Биохимическая специфичность сибирских видов секции cenanirum Koch рода Astragalus L. (Fabaceae) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ХРОМОСОМНЫЕ ЧИСЛА И ХЕМОСИСТЕМАТИКА

УДК 581.19:582.736

О. В. Сиднева O. Sidneva

БИОХИМИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ СИБИРСКИХ ВИДОВ СЕКЦИИ CENANTRUM KOCH РОДА ASTRAGALUS L. (FABACEAE) BIOCHEMICAL SPECIFICITY OF SIBERIAN ASTRAGALUS L. SPECIES OF THE SECTION CENANTRUM KOCH (FABACEAE)

Изучен агликоновый и гликозидный составы сибирских видов рода Astragalus L. секции Cenantrum Koch - A. frigidus (L.) A. Gray, A. frigidus subsp. secundus (DC.) Worosch., А. saralensis Gontsch., А. umbellatusBunge, А. membranaceus (Fisch.) Bunge,A. propinquus Schischk., A. mongholicus Bunge, А. sericeocanus Gontsch. Качественный анализ изученных видов показал, что агликоны флавоноидов растений могут быть хемотаксономическими маркёрами на уровне подсекций, а гликозиды - на уровне видов. Идентифицированы некоторые компоненты агликонового состава. Получены для каждого вида типичные “флавоноидные профили”, являющиеся качественными характеристиками их видоспецифичного гликозидного состава.

Род Astragalus L. является одним из наиболее крупнейшим родом семейства Fabaceae. Представители рода интенсивно изучаются отечественными и зарубежными ботаниками. Высокая степень полиморфизма, разнообразие жизненных форм, экологическая пластичность делают его интересным, но сложным объектом изучения биоразнообразия (Сытин, 1990).

На территории Сибири насчитывается восемь видов астрагалов из секции Cenantrum Koch (Никифорова, 2005). Представляет особый интерес комплекс видов A. membranaceus (Fischer) Bunge, A. propinquus Schischkin, A. mongholicus Bunge из подсекции Semilunaria Gontsch.

М.Г. Попов (1955) выделяет эти виды в качестве рас полиморфного вида A. penduliflorus Lam.: A. membranaceus - даурская раса, А. mongholicus -монгольская и A. propinquus - алтае-саянская. Н.Ф. Гончаров, А.Г. Борисова (Флора СССР, 1946) и Г. А. Пешкова (1979) вышеупомянутые “расы” признают самостоятельными видами. П.Н. Крылов (1933) отмечал, что голый боб А. mongholicus - недостаточный отличительный признак, и считал его формой A. propinquus. С.Н. Выдрина приводит A. mongholicus только для Монголии, считая,

что все указания вида для Сибири относятся A. propinquus (Выдрина, 1994). Н.С. Павлова (1989) понимает A. membranaceus широко, включая в него A. propinquus. В монографии “Legumes of Northern Eurasia” А. mongholicus указан только для Монголии, а A. membranaceus и A. propinquus объединены в A. pendu-liflorus Lam. (Yakovlev et al., 1996).

Неоднозначно мнение систематиков об объёме вида A. frigidus (L.) A. Gray и о ранге A. frigidus subsp. secundus (DC.) Worosch. из подсекции Elliptica Gontsch. Последний указан и как самостоятельный вид A. secundus DC. (Гончаров, Борисова, 1946; Положий, 1964; Пешкова, 1979), и как подвид A. frigidus subsp. secundus (Выдрина, 1994).

Исследования химического состава астрагалов ведутся большей частью в области ботанического ресурсоведения, касающегося распространения и лекарственных свойств астрагалов. Некоторые представители сибирских видов астрагалов были изучены в хемотаксономическом плане (Павлова, 1979; Савось-кин и др., 1982; Кадырова, 1989)

Согласно исследованиям ряда авторов (Дунгэрдорж, 1978; Макбуль, 1980; Блинова, Баланкова, 1968; Комиссаренко, Полякова, 1987; Киселёва и др, 1991; Tian et al., 1993), флавоноиды восточносибирских видов рода преимущественно представлены флавонолами, флавонами и их производными. В корнях A. membra-naceus и A. mongholicus найдены изофлаваны и изофлавоны (Song et al., 1997 а, b; Lin et al., 2000).

