CC BY
60
УДК 615.322:582.287.237
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ. X. ПРОТЕОЛИЗ ВОДНОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЧАГИ ФЕРМЕНТАМИ ЖЕЛУДОЧНОКИШЕЧНОГО ТРАКТА
© М.А. Сысоева1, Е.В. Сысоева1, В.Р. Хабибрахманова1, В. С. Гамаюрова1, Л.А. Кудрявцева2
1 Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса, 68, Казань, Республика Татарстан, 420015 (Россия) E-mail: [email protected] 2Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра РАН, ул. Арбузова, 8, Казань, Республика Татарстан, 420083 (Россия)
Статья посвящена исследованию протеолиза водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта. Протекание протеолиза подтверждено качественно и количественно по накоплению продуктов реакции в гидролизатах различными физико-химическими методами. Определены оптимальные время проведения реакции и концентрации ферментных препаратов. После проведения гидролиза водной вытяжки чаги ферментами желудочно-кишечного тракта размер мицелл полифенолоксикарбонового комплекса становится в три раза меньше по сравнению с размером мицелл этого комплекса в водном извлечении чаги.
Ключевые слова: чага, водная вытяжка, протеолиз, хроматография, электропроводность, фотонно-корреляционная спектроскопия (ФКС).
Введение
Водные извлечения чаги широко применяются в народной и официнальной медицине для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и рака различной этиологии [1, 2], поэтому изучение изменений, происходящих с водным извлечением в условиях желудочно-кишечного тракта, - актуальная задача исследования.
Водные извлечения чаги представляют собой коллоидную систему дисперсной фазы, которой является полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК). ПФК - это сложно организованный ассоциат, в состав которого входят полимерные и мономерные соединения различной химической природы, а также зольные элементы. ПФК относят к гуминоподобным веществам [3].
Известно, что стерильная форма гриба Inonotus obliquus - чага, в отличие от многих других трутовых грибов, накапливает мало белка, около 2,56% от абсолютно сухого веса гриба [4]. Содержание аминокислот в ПФК составляет 45,6% от условного протеина комплекса (2,5%) [5]. Это свидетельствует о том, что часть белка находится в связанном с ПФК состоянии.
Под действием протеаз желудочного сока и сока поджелудочной железы белок водного извлечения чаги может подвергаться гидролизу. Причем эффективность протекания этого процесса будет определяться как создаваемыми условиями, так и доступностью белка к действию протеаз.
Цель исследования - разработка методики проведения протеолиза водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта в лабораторных условиях для определения возможности протекания этого процесса в организме человека.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Для получения водных извлечений чаги использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети. Поставщик ЗАО «Фирма Здоровье» (серия 020605, 2005 г., Московская область, Красногорский район).
Вытяжки получали согласно методике [6]. Для проведения протеолиза использованы ферментные препараты:
- сок желудочный натуральный «эквин». Включает все ферменты желудочного сока, содержание свободной соляной кислоты составляет 0,07-0,25%, общая кислотность - 0,1-0,3%, рН - 1,30-1,95. Производитель ФГУП НПО «Микроген»;
- энзистал. В каждой таблетке содержится панкреатина 192 мг (что соответствует 6000 Ед. МФФ липазы, 4500 Ед. МФФ амилазы, 300 Ед. МФФ протеазы), гемицеллюлазы 50 мг, экстракта бычьей желчи 25 мг. Производитель «ТОРРЕНТ ФАРМАСЬЮТИКАЛС ЛТД», Индия.
Массовую долю сырого протеина определяли по [7]. Белок определяли по методу Флореса [8]. Количество аминокислот определяли нингидриновым методом [9]. Бумажную хроматографию осуществляли в системе растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4 : 1 : 5), проявитель 2% раствор нингидрина в бутаноле [10]. При тонкослойной хроматографии (ТСХ) использовали три системы растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (8 : 2 : 2), н-пропанол - гидроксид аммония (7 : 3) [11], пиридин -изоамиловый спирт - вода (4 : 1 : 1) [12], проявитель - 0,2% раствор нингидрина в бутаноле.
