CC BY
22
Изменение биохимического состава мембран тромбоцитов у больных с диабетической нефропатией и его коррекция сулодексидом
Е.А. Александрова, Ю.В. Нелаева,
A.A. Нелаева, М.В. Шестакова
Городской эндокринологический центр I (гл. врач — проф. A.A. Нелаева), Тюмень, I Тюменская государственная медицинская академия I (ректор — проф. Э.А. Кашуба), I Эндокринологический научный центр I (дир. — акад. РАМН И.И. Дедов) РАМН, Москва У
Аиабетическая нефропатия (ДН) - одно из самых тяжелых осложнений сахарного диабета (СД) - в настоящее время является ведущей причиной инвалидизации и смертности больных СД. Частота этого осложнения колеблется в пределах от 20 до 40 % при СД 1 типа [3]. ДН занимает первое место среди всех уточненных причин терминальной почечной недостаточности. Установлена важная роль процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в патогенезе СД 1 типа и сосудистых осложнений [9]. Активация ПОЛ сопровождает процесс физиологического старения организма, а также играет важную роль в развитии и прогрессировании многих заболеваний, в том числе СД и его осложнений. Параллельно с интенсификацией ПОЛ отмечаются изменения активности системы антиоксидант-ной защиты, но результаты исследований состояния антиоксидантных ферментов разноречивы.
Для ДН характерны глубокие нарушения тромбо-цитарно-коагуляционного гемостаза, ее развитие сопровождается нарушением реологических свойств крови и в связи с этим исследование мембран тромбоцитов открывает новые перспективы в изучении сосудистых осложнений, а применение антиокси-дантной терапии в настоящее время становится одним из основных компонентов современного лечения этой большой группы больных [9].
Целью настоящей работы явилось изучение структурно-функциональной организации мембран тромбоцитов у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН и оценка эффективности применения препарата “Сулодексид” (“Vessel Due F”, фирма “Alfa Wassermann”, Италия) [1, 2, 4, 6, 8, 14, 20].
Задачами исследования явились: исследование активности процессов ПОЛ, активности ферментов антиоксидантной защиты, изучение фосфолипидно-
Таблица 1
Характеристика больных СД по полу и возрасту
Больные I-я группа; п=40 2-я группа; п=40 3-я группа; п=40 Всего
Ж 10 (0,08) 26 (0,22) 19(0,16) 55 (0,46)
Пол
М 30 (0,25) 14 (0,12) 21 (0,17) 65 (0,54)
До 20 лет 8 (0,065) 1 (0,01) 9, (0,075) 18 (0,15)
Возраст
20-40 лет 29 (0,24) 15 (0,12) 21 (0,18) 65 (0,54)
Старше 40 лет 3 (0,03) 24 (0,24) 10(0,08) 37 (0,31
Всего... 40 (0,33) 40 (0,33) 40 (0,33) 120 (1,0)
Примечание. В скобках после абсолютных величин приведены значения частоты признака (отношение числа анализируемых признаков к общему количеству значений в вариационном ряду).
го состава мембран тромбоцитов, характеристика транспортных АТФ-аз у больных СД 1 типа в зависимости от стадии ДН и оценка клинической эффективности применения сулодексида наряду с традиционной терапией ДН.
Сулодексид является естественным продуктом, полученным из слизистой оболочки свиньи, относится к классу гликозаминог-ликанов (ГАГ) и состоит из гепариноподобной (80%) и дермата-новой (20%) фракций. Препарат, помимо его действия на систему свертывания крови, обладает нефропротективным эффектом, что проявляется способностью предотвращать пролиферацию ме-зангиума и гиперпродукцию экстрацеллюлярного матрикса, а также утолщение базальной мембраны клубочков и нарушение ее проницаемости при диабетическом поражении почек.
Материалы и методы исследований
Обследовано 120 больных СД I типа с различными стадиями ДН, которые находились в состоянии субкомпенсации. Выделены следующие группы (по 40 пациентов в каждой) : 1-я) больные СД 1 типа с нормоальбуминурией; 2-я) больные СД 1 типа с микроальбуминурией; 3-я) больные СД 1 типа с макроальбуминурией (табл. 1).