В секции Cenantrum флавоноидный состав наиболее хорошо исследован у четырех видов: A. membranaceus, A. propinquus, A. mongholicus и A. frigidus. Различными авторами приводятся противоречивые сведения о составе аглико-новых и гликозидных форм флавоноидов комплекса видов А. membranaceus, А. mongholicus и A. propinquus. Д. Дунгэрдорж (1978) для А. membranaceus приводит только агликоновый состав: кверцетин, кемпферол, рамноцитрин и куматакенин, присутствующий в растении в свободном виде. Для А. mongholicus и A. propinquus указаны одинаковые агликоны - кверцетин, изорамнетин и рамноцитрин, из А. mongholicus им выделены два гликозида - монозиды изорамнетина, из A. propinquus - моно- и биозид изорамнетина, монозид рамноцитрина, биозид кверцетина. А. В. Киселёва и др. (1991) указывают для A. propinquus агликоны кверцетин, изорамнетин и кемпферол, гликозиды - моно- и биозид изорамнетина, монозиды кемпферола и апигенина, биозид кверцетина. Из пары близких A. frigidus s. str. и A. frigidus subsp. secundus ранее изучен только первый. В нем идентифицированы агликоны: кверцетин и кемпферол (Макбуль, 1980; Киселёва и др., 1991), куматокенин (Макбуль, 1980); три гликозида кверцетина, один - кемферола (Макбуль, 1980; Киселёва и др., 1991), по одному - гликозиды хризериола и куматокенина (Макбуль, 1980).

Мы изучали состав флавоноидов видов секции Cenantrum - A. membra-naceus, A. propinquus, A. mongholicus, А. sericeocanus Gontsch., A. frigidus s. str., A. frigidus subsp. secundus, А. saralensis Gontsch., А. umbellatus Bunge с целью использования химических признаков - качественного состава флавоноидов -

для решения вопросов об их таксономическом ранге.

Материалы и методы. Исследовали образцы, собранные в природе в 2000-2003 г.г. на территории Республики Алтай, Бурятии, Забайкалья, а также растения из Гербария ЦСБС СО РАН. Изменчивость гликозидного состава изучали в листьях растений, собранных в центральных и пограничных частях ареалов: для A. membranaceus и A. propinquus исследованы 15 и 16 ценопопуля-ций соответственно, для A. frigidus s. str. - 8, А. mongholicus - 7, A. frigidus subsp. secundus - 5. Агликоновый состав изучен в шести популяциях A. membra-naceus, в шести - A. propinquus, в четырех - А. mongholicus, в трех - A. frigidus s. str. и в трех - A. frigidus subsp. secundus. Гликозидный и агликоновый составы A. sericeocanus, А. saralensis и A. umbellatus изучены в одной ценопопуляции для каждого вида.

Использовали образцы растений в фазах цветения и плодоношения, так как именно в этих фенофазах наиболее полно представлены состав и содержание флавоноидов, что показано на примере изученного ранее A. membranaceus (Сиднева, 2004а).

Состав флавоноидов исследовали методами хроматографии на бумаге, тонкослойной и колоночной хроматографии, УФ-спектроскопией.

Для получения агликонов водно-спиртовый экстракт из надземной части растений гидролизовали 5% раствором серной кислоты 2 часа на водяной бане. Агликоны извлекали диэтиловым эфиром. Разделяли агликоны на колонках с силикагелем (система растворителей: толуол - этилформиат - муравьиная кислота, 5:4:1) и c полиамидным сорбентом (хлороформно-спиртовые смеси), а также двумерной хроматографией на бумаге марки FN 3, 5, 8 (изопропанол - муравьиная кислота - вода, 2:5:5 - I направление; н-бутанол - уксусная кислота - вода, 40:12:28 - II направление).

Для изучения качественного состава гликозидов воздушно-сухое сырьё измельчали, брали точную навеску и сумму флавоноидов исчерпывающе экстрагировали 50% этанолом при нагревании на водяной бане. Объединённый экстракт выпаривали и наносили оптимальное количество на хроматографическую бумагу. Полученные двумерной бумажной хроматографией гликозидные профили (системы растворителей указаны выше) просматривали в УФ-свете и в парах аммиака до и после проявления 5% спиртовым раствором AlCl3.