Удельную электропроводность растворов определяли на кондуктометре «Эксперт-002».
Светорассеяние частиц коллоидных систем изучали на фотонном корреляционном спектрометре динамического и статического рассеяния света PhotoCor Complex. Источником лазерного излучения служил He-Ne газовый лазер мощностью 10 мВт и длиной волны 633 нм. Анализ сигналов осуществляли одноплатным многоканальным коррелятором, сопряженным с компьютером. Эффективный гидродинамический радиус (Яэфф) агрегатов рассчитывали из коэффициентов диффузии по уравнению Стокса-Энштейна для сферических частиц одинакового размера [13]. Диапазон измерений составляет от 2 нм до нескольких микрометров, погрешность измерения - до 5%. Большее время накопления сигнала (600 сек) при анализе размеров частиц исследуемого объекта позволяет уменьшить погрешность опыта до 1%.
Обсуждение результатов
Для разработки методики по проведению протеолиза водного извлечения чаги ферментами желудочнокишечного тракта необходимо выяснить общее содержание белка, которое переходит в состав водного извлечения чаги и определить, какая его часть находится в связанном с ПФК состоянии. Массовая доля сырого протеина в водном извлечении чаги составляет 2,772% от сухого остатка водного извлечения чаги. Содержание белка в водном извлечении чаги, определенное по методу Флореса, составило 1,32% от сухих веществ водного извлечения чаги. Его содержание в фильтрате после осаждения ПФК составляет 0,14%. Следовательно, основная часть белка водного извлечения чаги находится в связанном с ПФК состоянии. Поэтому его доступность для действия протеаз желудочно-кишечного тракта может быть ограничена.
При попадании в желудок водное извлечение чаги поступает в среду с рН 1-3,5, при этом in vivo наблюдается седиментация дисперсной фазы изучаемой коллоидной системы. В желудке (рН~2) белки гидролизуются ферментами желудочного сока до пептидов. Необходимо подтвердить способность пепсинов желудочного сока проводить протеолиз белков водного извлечения чаги. Переход содержимого желудка в двенадцатиперстную кишку приводит к изменению рН до 7,8, при этом ПФК должен переходить в растворенное состояние. Это должно облегчить протекание протеолиза ферментами поджелудочной железы. Нами был использован ферментный препарат «энзистал», содержащий протеазы сока поджелудочной железы, такие как трипсин, химтрипсин, эластаза, карбоксилаза А и В.
Исследование процесса протеолиза водного извлечения чаги осложняется присутствием в нем хромогенов.
Применяемые ферментные препараты могут вносить погрешность в получаемые результаты из-за содержания в них как белка, так и аминокислот. Для получения достоверных результатов по накоплению продуктов протеолиза в гидролизатах водного извлечения чаги, при применении физико-химических методов, отдельно исследованы препараты «сок желудочный» и «энзистал».
В разработанной нами методике протеолиза ферментами желудочно-кишечного тракта белков, входящих в состав водного извлечения чаги, созданы условия (рН и температура), соответствующие протеканию этого процесса в организме человека. Гидролиз проводили последовательно в две стадии.
На первой стадии к водному извлечению чаги добавляли препарат «сок желудочный» и проводили протеолиз. Варьировали время проведения процесса - 20, 40, 60, 90 и 120 мин. Анализ полученных гидролизатов проводили с помощью бумажной хроматографии по накоплению в них образующихся в результате протеолиза пептидов. Пептиды проявляются в виде сине-фиолетовых пятен, расположенных близко к точкам нанесения образцов. Найдено, что оптимальное время протеолиза на этой стадии - 90 мин. Затем, изменяли концентрацию ферментного препарата, применяя различные соотношения водного извлечения чаги и препарата «сок желудочный» - 1 : 0,01; 1 : 0,1; 1 : 0,5; 1 : 1; 1 : 1,5. С помощью бумажной хроматографии определено, что оптимальным является соотношение водное извлечение чаги : препарат «сок желудочный» - 1 : 1.