Средняя длительность заболевания СД 1 типа с ДН составила 11.8±0,2 года. Длительность заболевания до 5 лет имели 33 % обследованных пациентов, до 10 лет — 24 % больных, до 15 лет — 22 % и свыше 15 лет — 21 % больных. Средняя суточная доза инсулина 38±0,9 Ед. Все пациенты получали человеческие инсули-ны фирм Novo—Nordisk и Eli Lilly. На традиционной схеме двукратного введения инсулина находилось 75 % больных, интенсифицированную схему инсулинотерапии получали 25% больных.
30 человек были обследованы повторно после лечения суло-дексидом на фоне традиционной терапии. В качестве контрольной группы обследованы 30 практически здоровых лиц с нормальной толерантностью к глюкозе и при отсутствии наследственной предрасположенности к СД.
Сулодексид назначался по 1 капсуле (250 LSU) 2 раза в день в течение 21 дня [10, 13].
Полное клиническое и биохимическое обследование включало также определение гликированного гемоглобина (анализатор «1040» - Boehringer Mannheim) (табл. 2), тест на микроальбуминурию («Micral-Test» - Boehringer Mannheim). Выделение тромбоцитов проводилось по методу К.В.Чурина и сотр. (1991). Диеновые конъюгаты (ДК) определяли по методу И.Д. Стальной (1977); шиффовы основания (ШО) - по методу Ф.З.Меерсона и соавт. (1979), фосфолипазную активность - по методу С.А.Тужилина, А.И. Салуэнья (1975). Показатели антиоксидантной защиты определяли по методу В.Н.Чумакова, Л.Ф.Осинской (1977). Результаты обработаны методом вариационной статистики с помощью пакета прикладных программ (SPSS), а также пакета анализа Microsoft Excel на ЭВМ PC (Pentium 111).
Результаты и их обсуждение
У больных СД 1 типа с нормоальбуминурией установлен высокий уровень ДК (р<0,05) и ШО (р<0,05) в сравнении с группой здоровых (табл. 3). С развитием ДН наблюдалось прогрессивное накопление ДК, максимально в стадии макроальбуминурии, наряду со снижением ШО (р<0,05), расцененное нами как снижение резистентности мембран к окислительному стрессу, что согласуется с мнением других авторов [5].
В настоящеее время данные о состоянии антиок-сидантных ферментов противоречивы. Депрессию супероксиддисмутазы (СОД) при СД 1 типа объясняют степенью гликирования фермента. Мы установили повышение активности СОД (р<0,02) и катала-зы (р<0,05) у больных с нормоальбуминурией (см. табл. 3). В то же время обнаружено угнетение активности каталазы уже в стадии микроальбуминурии (р<0,005) наряду с тенденцией к снижению активности СОД и глубокое угнетение активности каталазы (р<0,001) в стадии макроальбуминурии. По мере нарастания тяжести ДН активность Г-6-ФДГ (р<0,05), участвующей в восстановлении глутатиона, резко изменялась, наиболее значительно повышалась у больных с макроальбуминурией.
Дисбаланс в системе ПОЛ - антиоксидантная система в мембранах тромбоцитов у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН изменяет функциональные параметры клеточных мембран, в частности транспортных АТФаз. Достоверно снижается активность Na+-K+- АТФазы по мере нарастания тяжести ДН (р<0,05). Mg’+ и Са2+ - АТФазы имеют тенденцию к увеличению активности в стадии развития макроальбуминурии соответственно до 0,154+0,040 и 0,391+0,020 мкмоль/мг белка в час по сравнению с аналогичными показателями 0,102±0,003 и 0,324 ± 0,024 мкмоль/мг белка в час в группе здоровых.
Следующим этапом нашего исследования было изучение особенностей липидного состава мембран тромбоцитов у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН (табл. 4). Мы получили достоверное снижение наиболее ненасыщенных фракций фосфолипидов ФЭА и ФХ при микро- и макроальбуминурии, причем уменьшение этих фракций нарастало по
Таблица 2
Содержание гликированного гемоглобина у больных СД
Показатель Контрольная группа I -я группа 2-я группа 3-я группа
О п II с О II с О II с О II с
НЬА)С,% 5.51 ±0.24 6.08 ±0.33 * 6.22 ±0.22 ** 7.01 ±0.21 ***
Примечание. Звездочки (*) - достоверность (р<0,05) различий у больных СД I типа: * - у больных с нормоальбуминурией с показателями здоровых; ** - у больных с микроальбуминурией с показателями у больных с нормоальбуминурией; *** - у больных с макроальбуминурией с показателями у больных с микроальбуминурией.
Таблица 3
Содержание продуктов ПОЛ в мембранах тромбоцитов, активность антиоксидантных ферментов, активность ферментов трансмембранного транспорта ионов у больных СД I типа с различными стадиями ДН (М±т)
Показатели Контрольная группа (п=30) 1 -я группа (п=40) 2-я группа (п=40) 3-я группа (п=40)
ДК, нмоль/мл 18.99 ±0.58 26.90 ± 1.20 * 30.69 ± 1.13 ** 35.05 ± 1.14 * * *
ШО, усл.ед.фл. 7.69 ± 0.08 11.50 ±0.03 * 10.29 ±0.64 ** 9.60 ±0.74 ***
СОД усл.ед.торм./мг белка 2.56 ± 0.18 3.28 ±0.11 * 2.59 ±0.18 ** 2.10 ± 0.12 ***
Каталаза, мкмоль/мин/мг белка 0.85 ±0.11 0.97 ±0.03 * 0.58 ±0.02 ** 0.37 ±0.02 ***
Г-6-ФДГ, мед.акт./мг белка 0.27 ±0.05 0.32 ±0.02 * 0.31 ±0.03 ** 0.36±0.01 ***
Ыа+-К+ - АТФаза, мкмоль/час/мг белка 0.11 ±0.01 0.12 ±0.04 * 0.12 ±0.01 ** 0.11 ±0.03 ***
Мд^+ - АТФаза, мкмоль/час/мг белка 0.10 ±0.03 0.14 ±0.01 * 0.15 ±0.02 ** 0.15 ± 0.04 ***
Са^+ - АТФаза, мкмоль/час/мг белка 0.32 ±0.02 0.34 ±0.06 * 0.37 ±0.01 ** 0.39 ±0.02 ***
Примечание. Звездочки (*) - достоверность (р<0,05) различий у больных СД I типа: * - у больных с нормоальбуминурией с показателями здоровых; ** - у больных с микроальбуминурией с показателями у больных с нормоальбуминурией; *** у больных с макроальбуминурией с показателями у больных с микроальбуминурией.
мере усугубления тяжести ДН при одновременном увеличении в клеточных мембранах фракции ЛФХ. Наибольшее содержание ЛФХ установлено в стадии развития макроальбуминурии (0,015±0,003 ммоль/л).
Для коррекции выявленных нарушений использовали препарат “Сулодексид”. Мы исследовали влияние сулодексида на состояние мембран тромбоцитов в различные стадии ДН. Предварительно оценивали препарат в группе больных СД I типа с нормоальбуминурией. Состояние компенсации метаболических
нарушений в течение 21 дня оставалось стабильным. Сахароснижающая терапия не изменялась.
На фоне применения сулодексида, особенно отчетливо во 2-й группе больных с микроальбуминурией, отмечен положительный эффект на структурнофункциональную организацию клеточных мембран тромбоцитов. Препарат оказывал ингибирующее воздействие на начальные этапы ПОЛ (табл. 5) при одновременном накоплении конечных продуктов ШО. Ограничение процессов ПОЛ при использова-
Таблица 4
Содержание основных фракций фосфолипидов (в ммоль/ л) в мембранах тромбоцитов у больных СД 1 типа
с различными стадиями диабетической нефропатии (М±т)
Показатели Контрольная группа (п=30) 1 -я группа (п=40) 2-я группа (п=40) 3-я группа (п=40)
Лизофосфатидилхолины (ЛФХ) Фосфатидилсерины (ФС) Сфингомиелины (СМ) Фосфатидилхолины (ФХ) Фосфатидилэтаноламины (ФЭА) 0.009 ±0.001 0.017 ±0.001 0.034 ± 0.002 0.063 ± 0.003 0.038 ±0.001 0.011 ±0.005 * 0.016 ±0.008 * 0.033 + 0.004 * 0.053 ±0.009 * 0.035 ± 0.002 * 0.013 ±0.004 ** 0.017 ±0.002 ** 0.031 ±0.002 ** 0.046 ±0.002 ** 0.031 ±0.004 ** 0.015 ±0.003 *** 0.018 ± 0.001 *** 0.029 ±0.004 *** 0.042 ± 0.003 *** 0.028 ±0.004 ***
Примечание. Звездочки (*) - достоверность (р<0,05) различий у больных СД 1 типа: * - у больных с нормоальбуминурией с показателями здоровых; * * - у больных с микроальбуминурией с показателями у больных с нормоальбуминурией; * * * - у больных с макроальбуминурией с показателями у больных с микроальбуминурией.
14
3/2\
Таблица 5
Динамика содержания продуктов ПОЛ в мембранах тромбоцитов, активности антиоксидантных ферментов, содержания основных фракций фосфолипидов, изменение активности ферментов трансмембранного транспорта ионов мембран тромбоцитов у больных СД 1 типа с микроальбуминурией на фоне терапии сулодексидом (М±ш)
Показатели Контрольная группа (п=30) Больные до лечения (п= 10) Больные после лечения (п= 10)
Диеновые конъюгаты, нмоль/ мл 18.99 ±0.58 30.81 ±0.11 * 20.46 ±0.15 **
Шиффовые основания, усл.ед.фл. 7.69 ± 0.08 10.75 ±0.52 * 8.97 ±0.32 **
СОД усл.ед.торм./ мг белка 2.56 ± 0.18 2.61 ±0.16 * 2.22 ±0.18 **
Каталаза, мкмоль/ мин/ мг белка 0.85 ±0.11 0.59 ±0.02 * 0.60 ±0.03 **
Г-6-ФДГ, мед.акт./ мг белка 0.27 ±0.05 0.31 ±0.03 * 0.29 ±0.01 **
ЛФХ, ммоль/ мл 0.009 ±0.001 0.014 ±0.004 * 0.011 ±0.003 **
ФС, ммоль/ мл 0.017 ±0.001 0.018 ±0.002 * 0.017 ±0.004 **
СМ, ммоль/ мл 0.034 ± 0.002 0.032 ± 0.002 * 0.032 ±0.002 **
ФХ, ммоль/ мл 0.063 ±0.003 0.049 ± 0.003 * 0.052 ±0.005 **
ФЭА, ммоль/ мл 0.038 ±0.001 0.032 ±0.003 * 0.035 ±0.003 **
Ыа*-К* - АТФаза, мкмоль/ час/ мг белка 0.108 ±0.009 0.119 ± 0.010 * 0.118 ± 0.011 **
Мд2* - АТФаза, мкмоль/ час/ мг белка 0.102 ±0.003 0.148 ±0.017 * 0.137 ± 0.048 **
Са2* - АТФаза, мкмоль/ час/ мг белка 0.324 ±0.024 0.372 ±0.012 * 0.357 ± 0.014 **
Примечание. Звездочки (*) - достоверность (р<0,05) различий у больных СД 1 типа: * - у больных с микроальбуминурией с показателями здоровых; * * - у больных с микроальбуминурией до лечения с показателями у больных с микроальбуминурией после лечения.
нии сулодексида сопровождалось повышением активности СОД и каталазы. Высокий эффект препарата был у больных СД 1 типа с нормо- и микроальбуминурией, что позволяет сделать вывод о его высокой антиоксидантной активности.
У больных с макроальбуминурией эффект применения сулодексида был менее выраженным, что предполагает необходимость более длительного приема препарата (см. рисунок).
Выводы
Характер и выраженность структурно-функциональных нарушений (дестабилизации) клеточных мембран тромбоцитов у больных СД 1 типа с ДН зависят от стадии развития ДН.
Активация свободнорадикального окисления липидов в тромбоцитах больных СД 1 типа с ДН при-
водит к модификации липидного бислоя клеточных мембран, что проявляется значительным уменьшением содержания фракций фосфатидилэтаноламина наряду с возрастанием фракции лизофосфатидилхо-лина.
Изменение липидного состава клеточных мембран тромбоцитов у больных СД 1 типа по мере прогрессирования ДН сопровождается угнетением активности Ыа+-К+ - АТФазы наряду с повышением активности Са2+ и М§2+- АТФазы.
Применение сулодексида у больных СД 1 типа с различными стадиями ДН в течение трех недель по 1 капсуле 2 раза в день (500 Ь5и) способствует во всех исследуемых группах снижению уровня диеновых конъюгатов, повышению активности ферментов антирадикальной зашиты, что оказывает мембраностабилизирующий эффект. Более эффективным было назначение препарата у больных с микроальбуминурией.
ОІ
Контр.гр. До лечения После лечения
■ Диеновые конъюгаты, н Шиффовые основания, усл.ед.фл.
нмоль/мл*
■ Лизофосфатидилхолины ■ Фосфатидилсерины
□ Сфингомиелины ■ Фосфатидилхолины
■ Фосфатидилэтаноламины
Изменение основных показателей у больных СД1 типа с макроальбуминурией
на фоне терапии сулодексидом
Литературе
1. Астамирова Х.С., Залевская А.Г., Карпова И.А. и др.// Тезисы докладов I Российского диабетологического конгресса. - М., 1998. - С. 31.
2. Воронцов A.B., Дедов И.И., Шестакова М.В. и др.// Пробл. эндокри-нол. - 1996. - Т. 42. - № 5. - С. 14 - 1 8.
3. Дедов И.И., Шестакова М.В. Диабетическая нефропатия. - М., 2000.
4. Казакова И.А., Черемискина И.Б., Мосеев Д.С.// Тезисы докладов I Российского диабетологического конгресса. - М., 1998. - С. 146.
5. Нефропатии (Аспекты мембранологии)/ Жмуров В.А., Крылов В.И., Кашуба Э.А., Чимаров В.М. - Тюмень, 1 993.
6. Петеркова В.А., Мишина И.И., Щербачева Л.Н. и др.// Сахарный диабет. -1999.- № 3. - С. 31 -33.
7. Расовский Б.Л., Тарасов A.B., Трельская И.Ю. и др.// Клиническая медицина. - 1 998. - № 7. - С. 40 - 42.
8. Роль гликозоаминогликанов (ГАГ) в лечении сосудистых осложнений сахарного диабета// Тезисы выступлений на конференции, 26 ноября 1996 г. - С.-Петербург, 1996.
9. Тромбоциты (состав, функции, биомедицинское значение)/ Бышев-
ский А.Ш., Галян С.Л., Дементьева И.А. и др. - Тюмень, 1996.
1 0. Чугунова Л.А., Шамхалова М.Ш., Шестакова М.В. и Др.// Тезисы докладов I Российского диабетологического конгресса. - М., 1998.
1 1. Чугунова Л.А., Шестакова М.В., Шамхалова M.LU.// Сахарный диабет.-1 999.-№ 3. - С. 34 - 35.
12. Шестакова М.В., Воронцов А.В., Чугунова Л.А. и др.// Клиническая фармакология и терапия. - 1 997. - Т. 6. - № 1. - С. 80 - 81.
1 3. Шестакова М.В., Чугунова Л.А., Воронцов А.В. и др.// Терапевтический архив. -1 997. - Т. 69. - № 6. - С. 34 - 37.
14. Dedov I., Shestakova М., Vorontzov A., Palazz'ini Е.// Nephrol Dial Transplant. - 1997. - Nov. 12(1 1). - P. 2295-2300.
1 5. Gaddi A., Galetti C., Illuminati B. et al.// J.Int.Med.Res.- 1996. -Sep.24(5). - P. 389-406.
1 6. Gambaro G., Baggio B.// Nephrol. Dialys. Transplant. - 1 996. - Vol.
1 1. - P. 762 - 764.
17. Gambaro G., Venturini A.P., Noonan D.M. // Kidney Int. - 1 994. - Vol.
46.-P. 797-806.
1 8. Skrha J., Perusicova J., Pontfuch P. et al.// Diabetes Research and Clinical Practice. - 1 997. - Vol. 38 (Issue 1) - P. 25-31.
1 9. Sorrenti G., Grimaldi М., Canova N. et al.// J.Int.Med.Res.- 1 997.-Mar. 25(2).-P. 81 -86.
20. Szelanowska М., Poplawska A., Jopdska J. et al.// Curr. Med. Res. Opin. - 1 997. - Vol. 3(9). - P. 539 - 545.
Контр.гр. До лечения После лечения
■ СОД, усл.ед.торм./ мг белка ■ Катал аза, мкмоль/ мин/ мг белка
□ Г-6ФДГ, мл.ед.акт./ мг белка