Идентификацию агликонов и гликозидов флавоноидов проводили на основе сранительного хроматографирования с чистыми веществами, а также при помощи УФ-спектроскопии с использованием щелочных реактивов и комплексообразо-вателей ^abry et al., 1970; Клышев и др, 1978).

Для определения агликонового состава гликозидов использовали методику Высочиной (1967). Для хроматографирования использовали системы растворителей: уксусная кислота - муравьиная кислота - вода (10:2:3), 60% уксусная кислота.

Результаты и их обсуждение. Методом колоночной хроматографии на силикагеле и полиамиде удалось выделить из A. membranaceus 4 агликона. На

основе результатов УФ-спектроскопии с применением ионизирующих и комплексообразующих реагентов и сравнительного хроматографирования с метчиками, а также используя литературные данные (Макбуль 1980; Дунгэрдорж, 1978) вещества идентифицировали: I - с 3,5,4'-триокси-7-метоксифлавоном (рамноцитрином), II - с 3,5,7,4-тетраоксифлавоном (кемпферолом), III - с 3,5,7,4-тетра-окси-3 '-метоксифлавоном (изорамнетином), IV - 3,5,7,3 ',4'-пентаоксифлавоном (кверцетином). По хроматографическому поведению на бумаге в разных системах растворителей агликоны А. mongholicus, A. propinquus и A. sericeocanus соответствуют агликонам A. membranaceus.

На двумерных хроматограммах в УФ свете у обоих подвидов A. frigidus и у А. saralensis отмечено по 5 агликонов, у А. итЬеїїаґш - 7.

Общими для всех изученных видов являются три вещества - кверцетин, кемпферол и изорамнетин. Они были идентифицированы методами бумажной хроматографии с метчиками и в сравнении с агликонами, идентифицированными в А. тетЬгапасеш (рис. 1).

Популяции, в которых исследовали агликоновый состав видов секции, представлены в таблице 1.

Нами показано, что одинаковый агликоновый состав комплекса видов А. mongholicus, А. propinquus и А. membranaceus подсекции Бетіїипагіа подтверждает близкое родство изучаемых видов. Агликоны эндемика А. seri-

Rf

0,8

П,б

0.4

0.2

КГ

0;S

0,6

0.-1

0.2

0.2 0,4 0,й D:S Ri'

A. mentbranaceus, Л. зегісєосатт, Л. rttottghoUctvi, Л. jtfoplnqutfs

0,2

0,4 0.S

I

Kf

A. frigtdus, A. gecunciui, Л. saraleiisis

o;s

0.6

0.4

0.2

1

0.4 0.6 0.8 Rf

рамнощггрин

кемпферол иаорим нетин кверцетин

пе идептпфпппрованные

A. umbeHams

Рис. 1. Схемы двумерных хроматограмм агликонов секции Cenantrum Koch рода Astragalus L.

евоеапш этой же подсекции одинаковы с агликонами вышеперечисленных видов. А. frigidus 8. 1., А. иагаїетіи и А. итЬеїїаґш подсекции Еїїірґіса находятся в более отдалённом родстве с видами подсекции Бетіїипагіа, так как их агликоны имеют некоторое отличие - во всех этих видах обнаружили два вещества, не найденные в видах первой секции. Дополнительно к этим пяти общим агликонам в А. итЬеїїаи отмечен рамноцитрин и еще один компонент. Таким образом, по агликоновому составу данный вид стоит особняком в своей подсекции.

Гликозидный состав астрагалов изучали, применяя двумерную хроматографию на бумаге водно-спиртовых экстрактов листьев. Одинаковые компоненты

Таблица 1

Агликоны секции Cenantrum Koch Восточной Сибири

Местонахождение, местообитание Рамноцитрин | Кемпферол І Изорамнетин | Кверцетин | Агликон 1 | Агликон 2 | 3 К о к и л гА

A. propinquus

Хакасия, Ширинский р-н, окр. с. Катюшкино, лесной луг + + + +

Тува, заповедник “Азас”, разнотравно-злаковый луг + + + +

Новосибирская обл., окр. п. Затонского, остепнённый склон + + + +

Красноярский край, окр. с. Максимовка, берёзово-сосновый лес + + + +

Красноярский край, окр. с. Бражное пойма р. Кан, лесной луг + + + +

Г орный Алтай, Курайский хребет, лиственничный лес + + + +

A. membranaceus

Читинская обл., Хилокский р-н, окр с. Хохотуй, берёзово-сосновый лес + + + +

Читинская обл., окр. с. Урульга, падь Чалдонка, осоково-разнотравно-берёзовый лес + + + +

Читинская обл., окр. с. Урульга, падь Цаун, разнотравно-березовый лес + + + +

Читинская обл., окр. с. Туринская, березово-разнотравный лес + + + +

Иркутская обл., оз.Байкал, мыс Малый Солонцовый, галечный береговой вал + + + +

Иркутская обл., оз. Байкал, окр. п. Бол. Коты, сосновый лес по гребню дюны + + + +

А. mongholicus

Горный Алтай, хр. Чихачёва, долина притока р. Бугузун, мелкощебнистая степь. + + + +

Г орный Алтай, Сайлюгемская степь, сухое русло реки + + + +

Горный Алтай, долина р. Тархата, щебнистая степь + + + +

Бурятия, окр. г. Кяхта, мятлико-луговая степь + + + +

А. івгісвосапші

Бурятия, окр. сев.-вост. побережье оз. Байкал, с. Турки, пески | + | + | + | + | | |

А. frigidus зиЬзр. .івсипиші

Читинская обл., Кыринский р-н, дол. р. Агуцы, прибрежные заросли кустарника + + + + +

Иркутская обл., окр. с. Бажеевское, заросли кустарников + + + + +

Бурятия, сев.-вост. побережье оз. Байкал, долина Бол. Речки, пихтач с тополем на низкой террасе + + + + +

A. frigidus s. str.

Горный Алтай, Улаганский р-н, окр. п. Язула, елово-кедрово-лиственничный лес + + + + +

Горный Алтай, Улаганский р-н, ниж. теч. р. Башкаус, по берегам реки Кара-су + + + + +

Бурятия, сев.-зап. побережье оз. Байкал, мыс Покойники + + + + +

А. .іагаїепііі

Восточный Саян (Центральная часть), истоки р. Сигач, альпийский луг | | + | + | +1 + | + |

А. итЬеІШиі

Таймырский автономный округ, р. Сындаско, склон к заливу |+ | + | + |+ | + | + | +

флавонолового состава A. membranaceus, A. propinquus и А. mongholicus -гликозиды кверцетина 4, б и 10. Разные вещества представлены гликоздами рамноцитрина 0, изорамнетина 1 и 2 в A. membranaceus, гликозидами рамноцитрина 2 и изорамнетина 3 в A. propinquus и гликозидами: изорамнетина и кверцетина IV в А. mongholicus.

У обоих подвидов A. frigidus идентифицированы по 3 общих гликозида кверцетина (рис. 2).

Изучая гликозидный состав видов в разных ценопопуляциях, обнаружили, что межпопуляционная изменчивость прослеживается более всего в количественном соотношении компонентов гликозидного комплекса. Различия в качественном составе гликозидов листьев растений из разных частей ареала незначительны, и происходят, в основном, за счет минорных компонентов (Сиднева, 2004б). Таким образом, нами были получены типичные для каждого вида “флавоноидные профили” гликозидов (рис. 2).

Виды комплекса A. membranaceus, А. mongholicus и A. propinquus в общих чертах характеризуются сходными типичными гликозидными профилями. Однако различия в компонентном составе достаточно стабильные и могут служить основой для биохимической дифференциации этих таксонов. Более четкие отличия по гликозидам флавоноидов этих трех видов наблюдали у А. mongholicus. Гликозидный состав А. sericeocanus (подсекция Semilunaria) имеет сходство с типичными профилями видов своей подсекции, но в этом виде присутствует компонент (А), обнаруженный в подсекции Elliptica. По гликозидным профилям A. frigidus s. str. и A. frigidus subsp. secundus не выявлено такой четкой дифференциации, как у спорных таксонов подсекции Semilunaria. Их типичные флаво-ноидные профили близки и отличаются лишь по одному компоненту. Отличия профилей двух подвидов A. frigidus от профилей видов подсекции Semilunaria значительны, так же как и от видов A. umbellatus и А. saralensis своей подсекции. Гликозидный состав A. umbellatus, как и агликоновый, отличается самым большим набором компонентов.

Таким образом, в результате качественного анализа были получены данные по агликоновому и гликозидному составу флавоноидов восьми видов секции Cenantrum. Одинаковый состав агликонов видов подсекции Semilunaria подтверждает их близкое родство. A. frigidus s. str., A. frigidus subsp. secundus, А. saralensis и A. umbellatus подсекции Elliptica, находящиеся в более отдалённом родстве с видами подсекции Semilunaria, характеризуются отличающимся агли-коновым составом.

Выражением различий между изученными видами являются типичные гликозидные “флавоноидные профили”. У комплекса видов A. membranaceus, А. mongholicus и A. propinquus обнаружен видоспецифичный для каждого таксона “флавоноидный профиль”. При исследовании A. frigidus s. str. и A. frigidus subsp. secundus не наблюдали таких четких различий.

В изученных видах рода Astragalus агликоны флавоноидов могут быть хемотаксономическими маркёрами на уровне более высоких таксономических

Рис. 2. Типичные гликозидные профили видов секции Cenantrum Koch рода Astragalus L.

ТУ

AA'tnigahss tetraleasis

TT

Astragalus илиJteHatux

Гликшиды:

рамнипи1тринл ^5 тетьерпетина Окончание рис. 2.

недрам истина не идентифицирован лив

рангов, чем вид, а гликозидный состав флавоноидов видоспецифичен.

Выражаем благодарность зав. лаборатории Гербарий ЦСБС СО РАН к.б.н. Д.Н. Шауло за любезно предоставленный гербарный материал.

ЛИТЕРАТУРА

Блинова К. Ф., Баланкова Л.Г. К фитохимическому изучению некоторых представителей рода астрагал - Astragalus L. // Вопросы фармакогнозии, 1968. - Т. 26. Вып. 5. - С. 113-123.

ВысочинаГ.И. Исследование флавоноидов горца горного {Polygonum alpinum All.) // Полезные растения природной флоры Сибири. - Новосибирск: Наука, 1967. - С. 146-153.

Выдрина С.Н. Astragalus L. - Астрагал // Флора Сибири. - Т. 9. - Новосибирск: Наука, 1994. - С. 29-32.

ГончаровН.Ф., Борисова А.Г. Род Астрагал -Astragalus L. // Флора СССР. - Т. 12. -М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1946. - С. 32-38.

ДунгэрдоржД. Изучение флавоноидных соединений некоторых видов рода астрагал (Astragalus L.), применяемых в народной медицине Монголии. Автореф. дисс. ... канд. фармацевтических наук. - М., 1978. - 23 с.

Кадырова Р.Б. Флавоноидный состав некоторых сибирских видов Astragalus L. // Раст. ресурсы, 1989. - Т. 25. Вып. 4. - С. 552-557.

Киселёва А.В., Волхонская Т.А., Киселёв В.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений Южной Сибири. - Новосибирск: Наука, 1991. - 136 с.

Клышев Л.К., Бандюкова В.А., Алюкина Л. С. Флавоноиды растений (распростра-

нение, физико-химические свойства, методы исследования). - Алма-Ата: Наука КазССР, 1978. - 220 с.

Комиссаренко Н. Ф., Полякова Л.В. Флавоноиды Astragalus adsurgens // Химия прир. соед., 1987. - Вып. 2. - С. 302-304.

Крылов П.Н. Флора Западной Сибири. - Вып. VII. - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1933. - С. 1449-1817

Макбуль М.А. Фармакогностическое изучение некоторых видов астрагалов, произрастающих в Забайкалье. Автореф. дисс. ... канд. фармацевтических наук. - Л., 1980. - 20 с.

Никифорова О.Д. Семейство Fabaceae, или Leguminosae - Бобовые // Конспект Флоры Сибири: Сосудистые растения. - Новосибирск: Наука, 2005. - С. 135-156.

Павлова Н.С. Бобовые - Fabaceaе // Сосудистые растения советского Дальнего Востока. - Т. 4. - Л.: Наука, 1989. - 390 с.

Павлова Н.С. Хемосистематика Astragalus L. и Hedysarum L. (сем. Бобовые) Дальнего Востока // Хемосистематика и эволюционная биохимия высших растений: Тез. докл. I Всесоюзного совещания. - М., 1979. - С. 54-55.

Пешкова Г.А. Семейство Fabacea, или Leguminosae - Бобовые // Флора Центральной Сибири. - Т. 2. - Новосибирск: Наука, 1979. - С. 585-639.

Положий А.В. Флорогенетический анализ среднесибирских астрагалов // Известия томск. отд. Всесоюзн. бот. об.-ва. - Красноярск, 1964. - Т. 5. - С. 61-75.

ПоповМ.Г. Список растений Гербария флоры СССР. - М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1955. -Т. 13. - С. 21.

Савоськин И.П., Кадырова Р.Б., Гаврилюк И.П. Родственные отношения у астрагалов (Astragalus L.) по данным иммунохимии // Хемосистематика и эволюционная биохимия высших растений: Тез. докл. II Всесоюзного совещания. - М., 1982. - С. 88-90.

Сиднева О.В. Состав и содержание флавоноидов в надземной части Astragalus membranaceus (Fischer) Bunge, произрастающего в Восточном Забайкалье // Флора и растительность Даурии: Исследования и охрана. - Чита: Изд-во ЗабГПУ 2004а. - С. 73-86.

Сиднева О.В. Биохимические аспекты популяционного разнообразия представителей секции Cenantrum Koch рода Astragalus L. (Fabaceae) // Проблемы сохранения разнообразия растительного покрова Внутренней Азии: Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием. - Часть 1. - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2004б. - С. 88-90.

Сытин А.К. О полиморфизме, дискретности и критериях вида у астрагалов (Astragalus, Fabaceae) // Биологическое разнообразие: подходы к изучению и сохранению: Материалы конференций БИН РАН и ЗИН РАН. - С-Пб., 1992. - С. 123-131.

Lin L.-Z., HeX.-G., Lindenmaier M., Nolan G., Yang J., Cleary M., Qiu S.-X., Cordell A. G. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry study of the flavonoids of the roots of Astragalus mongholicus and A. membranaceus // Journal of Chromatography, 2000. - Vol. 876. - P. 87-95.

Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoid. -Berlin, Heidelberg, New York, 1970. - 345 p.

Song Ch., Zheng Zh., Liu D., Hu Zh. Antimicrobial isoflavans from Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge // Zhiwu Xuebao, 1997а. - Vol. 39. N 5. - P. 486-488.

Song Ch., Zheng Zh., Liu D., Hu Zh., Sheng W. Ptepocarpans and isoflavans from Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge // Zhiwu Xuebao, 1997b. - Vol. 39. N 12. - P. 1169-1171.

Tian Zh., Ma Y., Meng R., Li B. Quantitative determinatian of flavonoids in the stalk and leaves of Astragalus membranaceus bu TLS // Shenyang Yaoxucyuan Xuebao, 1993. - Vol. 10.

N 1. - P. 24.

Yakovlev G.P., Sytin A.K., Roskov Yu.R. Legumes of Northern Eurasia. - Kew, 199б. - P. 97-2б8.

SUMMARY

Aglycon and glycoside composition of Siberian representatives of Astragalus L. sect. Cenantrum Koch (A. frigidus (L). A. Gray, A. frigidus subsp. secundus (DC.) Worosch., A. sara-lensis Gontsch., A. umbellatus Bunge, A. membranaceus (Fischer) Bunge, A. propinquus Schischk., A. mongholicus Bunge, A. sericeocanus Gontsch.) is studied. Qualitative analysis of the investigated species has shown, that flavonoids aglycons of plants can be chemotaxo-nomic markers at a level of subsections, and glycosides - at a level of species. Some components of aglycon structure are identified. Typical “flavonoids profiles” are revealed for each species which are qualitative characteristics of glycoside composition specific for each taxa.

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск

Получено 01.12.2005 г.