CC BY
34
УДК 582.572.7: 581.19: 543.545
О.В. Дорогина O.V. Dorogina
В.М. Доронькин V.M. Doronkin
И.Ю. Селютина I.Yu. Selutina
Е.С. Кониченко E.S. Konichenko
структура рода iris l. (iridaceae juss.) азиатской россии, выявленная sds-электрофорезом запасных белков семян
structure of the genus iris l. (iridaceae juss.) in asiatic russia revealed by sds-electrophoresis of seed stogage proteins
Аннотация. Проведена оценка таксономической структуры рода Iris L. Азиатской России с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле. Полученные результаты показали, что виды рода Iris внутри секции имеют сходную структуру полипептидных спектров. Для I. ensata, I. potaninii и I. bloudowii выявлена видоспецифичность по запасным белкам семян. С помощью коэффициентов сходства определен уровень различия между разными видами; обнаружено, что виды, принадлежащие к одной секции, имеют большие величины коэффициентов сходства (64-73%), чем виды, принадлежащие к разным секциям (Ксх=23,3-51,4%). Результаты исследования также подтверждают деление Iris на подроды и секции, предложенное ранее В.М. До-ронькиным (2006).
Ключевые слова: Iris, Iridaceae, таксон, систематика, SDS-электрофорез, белки эндосперма.
Summary. Preliminary assessment of taxonomic structure of the genus Iris L. of Asiatic Russia by SDS-electrophoresis in polyacrylamide gel was performed. It is shown that the species from the same section have similar structure of the polypeptide spectra. For I. ensata, I. potaninii, and I. bloudowii, the species specificity of seed storage proteins was revealed. Distinction level is defined by coefficient of similarity between different species; similarity of species from the same section is sufficiently higher (64-73%) than between species from different sections (23,351,4%). Also, our results favor the system of Iris of Asian Russia elaborated by Doronkin (2006).
Key words: Iris, Iridaceae, taxon, systematization, SDS-electrophoresis, seed storage proteins.
Объем рода Iris L. (Iridaceae Juss.) до также для решения проблем частной филогении
последнего времени является предметом прис- и эволюции таксонов (Дорогина и др., 2003; Се-
тального внимания. Так, Г.И. Родионенко (2005, михов, 1991). Оптимальным уровнем примене-
2006а, б, 2007, 2009), основываясь на морфоло- ния данного метода является изучение внутри- и
гии, выделил ряд таксонов из этого рода в само- межвидовой изменчивости, так как преимущест-
стоятельные роды. Молекулярно-генетические ва запасных белков заключаются в значительном
исследования C.A. Wilson (2011) показали оши- внутривидовом полиморфизме, независимости
бочность этой точки зрения. от условий произрастания растений и разной
На основе изучения азиатских предста- степени специфичности (Дорогина, 1997). При
вителей Iris была предложена система рода (До- использовании белковых маркеров исследуется
ронькин, 2006), где виды были распределены в 6 генетическая изменчивость, что особенно важ-
подродов и 8 секций. но при изучении фенотипически близких видов
Целью данной работы явилось уточнение (Дорогина, Агафонова, 2004; Новожилова и др.,
таксономической структуры рода Iris. 1991). К преимуществам данного метода также
Для этого использовали метод SDS- можно отнести его экономичность при достаточ-
электрофореза в полиакриламидном геле, где в но высокой информативности. качестве маркеров были выбраны запасные бел- Материалы и методы. В качестве объек-
ки семени. В частности, этот метод успешно при- та исследования были взяты семена представите-
меняется в таксономических исследованиях, а лей рода Iris Азиатской России (табл. 1). Из каж-
Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, ул. Золотодолтская, 101; 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: olga-dorogina@yandex.ru, norbo@ngs.ru
Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Zolotodolinskaya str., 101; 630090, Novosibirsk, Russia
Поступило в редакцию 20.11.2012 г.
Submitted 20.11.2012
дого исследуемого вида анализировали выборки семян от 8 до 80 шт. (в большинстве случаев - из различных ценопопуляций одного вида).
Перед экстракцией семена замачивали в дистиллированной воде и выдерживали в термостате в течение 1 суток при температуре 37о С. Затем очищали от семенной кожуры, отсекали зародыш и измельчали с помощью ручного пресса. Экстрагировали 2% SDS-буфером при комнатной температуре в течение 12-16 часов. Электорофорез проводили в SDS-системе по методике Laemmli (1970) с учетом модификаций (Агафонова (Дорогина), Агафонов, 1989), но для улучшения разделения использовали 16% поли-акриламидный гель. В каждом случае проводили электрофорез одних и тех же образцов в двух вариантах - с использованием редуцирующего агента, 2-меркаптоэтанола (+Ме), и без него (-Ме). Гели окрашивали Кумасси, фиксировали в 10% ТХУ.
Для оценки молекулярной массы полипептидных фракций использовали белковые маркеры с известными молекулярными массами («Fermentas», Литва): В-галактозидаза - 116.0 кДа, альбумин - 66.2 кДа, овальбумин - 45.0 кДа, лактат-дегидрогеназа - 35.0 кДа, рестрикт эндо-нуклеазы Bsp981 - 25.0 кДа, В-лактоглобулин -18.4 кДа, лизоцим - 14.4 кДа. Изменчивость по полипептидным спектрам у представителей изучаемых видов оценивали с помощью коэффициентов сходства, вычисляемых по формуле (Ladizinsky, Hymovits,1979):
Ксх=[Ш/ (N1+N2)] х 100%, где N1 - число пар гомологичных белковых компонентов; N2 - число различающихся белковых компонентов.
Результаты и обсуждение. У всех изученных видов Iris молекулярные массы белков эндосперма распределились преимущественно в диапазоне от 14.4 кДа до 116 кДа.
У представителей секции Limniris (под-род Limniris) (рис. 1) основные, ярко выраженные компоненты были обнаружены в области от 45 до 116 кДа; 1-3 компонента расположены в области 35 кДа и присутствовала слабо выраженная группа легкоподвижных компонентов.
У представителей секции Ioniris (подрод Ioniris) электрофоретический спектр был представлен небольшим количеством компонентов: один компонент расположен в области 66.2 кДа, 2-3 компонента - в области между 25-35 кДа, кроме того, обнаружены 2 легкоподвижные фракции.
Представители секции Psammiris (подрод Iris) характеризовались следующими особеннос-
тями полипептидного спектра: основные компоненты находились в области между 66.2 и 45 кДа, несколько компонентов (3-5) обнаружено в области 35 кДа и 5-6 легкоподвижных белковых фракций - в области 18.4-14.4 кДа.
Электрофоретический спектр I. ventricosa (подрод Tenuifoliae) сходен со спектрами видов секции Psammiris (подрод Iris), но отличался тем, что у него в области 25.0-18.4 кДа находилась группа из 5-6 белковых субъединиц, кроме того, выявлены отличия в числе низкомолекулярных белков. Основные белковые компоненты I. tenui-folia (подрод Tenuifoliae) были обнаружены в области 35.0-25.0 кДа; в общих чертах спектр сходен с полипептидным спектром I. ventricosa.
На спектрах представителей I. halophila (типовая секция подрода Xyridion) обнаружен один компонент в области 116-66.2 кДа, 2 близкорасположенных компонента в области около 66.2 кДа, группа из 5 компонентов в области 35 кДа и 5 низкомолекулярных субъединиц.
Для видов из секции Haloiris (подрод Eremiris) характерна группа из 4-5 субъединиц, расположенных в области 66.2-45.0 кДа, 3-4 компонента в области 35.0-25.0 кДа и 2-3 легкоподвижных компонента.
На электрофоретических спектрах видов из этой секции (без обработки Ме) были обнаружены небольшие отличия: на спектрах I. pallasii отмечались 3 ярко выраженных компонента в области 25 кДа, 35 кДа и от 45 до 116 кДа. Элек-трофоретические спектры образцов I. biglumis отличались более равномерным распределением компонентов. В случае применения меркаптоэ-танола спектры становились более равномерными и достигалось лучшее разделение белковых субьединиц, но значительных отличий между видами и в этом случае не наблюдалось.
Необходимо отметить, что для изученных видов рода Iris в большинстве случаев внутривидовая изменчивость электрофоретических спектров была невысока. Так, внутрипопуляцион-ная изменчивость в выборках из ценопопуляций I. ensata (подрод Limniris) колебалась в пределах Ксх от 85,8 до 94,3%, различия между це-нопопуляциями также невелики - Ксх=86,6%. По результатам проведенного анализа, среднее внутрипопуляционное значение коэффициентов сходства для I. ventricosa - 94,8% (Селютина и др., 2005). Изменчивость внутри изученных выборок I. oxypetala низкая, что подтверждается высокими средними значениями коэффициентов сходства: для ценопопуляций № 1 Ксх=92,9%,
Таблица 1
Положение изученных видов в системе рода Iris L. Азиатской России (Доронькин, 2006), места сбора образцов из ценопопуляций
Подрод - секция Вид Местонахождение и дата сбора семян
Limniris (Tausch) Spach -Limniris Tausch Iris ensata Thunb. Приморский край. Хасанский р-он, окр. пос. Комиссаро-во. Заливаемый осоково-разнотравный луг. 19.09.2004 г. Кожевников А., Доронькин В.
I. sanguinea Donn Читинская область. Читинский р-он, окр. пос Чепурово. Заросли ивняка на берегу реки. 21.07.2000 г. Доронькин В.
I. setosa Pall. ex Link Якутия. Орджоникидзовский р-он, окр. пос. Качикатцы. Сырой луг. 24.08.1982 г. Доронькин В.
Ioniris Spach -Ioniris (Spach) Rodion. I. uniflora Pall. ex Link Читинская обл. Агинский р-он, окр. с. Агинского, гора Цаган-Обо. Ирисово-хемерокалисово-разнотравная степь. 20.07.2000 г. Доронькин В.
I. ruthenica Ker-Gawl. Республика Алтай. Усть-Коксинский р-он, окр. с. Курун-да. Разнотравный луг на опушке леса. 26.07.2003 г. Мальцева Т.
Eremiris Spach - Haloiris Doronkin I. pallasii Fisch. Республика Алтай. Кош-Агачский р-он, р. Юстыд. Злаково-ирисово-разнотравный луг на берегу реки. 07.09.2002 г. Королюк Е.
I. biglumis Vahl Республика Хакасия. Окр. оз. Шира. Каменистая степь. 10.08.2002 г. Курбатский В.
I. oxypetala Bunge Приморский край. Уссурийский р-он, пос. Пуцилов-ка. Ирисово-марево-злаковый деградированный луг. 17.09.2004 г. Кожевников А., Доронькин В.
Приморский край. Уссурийский р-он, с. Алексее-Никольск. Злаково-полынно-ирисово-разнотравный деградированный луг. 17.09.2004 г. Кожевников А., Доронькин В.
Tenuifoliae (Diels) Doronkin - Tenuifoliae (Diels) Lawrence I. tenuifolia Pall. Читинская обл. Агинский р-он, окр. пос. Агинский. Злаков-ирисовая степь на сухом склоне. 03.06.1980 г. До-ронькин В.
I. ventricosa Pall. Читинская обл. Приаргунский р-он, окр. с. Манкечур. Ирисово-разнотравная степь. 20.07.2000 г. Доронькин В.
Приморский край. Уссурийский р-он, окр. с. Корфовка. Разнотравно-ирисовый луг. 17.09.2004. З. Кожевникова, В. Доронькин.
Xyridion (Tausch) Spach -Xyridion Tausch I. halophila Pall. Омская обл. Черлакский р-он, окр. д. Елизаветинки, левый берег р. Иртыш. Разнотравный злаково-осоковый луг. 20.07.1984 г. Доронькин В.
Iris - Psammiris (Spach) Taylor I. bloudowii Ledeb. Республика Алтай. Онгудайский р-он, окр. пос. Акташ. Ирисово-разнотравный луг. 05.08.2004 г. Королюк А.
I. potaninii Maxim. Республика Алтай. Кош-Агачский р-он, среднее течение р. Калгуты. Каменистые склоны с злаково-осоковым покровом. 05.09.1998 г. Доронькин В.
№ 2 Ксх=97,72%. Среднее межпопуляционное значение Ксх = 95.3%.
В результате проведенной оценки по изменчивости запасных белков, не выявлено существенных отличий между видами. Например, Ксх между I. pallasii и I. biglumis - 65%, в то время как внутривидовые Ксх у I. biglumis характе-
ризовались значениями от 70 до 90%, то есть на межвидовом и внутривидовом уровне изменчивость белковых спектров небольшая и приблизительно одинаковая (Селютина, Черкасова, 1995).
В целом для видов рода Iris можно отметить небольшую индивидуальную, внутрипопу-ляционную и внутривидовую изменчивость. В
Рис. 1. Электрофоретические спектры видов IrisL. (каждый вид представлен двумя треками): 1. I. ensata, I. sanguínea, I. setosa (Limniris); 2. I. bloudowii, I. potaninii (Psammiris); 3. I. ventricosa (Ventricosae); 4. I. uniflora, I. ruthenica (Ioniris); 5. I. halophila (Xyridion); 6. I. tenuifolia (Tenuifoliae); 7. I. pallasii, I. biglumis (Haloiris).
изученных ценопопуляциях при анализе семян в пределах отдельного плода (коробочки) выявлена незначительная изменчивость. Изменчивость, обнаруженная в ценопопуляциях, была значительно больше, чем внутри коробочки.
Однообразие белковых спектров может быть обусловлено рядом причин и связано преимущественно с вегетативным способом размножения вида или небольшим размером популяций. С точки зрения популяционной теории, малые популяции с фрагментарным ареалом должны характеризоваться низким уровнем полиморфизма и гетерозиготности, т. к. уровень генетической изменчивости является результатом взаимодействия мутаций, генетического дрейфа и естественного отбора (Журавлев и др., 1999).
Полученные результаты, характеризующие уровень сходства запасных белков семян видов внутри отдельной секции, показали, что для разных секций величина Ксх колебалась от 64,3% (секция Limniris), где отмечалась наибольшая гетерогенность электрофоретических спектров, до 73,0% в секции Haloiris, для которой характер-
на однородность белковых спектров и незначительная межвидовая дифференциация (табл. 2). На основании сравнительного анализа уровня сходства между секциями можно сделать вывод, что наименьшая величина Ксх была обнаружена между секциями Limniris и Psammiris и составила от 23,3 до 34,5%, а наибольшая - между Limniris и Haloiris - от 64,3 до 73,0% (табл. 3).
На рисунке 2 представлена дендрограмма, построенная на основании электрофоретических спектров запасных белков семян рода Iris. Из рисунка следует, что I. ensata, I. sanguinea, I. setosa; I. uniflora, I. ruthenica; I pallasii, I. biglumis; I. tenuifolia, I. ventricosa; I. bloudowii, I. potaninii образуют отдельные клады и формируют одинаковую модель полипептидных спектров внутри соответствующих секций, что также подтверждается общей картиной электрофоретических спектров запасных белков семян для каждой отдельной секции.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что виды рода Iris внутри секции имеют сходную структуру полипептидных спектров. Для отдельных таксонов (I. en-
Подрод - секция Limniris - Limniris Iris - Psammiris Ioniris - Ioniris Eremiris - Haloiris
К 64,3 64,5 66,7 73,0
Таблица 2
Уровень изменчивости запасных белков семян видов внутри отдельной секции
Таблица 3
Уровень изменчивости запасных белков семян между видами разных секций
4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 33,8 30,2 44,0 31,1 23,5 27,37 40,0 51,1 41,0
2 23,3 29,4 42,0 25,5 26,2 51,4 35,4 41,5 48,0
3 26,2 34,5 48,4 24,0 31,5 32,2 28,4 47,2 41,0
4 40,0 23,4 28,9 29,9 34,3 23,4 34,3
5 42,5 24,2 29,1 31,3 34,3 24,1 26,3
6 26,1 28,3 27,6 28,2 26,3 25,3
7 36,0 27,2 23,1 23,4
8 25,3 35,4 430,0 28,2
9 43,1 31,3 29,1
10 42,3 42,2
Примечание: 1 - I. ensata. 2 - I. sanguínea. 3 - I. setosa (Limniris). 4 - I. blowdowii. 5 - I. pota-ninii (Psammiris). 6 - I. ventricosa (Ventricosae). 7 - I. uniflora. 8 - I. ruthenica (Ioniris). 9 - I. halophila (Xyridion). 10 - I. tenuifolia (Tenuifoliae). 11 - I. pallasii. 12 - I. biglumis (Haloiris).
sata, I. potaninii, I. bloudowii) обнаружена видо-специфичность белковых маркеров. С помощью Ксх определен уровень сходства между разными видами. При этом было обнаружено, что виды, принадлежащие к одной секции, характеризуются большими величинами Ксх (64-73%), чем виды из разных секций (Ксх =23,3-51,4%).
Таким образом, проведенное изучение электрофоретических спектров запасных белков
семян у представителей рода Iris позволило выявить видовую специфичность, а также подтвердить существующее деление рода на подроды и секции в предложенной выше системе рода Iris Азиатской России.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта по Программе «Биологическое разнообразие» №30 Президиума РАН.
Рис. 2. Дендрограмма сходства электрофоретических спектров эндосперма представителей рода Iris L.
ЛИТЕРАТУРА
Агафонов А.В., Агафонова О.В. Способ идентификации генотипов многолетних злаков трибы Пшени-цевые (Triticeae). Авторское свидетельство СССР № 1546022, 1989. - 4 с.
Агафонова (Дорогина) О.В. Существует ли геномная специфичность в роде пырейник? // Докл. Акад. Наук, 1997. - Т. 355, № 6. - С. 838-840.
Агафонова (Дорогина) О.В., Цевелева И.Н., Агафонова М.А. Полиморфизм электрофоретических спектров полипептидов семян некоторых видов сем. Fabaceae, характеризующихся перекрестным типом опыления // Сиб. экол. журн., 2003. - № 1. - С. 9-16.
Дорогина О.В., Агафонова М.А. Идентификация близкородственных видов Hedysarum theinum, H. neglectum и H. austrosbiricum (Fabaceae) с помощью запасных глобулинов семян // Бот. журн., 2004. - Т. 89, № 10. - С. 1637-1645.
Доронькин В.М. Система рода Iris L. (Iridaceae Juss.) Азиатской России // Материалы Всерос. конф., пос-вящ. 60-летию ЦСБС «Роль ботанических садов в сохранении биоразнообразия растительного мира Азиатской России: настоящее и будущее» (Новосибирск, 17-19 июля 2006 г.). - Новосибирск, 2006. - С. 101-103.
Журавлев Ю.Н., Корень О.Г., Музарок Т.И., Резунова Г.Д., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Илюш-ко М.В. Молекулярные маркеры для сохранения редких видов растений Дальнего Востока // Физиология растений, 1999. - Т. 46, № 6. - С. 953-964.
Новожилова О.А., Арефьева Л.П., Семихов В.Ф., Прусаков А.Н., Вахромеев В.И. Исследование про-ламинов злаков методом SDS-электрофореза // Изв. АН СССР, сер. биол., 1991. - № 6. - С. 928-934.
Родионенко Г.И. О самостоятельности рода Xyridion (Iridaceae) // Бот. журн., 2005. - Т. 90, № 1. - С. 55-59.
Родионенко Г.И. Eremiris - новый род семейства Iridaceae // Бот. журн., 2006а. - Т. 91, № 11. - С. 1707-1712.
Родионенко Г.И. О самостоятельности рода Sclerosiphon (Iridaceae) // Бот. журн., 2006б. - Т. 91, № 12. -С. 1895-1898.
Родионенко Г.И. О самостоятельности рода Limniris (Iridaceae) // Бот. журн., 2007. - Т. 92, № 4. -С. 547-554.
Родионенко Г.И. Новая система рода Iris (Iridaceae) // Бот. журн., 2009. - Т. 94, № 3. - С. 423-435.
СелютинаИ.Ю., ЧеркасоваЕ.С. Метод SDS-электрофореза для изучения внутривуидовой изменчивости запасных белков у редких видов рода Iris L. // Труды 3 интеграц. междисциплин. конф. молодых учен. СО РАН и высш. шк. «Научные школы Сибири: взгляд в будущее» (Иркутск, 10-14 октября 2005 г.). - Иркутск, 2005. - C. 294-298.
Селютина И.Ю., Черкасова Е.С., Дорогина О.В., Доронькин В.М. Внутривидовая изменчивость запасных белков у редких видов Iris ensata и I. ventricosa (Iridaceae) // Проблемы изучения растительного покрова Сибири: Материалы III Междунар. конф., посвящ. 120-летию Гербария им. П.Н. Крылова (ТГУ, Томск, 16-18 ноября 2005 г.). - Томск, 2005. - С. 34-35.
Семихов В.Ф. Хемосистематика и ее положение в систематике растений // Журн. общ. биол., 1991. -Т. 52, № 5. - С. 635-645.
Ladizinsky G., Hymowitz T. Seed protein electrophoresis in taxonomic and evolutionary studies // Theor. Appl. Genet., 1979. - Vol. 54. - Р. 145-151.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970. - Vol. 227, № 5259. - Р. 680-685.
Wilson C.A. Subgeneric classification in Iris re-examined using chloroplast sequence data // Taxon, 2011. -Vol. 60, № 1. - P. 27-35.