На второй стадии протеолиза к гидролизату водного извлечения чаги, полученного в оптимальных условиях (время проведения первой стадии - 90 мин, соотношение водное извлечение чаги : препарат «сок желудочный» - 1 : 1), добавляли препарат «энзистал». Варьировали время проведения процесса - 60, 90, 120, 160, 180, 240 мин. Анализ полученных гидролизатов проводили с помощью бумажной хроматографии по накоплению в них образующихся в результате протеолиза аминокислот. Определили, что оптимальное время протеолиза на этой стадии - 160 мин. Затем изменяли концентрацию ферментного препарата, применяя различные концентрации препарата «энзистал» - 2, 4, 8, 16, 32, 64 мг/мл. Также с помощью бумажной хроматографии определили, что оптимальной является концентрация препарата «энзистал» - 32 мг/мл.
Для подтверждения и уточнения полученных результатов анализ гидролизатов был проведен другими физико-химическими методами.
Использовали метод ТСХ, который обладает высокой чувствительностью по сравнению с бумажной хроматографией, дает менее размытые пятна из-за более медленной диффузии вещества по хроматограмме [14].
Были использованы три различных системы проявителей для проведения ТСХ. Системы растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (8 : 2 : 2) и н-пропанол - гидроксид аммония (7 : 3) являются универсальными, т.е. в них проявляются большинство аминокислот [11]. Наиболее часто используют систему растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (8 : 2 : 2). Однако проявление хроматограмм в этой системе растворителей дает нечеткое разделение пятен на хроматограммах.
Применение системы растворителей н-пропанол - гидроксид аммония (7 : 3) для проявления хроматограмм позволило получить лучшее разделение пятен на хроматограммах. Систему проявителей пиридин - изоамило-вый спирт - вода (4 : 1 : 1) используют для разделения а-аминомасляной кислоты, треонина, а-аланина, серина и глутаминовой кислоты [12]. На хроматограммах наблюдалось высвобождение глутаминовой кислоты по ходу протекания гидролиза.
Все полученные с помощью ТСХ результаты подтверждают то, что к 250 мин (4 ч 10 мин) проведения гидролиза водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта в гидролизате накапливается максимальное количество аминокислот.
Для количественной оценки протеолиза водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта гидролизаты проанализированы по накоплению в них аминокислот с помощью нингидринового метода. Результаты представлены в таблице 1.
Содержание аминокислот в гидролизатах возрастает уже при 190 мин проведения протеолиза. Оптимум накопления аминокислот в гидролизате также регистрируется при 250 мин проведения гидролиза.
Таблица 1. Концентрация аминокислот в исследуемых объектах
Объект исследования Время проведения гидролиза, мин Концентрация аминокислот, мкг/мл
«соком желудочным» «энзисталом» суммарное время
Водное извлечение чаги - - - 8,46
Препарат «сок желудочный» - - - 9,69
Препарат «энзистал» - - - 31,80
Гидролизат 90 0* 90 50,08
Гидролизат 90 100 190 68,92
Гидролизат 90 120 210 71,92
Гидролизат 90 160 250 74,79
Гидролизат 90 180 270 67,15
Примечание: * сразу после внесения в гидролизат препарата «энзистал».
Поскольку водное извлечение чаги имеет в своем составе природные хромогены, то применение для анализа спектральных методов часто затруднено из-за изменения окраски цветных комплексов, используемых для колориметрии анализируемых объектов. Проведено сравнение результатов анализа водных извлечений чаги и гидролизатов на содержание белка по Бенедикту и Флоресу [8]. При применении первого метода проведение реакции образования комплекса белка с сульфатом меди сопровождается изменением окраски исследованных объектов из-за присутствия в них хромогенов. Результаты, полученные при применении метода Флореса, дают более реальные значения содержания белка по сравнению с методом определения сырого протеина. Метод Флореса использован для оценки динамики протекания протеолиза. Полученные результаты приведены в таблице 2.
При гидролизе желудочным соком концентрация белка не изменяется, что объясняется особенностью пепсина расщеплять белки до крупных пептидов, регистрируемых этим методом как белки. Далее при проведении последующего гидролиза препаратом «энзистал» наблюдается существенное уменьшение количества белка в гидролизате. Уже после 190 мин гидролиза 87,1% белка водного извлечения чаги расщепляется. Оптимум времени протекания протеолиза, полученный с помощью бумажной хроматографии, подтверждается и составляет 250 мин.
Для оценки изменений, происходящих в коллоидной системе полученного при оптимальных условиях гидролизата со снижением в ней содержания ПФК, определена электропроводность образцов, получаемых при разбавлении гидролизата. При анализе зависимости электропроводности от концентрации ПФК были обнаружены 3 точки перелома, соответствующие критическим константам мицеллообразования (ККМ). Согласно литературным данным [15], наличие таких точек на кривой свидетельствует об изменении конфор-мационной структуры коллоидной системы. В коллоидной системе гидролизата в ККМ должны происходить изменения, сопровождающиеся процессами ассоциации или диссоциации частиц дисперсной фазы. ККМ исследуемых объектов представлены в таблице 3.
ККМ гидролизата и водного извлечения чаги существенно различаются, что свидетельствует об отличии коллоидной системы гидролизата, по сравнению с водным извлечением чаги.
Для анализа методом фотонно-корреляционной спектроскопии (ФКС) выбраны гидролизаты с концентрацией ПФК, соответствующие концентрациям до и после ККМ.
Как показано на рисунке, в исследуемых объектах происходит изменение содержания частиц дисперсной фазы и их размеров. При разбавлении в водном извлечении чаги и гидролизате в некоторых диапазонах концентрации ПФК происходит отделение от крупных мицелл мелких частиц, достаточно близких по размеру. При этом в сравниваемых объектах дезагрегация и агрегация частиц дисперсной фазы протекает различно.
В водном извлечении чаги наблюдается дезинтеграция частиц дисперсной фазы при концентрации ПФК, равной 1,08 мг/мл. Также происходит незначительное увеличение размера крупных частиц ПФК при концентрации ПФК, равной 0,03мг/мл, происходящее, вероятно, за счет ассимиляции отделившихся мелких частиц (рис.). В среднем мицеллы ПФК водного извлечения чаги имеют радиус 148-160 нм, кроме того в нем содержатся частицы с радиусом около 30 нм, 13 нм и еще более мелкие частицы.
Таблица 2. Концентрация белка в исследуемых объектах
Время проведения гидролиза, мин Концентрация белка, %***
«соком желудочным» «энзисталом» суммарное время
0* - - 0,76
90 - 90 0,72
90 0** 90 0,96
90 100 190 0,17
90 120 210 0,16
90 160 250 0,14
90 180 270 0,19
Примечание: * сразу после внесения в водное извлечение чаги препарата «сок желудочный»; ** сразу после внесения в гидролизат препарата «энзистал»; *** от сухих веществ водного извлечения чаги.
А
Содержание ПФК (по оси абсцисс): 1 - 0,0028; 2 - 0,0053; 3 - 0,03; 4 - 1,08; 5 - 8,7 мг/мл Б
Содержание частиц, %
60 -40 20
1
ь
V (178 )
$ » м ,
Содержание ПФК
Содержание ПФК (по оси абсцисс): 1 - 0,013; 2 - 0,2; 3 - 6,52 мг/мл
Эффективный радиус (нм) частиц дисперсной фазы коллоидной системы водного извлечения чаги (А), и в гидролизате (Б)
В гидролизате с концентрацией ПФК 6,52 мг/мл наблюдаются крупные частицы с радиусом, превышающим радиус частиц дисперсной фазы водного извлечения чаги. Это, вероятно, связано с тем, что в гидролизате с высоким содержанием ПФК преобладают процессы ассоциации. Этому может способствовать высокое содержание аминокислот, накапливающихся в процессе проведенного гидролиза. За счет высоких гидрофильных свойств этих соединений они могут ассоциироваться с мицеллами ПФК, придавая устойчивость как крупным, так и мелким частицам, отнесенным ранее к субмицеллам ПФК [15]. При более низких концентрациях ПФК в гидролизате преобладают процессы дезинтеграции. Повышается устойчивость частиц дисперсной фазы с радиусом около 50 нм. Меньшие размеры мицелл ПФК в гидролизате по сравнению с их размерами в водном извлечении чаги могут свидетельствовать о том, что смоделированный нами процесс, происходящий в желудочно-кишечном тракте человека, с водным извлечением чаги повышает биодоступность сложного ассоциата ПФК, обеспечивая его усвоение и терапевтическую активность.
