralt, M. Penkova, N. Lago // Experimental Neurology. - 2002. - Vol. 173. - P. 114-128.
10. Li B. Cloning of metallotionein cDNAs and its gene in shore crab (Carcinus maenas) / B. Li,
D. Savva//PubMed. - 2000. - Vol. 32, № 6. - P. 640-644.
11. Penkova M. Metallotionein I+II expresión and their role in experimental autoimmune encefalomyelities / M. Penkova, J. Hidalgo // Glia. - 2000. - Vol. 32. - P. 247-263.
12. Protein deficiency and Autism // Vitamin and Nutritional Research. - 2004. - P. 10-20.
Hadiuwuia до редколеги 25.01.05
BicHHK ^HinponeTpoBCLKoro yHiBepcureTy. Eionoria, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua
