CC BY
17
ХРОМОСОМНЫЕ ЧИСЛА И ХЕМОСИСТЕМАТИКА CHROMOSOME NUMBERS AND CHEMOSYSTEMATICS
УДК 582.736:581.134+581.15
О.В. Дорогина O.V. Dorogina
Е.В. Жмудь E.V. Zhmud'
Н.С. Звягина N.S. Zviagina
ИЗМЕНЧИВОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ СПЕКТРОВ
ЗАПАСНЫХ БЕЛКОВ СЕМЯН ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ASTRAGALUS (FABACEAE)
ELECTROPHORETIC SPECTRA VARIABILITY AND SPECIFICITY OF THE SEED STORAGE PROTEINS OF SOME ASTRAGALUS SPECIES (FABACEAE)
Аннотация. Данные сравнительного анализа электрофоретических спектров полипептидов семян и межвидовая изменчивость у видов Astragalus подтверждают принятое деление на секции Hemiphaca и Cenan-trum. Образцы Astragalus frigidus внутри видов секции Cenantrum на дендрограмме образовали отдельную кладу. Среди других трех видов этой же секции наиболее гетерогенны А. propinquus и А. membranaceus, образцы которых не разделились на отдельные клады.
Ключевые слова: род Astragalus, эндемичные виды, изменчивость, электрофоретические спектры, запасные белки семян.
Summary. The date of the comparative analysis of electroforetic spectra of the seed storage proteins and the intra-specific variability for some Astragalus species proved their division into two sections Hemiphaca and Cenantrum. It was shown that Astragalus frigidus formed the separate branch within the section Cenantrum. Astragalus propinquus аМ A. membranaceus were indicated as the most heterogenous species and did not form separate branches.
Key words: Astragalus, endemic species, variability, electroforetic spectra, seed storage proteins
Род Astragalus L. (Fabaceae) на террито- гал сходный (A. propinquus Schischk.) и астрагал
рии Сибири представлен 92 видами (Выдрина, перепончатый (A. membranaceus (Fisch.) Bunge),
1994), из них от 11 до 17 видов являются энде- существуют определенные трудности. Диагнос-
мичными и подлежат охране на государствен- тика этих видов базируется на комплексе коли-
ном уровне (Красная книга РФ, 2008; Редкие ..., чественных и качественных морфологических
1980). Многие виды этого рода используются в признаков (Выдрина, 1994). К первой группе
качестве кормовых и лекарственных растений. признаков относятся высота побегов, число пар
(Растительные ..., 2010). Неоднократно пред- листочков и их размер, длина чашечки, ее зубцов
принимались попытки определения объема ви- и частей венчика, размер бобов. Количествен-
дов, что было связано, в основном, с практичес- ные диагностические морфологические приз-ким их использованием (Сиднева, 2005; Tina et наки этих двух видов, как и их ареалы, пере-
al., 2003; Yip, Kwan, 2006). крываются. Качественные признаки (опушение
Однако с установлением объема видов побегов, листочков, бобов, чашечки и ее зубцов,
некоторых представителей секций Hemiphaca - а также форма чашечки и ее зубцов) в значитель-
астрагал ольхонский (A. olchonensis Gontsch.), ной степени носят субъективный характер. Для
астрагал двунадрезанный (A. bifidus Turcz.) и сравнения в работе приведены данные электро-
Cenantrum, в том числе таких видов, как астра- форетического исследования образцов астрагала
холодного (A. frigidus (L.) A. Gray), также пред-
Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, ул. Зояотодолинская, 101; 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: olga-dorogina@yandex.ru, elenazhmu@ngs.ru, zviagnat@rambler.ru
Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Zolotodolinskaya str., 101; 630090, Novosibirsk, Russia
Поступило в редакцию 13.09.2012 г.
Submitted 13.09.2012
ставителя секции Cenantrum, морфологически хорошо дифференцированного от A. propinquus и A. membranaceus.
Важным критерием для определения объема вида является его ареал. Так, A. olchonensis и A. bifidus характеризуются высоким уровнем морфологического сходства, однако распространение и экологический ареал A. bifidus шире. Его ареал охватывает, помимо острова Ольхон, Маломорское побережье Байкала и Южную Бурятию.