Согласно литературным [4, 16], а также полученным нами данным, в коллоидной системе водного извлечения чаги белок присутствует как в дисперсной фазе (в ПФК), так и в дисперсной среде. Уменьшение размеров частиц дисперсной фазы в гидролизате по сравнению с их размерами в водном извлечении чаги свидетельствует о том, что белок, встроенный в структуру ПФК, также подвергается гидролизу.
Таблица 3. Значения критических констант мицеллообразования гидролизата и водного извлечения чаги
Объекты исследования ККМЬ мг ПФК/мл ККМ2, мг ПФК/мл ККМ3, мг ПФК/мл
Гидролизат 0,1 0,81 3,23
Водное извлечение чаги 0,0093 0,075 2,170
С точки зрения физиологии пищеварения, пища в зависимости от ее состава находится в желудке в среднем 1,5-8 ч, а проходит по тонкому кишечнику примерно за 3-5 ч [17]. Концентрация протеаз в соответствующих отделах желудочно-кишечного тракта находится на уровне примененной в разработанной методике проведения протеолиза водного извлечения чаги. Поэтому найденные нами оптимальные условия смоделированного протеолиза водных вытяжек чаги in vivo укладываются в физиологические нормы.
Выводы
1. Разработана методика проведения протеолиза водного извлечения чаги ферментами желудочнокишечного тракта.
2. Определены размеры дисперсной фазы коллоидной системы гидролизата водной вытяжки чаги. Установлено, что после гидролиза водной вытяжки чаги ферментами желудочно-кишечного тракта размер мицелл полифенолоксикарбонового комплекса становится в три раза меньше, по сравнению с размером мицелл водного извлечения чаги.
3. Показана возможность протеолиза водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта in vivo. Список литературы
1. Якимов П. А., Андреева С.М. Общая биологическая и химическая характеристика чаги как исходного сырья для получения лечебных препаратов // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 36-49.
2. Рыжова Г. Л., Кравцова С.С., Матасова С .А., Грибель Н.В. и др. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44-47.
3. Шиврина А.Н. Гуминоподобные соединения, образуемые древоразрушаемыми грибами // Биологически активные вещества высших грибов. М.; Л., 1965. С. 82-199.
4. Платонова Е.Г. О содержании белка в плодовых телах древоразрушающих грибов // Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства. М.; Л., 1965. С. 55-57.
5. Шиврина А.Н., Маслова Р. А. Аминокислотный состав гуминоподобных веществ, образуемых некоторыми древоразрушающими грибами // Почвоведение. 1963. №11. С. 63-67.
6. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-179.
7. ГОСТ 13496.4 - 93
8. Государственная фармакопея СССР: Вып.2: Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е
изд., доп. М., 1990. 400 с.
9. Луценко Н.Г., Ким В.Е, Самуйлова Л.В., Кутькова О.Н. и др. Практикум по технологии косметических средств.
Биологически активные вещества в косметике. М., 2004. 160 с.
10. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., 1985. 536 с.
11. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М., 1965. 521 с.
12. Починок Х.И. Методы биохимического анализа растений. М., 1976. 245 с.
13. Zakharova L.Ya., Ibragimova A.R., Kudryavtseva L.A. Nanosized reactors based on polyethylene imines: from micro-heterogeneous systems to immobilized catalysts // Langmuir. 2007. №23. Р. 3214-3224.
14. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. М., 1981. 382 с.
Поступило в редакцию 16 июля 2007 г.
После переработки 14 апреля 2008 г.