Что касается A. propinquus, он произрастает в основном в Западной и Средней Сибири, Монголии и Северном Китае, тогда как A. membranaceus - преимущественно в Восточной Сибири, Монголии, Западном Китае. Однако их ареалы перекрываются (Выдрина, 1994). Необходимо отметить, что А. sericeocanus занесен в Красную книгу Республики Бурятии (2002) как редкий вид, для которого на территории России известно лишь 2 местонахождения. Astragalus olchonensis - эндемик прибрежных песков и дюн острова Ольхон и восточного побережья Байкала. Вид занесен в Красную книгу Иркутской области (2001) и Российской Федерации (2008), где он причислен к группе узколокальных эндемиков, находящихся под угрозой исчезновения.
Лимитирующими факторами, ограничивающими численность двух указанных редких видов, является слабая конкурентоспособность и неустойчивое состояние локальных популяций, зависимое от подвижности песчаного субстрата, на фоне хозяйственной и рекреационной нагрузки.
Таким образом, отсутствие четких морфологических различий между представителями этих видов и в значительной степени общие места произрастания затрудняют идентификацию растений этих видов и установление их объема. Кроме того, морфологическая изменчивость, особенно у видов с перекрестным опылением, спонтанная межвидовая и межродовая гибридизация значительно затрудняют таксономическую классификацию внутри рода.
Появляется необходимость в применении дополнительных методов для решения спорных вопросов, касающихся идентификации близкородственных видов, образцов, отклоняющихся от типовых экземпляров, и гибридных форм, возникающих при интрогрессии генетического материала.
Некоторыми исследователями была предпринята попытка проведения хемотаксономичес-кого исследования видов секции Cenantrum с использованием таких признаков-маркеров, как
состав и содержание флавоноидов. Эти исследования выявили видоспецифичность «флавоно-идных профилей» и самостоятельность видов комплекса A. membranaceus, A. propinquus и A. mongholicus (Сиднева, 2006; Tina et al., 2003).
Преимущества запасных белков заключаются в значительном внутривидовом полиморфизме, независимости от условий произрастания растений и разной степени специфичности, которую можно использовать как фактор видовой идентификации растений (Агафонова (До-рогина) и др., 2004).
Целью данной работы явилось изучение специфичности и изменчивости электрофорети-ческих спектров полипептидов семян у растений видов Astragalus из секций Hemifaca и Cenantrum, включая байкальские эндемики A. olchonensis и A. sericeocanus.
Материалы и методы. В работе использовали выборки семян (15-30 шт.) двух видов Astragalus секции Hemifaca: A. olchonensis и A. bifidus (Иркутская область) и четырёх видов из секции Cenantrum: A. propinquus (Горный Алтай, Тува, Бурятия, Иркутская область); A. membra-naceus (Читинская область); A. frigidus (Горный Алтай и Иркутская обл.); A. sericeocanus (Бурятия) (табл. 1).
Для разделения запасных белков семян применили метод электрофореза в полиакри-ламидном геле (Laemmli, 1970), модифицированный нами при изучении полиморфизма запасных белков эндосперма (проламинов) семян у представителей рода Elymus L. (Агафонова (Дорогина), Агафонов, 1991). Использовали трис-глициновую буферную систему для SDS-электрофореза в 15 % полиакриламидном геле. Для лучшего разделения белковых компонентов при приготовлении экстрактов в качестве редуцирующего агента был применен 2-меркапто-этанол.
Молекулярную массу каждой полипептидной фракции оценивали по стандартному образцу - эталонному спектру, состоящему из компонентов, промаркированных белками с известными молекулярными массами. Образцом называли белковый экстракт, полученный из одного семени и представленный на электрофо-реграмме в виде 1 спектра. Для количественной оценки уровня изменчивости белковых спектров использовали среднее значение коэффициента сходства (Ксх), характеризующего уровень изменчивости популяции и рассчитанный по формуле (Ladizinsky, Hymovits, 1979):
Таблица 1
Места сбора семян растений рода Astragalus
Вид Происхождение образцов
Astragalus bifidus Иркутская область, (обл.), Иркутский район (р-н), окрестности села (окр. с.) Сарма
А. olchonensis Иркутская обл., Иркутский р-н, остров Ольхон
A. frigidus Горный Алтай (ГА), Кош-Агачский р-н, окр. с. Джазатор
Иркутская обл., Иркутский р-н, окр. пос. Сарма
A. membranaceus Читинская обл., Приаргунский р-н, окр. с. Олочи
Читинская обл., Карымский р-н, окр. с. Урульга
Читинская обл., Даурский заповедник, Адон-Челон
А. propinquus ГА, Кош-Агачский р-н, окр. с. Джазатор
ГА, Кош-Агачский р-н, окр. с. Кокоря
Тува, заповедник Азас
Бурятия, Улан-Удэ, окр. с. Верхняя Березовка
A. sericeocanus Бурятия, Прибайкальский р-н, окр.с. Турка
к = n / (n1+n2) х 100 %,
где N1 - количество пар гомологичных белковых компонентов двух сравниваемых образцов, N2 - количество различающихся компонентов. Вычисления проводили для каждой пары спектров внутри и между выборками. Построение матрицы проводили по наличию (1) или отсутствию (0) белкового компонента для каждого из образцов. Расчеты выполняли с использованием компьютерной программы "Statistica 8".
Результаты и обсуждение. На основании анализа электрофоретических спектров представителей изученных видов Astragalus было обнаружено, что все они состоят из компонентов, величина молекулярных масс которых составила от 14 до 116 кД (рис. 1). Наиболее консервативные компоненты отмечались в области около 18-20 кДа, которые можно рассматривать как инвариантные. Общими для всех видов секции Hemiphaca следует считать компоненты в области 116 кДа, а для секции Cenantrum - в об-
ласти 22 кДа (на рис. 1 - отмечены стрелками). В целом характер распределения полипептидов для всех образцов внутри каждой из этих секций можно считать весьма сходным.
По нашему мнению, образцы А. Ьгрёш, произраставшие на берегу Сарайского залива и исследованные нами, имели переходные признаки между А. olchonensis и А. bifidus (Жмудь и др., 2011). Как видно из рисунка 1, в структуре белковых спектров обоих этих видов существует значительное сходство, которое просматривается и в характере распределения основных диагностических компонентов. Кроме того, у этих видов и внутривидовая, и межвидовая изменчивость была минимальной (табл. 2). Электрофоретические спектры А. olchonensis и А. Ьгрс1ш довольно четко отличаются по архитектонике от А. sericeocanus, А. рго-рт[иш, А. твтЬгапасеш и А. frigidus.
Анализ изменчивости, основанный на величине коэффициентов сходства, показал, что почти у всех видов внутривидовая изменчивость меньше, чем межвидовая. Исключение соста-
Таблица 2
Значения внутри- и межвидовых коэффициентов сходства (Ксх, % ) у представителей рода Astragalus
из секций Cenantrum и Hemiphaca
Вид Секция Hemiphaca Секция Cenantrum
A. olchonensis A. bifidus A. propinquus A. membranaceus A. sericeocanus A. frigidus
A. olchonensis 67.7* 48.4 10.8 11.0 12.2 8.0-
A. bifidus 48.4 57.5 10.5 11.0 17.1 10.1
A. propinquus 10.8 10.5 32.8 26.0 26.8 9.7
A. membranaceus 11.0 11.0 26.0 26.7 19.5 22
A. sericeocanus 12.2 17.1 26.8 19.5 56.0 10.9
A. frigidus 6.9 10.1 9.7 12.3 10.9 46.5
* жирным шрифтом выделены значения внутривидовых Ксх.
ч ✓ V " VBto - ■>
45 -
35 -
25 - V
]В -
I 4 -
kD& 1 1 II 1 1 II М A. oLchonensis A. bifidus М A. sericeocanus A propinquus A. membranaceus A frigidus
Рис. 1. Электрофореграмма спектров запасных белков семян растений у видов р. Astragalus.
вили две пары видов: А. ргор!щиш - А. тет-Ьгапасеш и А. olchonensis - А. bifidus, у которых коэффициенты сходства между видами приближались к величине, соответствующей внутривидовой изменчивости. При этом уровень сходства между этими и остальными видами значительно меньше (табл. 2), что также подтвердилось и по расположению компонентов на спектрах этих
видов (рис. 1). В то же время, было установлено, что величины Ксх между А. sericeocanus - А. рго-pinquus и А. тетЬгапасеш внутри секции Сепап-1гит значительно выше, чем у этих же видов с А. frigidus. Это также подтвердилось отличием архитектоники спектров на электрофореграммах этих видов от А. frigidus, хотя при этом не исключено наличие внутри- и межвидовой изменчивости.
1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 ОД
1
1 l 1
..............1.............. I
1 1 A. olchmuensis II II II 1 A.biiMus А. эеriceocanus A. propimquiis А. пиетЬгапасeus 1 1 A. frigidus
Рис. 2. Дендрограмма взаимосвязи состава запасных белков семян некоторых видов p. Astragalus.
Сравнительный анализ электрофоретических спектров по запасным белкам семян внутри популяций эндемичных видов A. olchonensis и A. sericeocanus показал, что спектры внутри каждого из этих видов идентичны по расположению на них компонентов (см. рис. 1). Поэтому величины внутривидовой изменчивости, вычисленные по среднему значению коэффициентов сходства у этих видов, по сравнению с другими видами невысокие (Ксх = 67.6 и 57.5 %), что является одной из характеристик редких и исчезающих видов и является доказательством процессов (возможно, инбридинга), приводящих к деградации популяций.
Исходя из этого, в программах по восстановлению редких видов необходимо учитывать исторически сложившуюся внутривидовую генетическую подразделенность, уровень ее изменчивости, и включать исследование изменчивости и её динамики в популяциях редких и близких к ним полиморфных видов.
На дендрограмме (рис. 2), построенной на основании электрофоретических спектров полипептидов семян видов из секций Hemiphaca и Cenantrum, все исследованные виды разделились на две клады, что соответствует двум секциям (Дорогина и др., 2011). В одной кладе разместились A. olchonensis и A. bifidus, а в другой -А. sericeocanus, А. propinquus, А. membranaceus и А. frigidus. Такое разделение соответствует более высоким величинам Ксх между видами внутри каждой клады и наличию на электрофореграм-мах двух различных типов полипептидных спектров, что согласуется с принятым в настоящее время делением на эти две секции.
На дендрограмме среди видов секции Cenantrum отделяется от прочих A. frigidus, формирующий отдельную кладу (см. рис. 2). Нами обнаружено, что образцы А. sericeocanus, характеризующиеся высоким уровнем внутривидового сходства, были несколько обособлены на дендрограмме, но вошли в состав общей клады с родственными видами из этой же секции - A. pro-pinquus и A. membranaceus. Величина коэффициентов сходства внутри видов этой секции варьирует в значительной степени. Так, очень высокие показатели были получены для двух видов - A. frigidus и A. sericeocanus. Оба имеют высокий и очень высокий коэффициенты внутривидового сходства (см. табл. 2). Первый из них - широко распространенный вид с узким экологическим ареалом, второй - эндемичный вид с узким эколо-
гическим и географическим ареалом. Возможно, большое внутривидовое генетическое сходство обусловлено узкой экологической приуроченностью видов. Нами обнаружено, что А. frigidus и A. sericeocanus, представленные на дендрограм-ме отдельными кладами и характеризующиеся высокими Ксх внутри вида, имеют очень небольшие величины Ксх с A. propinquus и A. membran-aceus. Необходимо отметить, что изменчивость как внутри, так и между видами A. propinquus и A. membranaceus близка по величине (см. табл. 2). В свою очередь, эти близкородственные виды на дендрограмме не разделились на две клады. Их образцы сформировали единую кладу.
Выводы. Данные сравнительного анализа электорофоретических спектров полипептидов семян видов Astragalus подтвердили принятое деление на секции Hemiphaca и Cenantrum. В результате проведенных нами исследований установлено, что уровень сходства между видами секции Hemiphaca выше, чем секции Cenantrum, что отражает более тесные эволюционные связи между A. olchonensis и A. bifidus.
Внутри секции Cenantrum отделяется от прочих A. frigidus, формирующий отдельную кладу. Среди других трех видов этой же секции наиболее гетерогенны А. propinquus и А. membranaceus, образцы которых не образовали отдельных клад. Внутривидовая изменчивость этих двух представителей секции по полипептидным спектрам семян практически такая же, как и межвидовая, что подтверждается средними значениями Ксх внутри и между этими видами. Тем не менее, их сходство с двумя другими представителями этой же секции в среднем вдвое ниже.
Выявленный низкий белковый полиморфизм семян эндосперма A. olchonensis и A. seri-ceocanus соответствует представлениям об эндемичных видах, имеющих узколокальное распространение. Можно предположить, что усилению гомогенной структуры этих видов способствует значительная антропогенная нагрузка в местах их произрастания, что должно послужить предпосылкой для усиления мер их охраны.
Авторы выражают благодарность к. б. н. О.В. Сидневой за предоставленные образцы семян A. membranaceus из Читинской области и A. propinquus из Тувы (заповедник Азас).
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: Интеграционный проект № 20 и Программы 30 Президиума РАН.
ЛИТЕРАТУРА
Агафонова (Дорогина) О.В. Существует ли геномная специфичность в роде пырейник? // Докл. Акад. Наук, 1997. - Т. 355, № 6. - С. 838-840.
Агафонова (Дорогина) О.В., Агафонов А.В. Повышение разрешающей способности электрофоретичес-кого метода для таксономических и генетико-селекционных исследований многолетних злаков трибы Пшени-цевые (Triticeae). - Киев, 1991. - 11 с. (Деп. в ВИНИТИ 23.10.91, N 2467 - В91).
Агафонова (Дорогина) О.В., Агафонова М.А. Идентификация близкородственных видов Hedysarum theinum, H. neglectum, H. austrosibiricum (Fabaceae) с помощью запасных глобулинов семян // Бот. журн., 2004. - Т. 89, № 10. - С. 1637-1645.
Выдрина С.Н. Астрагал (Astragalus L.) // Флора Сибири. Т. 9: Fabaceae (Leguminosae). - Новосибирск: Наука, 1994. - С. 20-151.
Дорогина О.В., Жмудь Е.В., Звягина Н.С. Изменчивость электрофоретических спектров запасных белков семян некоторых представителей рода Astragalus (Fabaceae) // Матер. Х Междунар. науч.-практ. конф. «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии». - Барнаул, 2011. - С. 37-39.
Жмудь Е.В., Елисафенко Т.В., Верхозина А.В., Кривенко Д.А., Звягина Н.С., Дорогина О.В. Состояние популяции эндемичного вида Astragalus olchonensis (Fabaceae) на острове Ольхон (Байкал) // Бот. журн., 2011. - Т. 96, № 2. - С. 245-256.
Красная книга Иркутской области: Сосудистые растения / Под ред. А.М. Зарубина. - Иркутск, 2001. -
200 с.
Красная книга Республики Бурятия. Растения и грибы. - Новосибирск, 2002. - 340 с. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы) / Гл. редколл.: Ю.П. Трутнев и др.; сост. Р.В. Камелин и др. - М., 2008. - 885 с.
Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 3. Семейства Fabaceae - Apiaceae / Отв. Ред. А.Л. Буданцев. - СПб.-М.: Товарищество научных изданий КМК, 2010. - 601 с.
Редкие и исчезающие растения Сибири. - Новосибирск, 1980. - 223 с.
Сиднева О.В. Биохимическая специфичность сибирских видов секции Cenantrum Koch рода Astragalus L. (Fabaceae) // Turczaninowia, 2005. - Т. 8, вып. 4. - С. 73-82.
Сиднева О.В. Хемотаксономическое исследование видов секции Cenantrum Koch рода Astragalus L. (Fabaceae Lindl.) Сибири: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - Новосибирск, 2006. - 16 с.
Dong T.T., Ma X.Q., Clarke C, Song Z.H., Ji Z.N., Lo C.K., Tsim K.W. Phylogeny of Astragalus in China: Molecular Evidense from the DNA Sequences of 5S rRNA Spacer, ITS, and 18S rRNA // J. Agric. Food Chem., 2003. - Vol. 51. - P. 6709-6714.
Ladizinsky G., Hymovits T. Seed protein electrophoresis in taxonomic and evolutionary studies // Theor. Appl. Genet., 1979. - Vol. 54. - P. 145-151.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970. - Vol. 227, № 5259. - Р. 680-685.
Yip P.Y., Kwan H.Sh. Molecular identification of Astragalus membranaceus at the species and locality levels // Journal of Ethnopharmacology, 2006. - № 106. - P. 222-229.
