CC BY
101
Е. В. Сысоева, М. А. Сысоева, В. С. Гамаюрова,
Д. И. Вахитова
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ
ХУ. ПРОТЕОЛИЗ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ,
ПОЛУЧЕННЫХ С ПРИМЕНЕНИЕМ СВЧ
Ключевые слова: экстракция чаги с применением СВЧ, водные извлечения чаги, протеолиз ферментами желудочно-кишечного тракта, безопасность водных извлечений.
Проведен гидролиз водных извлечений чаги, полученных с применением в экстракции СВЧ, ферментами желудочно-кишечного тракта, в условиях близких к физиологическим. На основании полученных результатов выбран оптимальный способ экстракции чаги с использованием СВЧ.
Key word: extraction of chaga with SHF processing, proteolysis by ferments of gastrointestinal
tract, safety of chaga water extracts.
For selection the safe conditions of power SHF in extraction of chaga the comparison of the water extracts, received by maceration with SHF processing and water extracts, received by remaceration, the traditional technology was organized.
Such proof is necessary because melanin of chaga have the size close to nanosiz-erange. Proteolysis of these water extracts by ferments of gastrointestinal tract in conditions close to physiological was conducted. For reasons given by received results was shown, that extract of chaga is able to be an applying in conditions of SHF processing at 180W.
Водные извлечения чаги, полученные различными способами экстракции, отличаются по физико-химическим показателям, структуре и свойствам выделенных из них меланинов [1-3]. Это объясняется сложной организацией самих полидисперсных коллоидных систем водных извлечений чаги и её дисперсной фазы - меланина чаги [4,5]. Меланин чаги представляет собой частицу диаметром от 100нм до 400нм, которая организована из более мелких включений, называемых в литературе агрегатами и субагрегатами [6-8]. Её пигментная часть тесно связана с белками и полисахаридами [9]. Размер частицы меланина, близкий к наноразмерному диапазону, и укладка компонентов в её составе, происходящая в этом диапазоне, при изменении условий экстракции чаги, существенно изменяет её физико-химические свойства [5].Кроме этого могут изменяться биодоступность частицы и её токсичность.
Экстракция сырья традиционными способами, это длительный процесс, занимающий 10 и более часов. Для его интенсификации применена стадия СВЧ обработки, которая сократила получение водного извлечения в три с половиной раза [10]. Воздействие микроволнового излучения СВЧ на меланины чаги может существенно изменять белки, которые ассоциированы с частицей меланина. Разработанная ранее методика по проведению протеолиза водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта [11] позволит изучить изменения, происходящие с коллоидными системами и меланинами, получен-
ными с применением СВЧ обработки, в условиях близких к физиологическим, и дать ответ о безопасности применения этого метода экстракции.
Целью исследования является выбор режима СВЧ обработки, применяемого в экстракции чаги, позволяющего получить безопасное водное извлечение и меланин чаги с физико-химическими характеристиками, наиболее близкими к характеристикам водного извлечения и меланину чаги, полученных по традиционной технологии.
Экспериментальная часть
Сырье чаги, использованное для проведения исследований, закуплено в аптечной сети. Производитель, партия, дата выпуска сырья - ОАО «Красногорсклексредства», Серия 6 1208, 2008 г. Ферментные препараты: «Ацидин - пепсин », Производитель: ОАО «Белмедпрепараты», республика Беларусь. «Энзистал» Производитель: ТОРРЕНТ ФАРМАСЬЮТИКАЛС ЛТД., Индия.
Водные извлечения чаги получены ремацерацией по [12], мацерацией с СВЧ обработкой по [10]. Протеолиз водных извлечений чаги проведён по методике [11]. Определение содержания меланина проведено по [13], сухого остатка и зольности по [14]. Определение размера частиц Светорассеяние частиц коллоидных систем изучали на фотонном корреляционном спектрометре динамического и статического рассеяния света PhotoCor Complex. Источником лазерного излучения служил He-Ne газовый лазер мощностью 10 мВт и длиной волны 633 нм. Анализ сигналов осуществляли одноплатным многоканальным коррелятором, сопряженным с компьютером. Эффективный гидродинамический радиус(РЭфф) частиц рассчитан из коэффициентов диффузии по уравнению Стокса-Энштейна для сферических частиц одинакового размера [15]. Антиоксидантную активность жидких образцов и меланинов определяли с помощью кулонометрического метода, основанного на взаимодействии водных экстрактов и растворов с электрогенерированными соединениями брома [16]. Токсичность водных извлечений и гидролизатов определена в Региональном центре государственного контроля качества лекарств ИОФХ им. А.Е. Арбузова на мышах по [17].
Результаты и их обсуждение
Исходные характеристики водных извлечений и меланинов чаги, полученных по традиционной технологии ремацерацией и мацерацией с применением трёх режимов СВЧ обработки, приведены в таблице 1. Водные извлечения, полученные мацерацией с применением всех трех режимов, близки по физико-химическим свойствам и антиокси-дантной активности. При этом наиболее близкие значения приведённых характеристик к водному извлечению, полученному методом ремацерации, имеет водное извлечение, полученное с применением СВЧ - обработки с режимом 180вт. Согласно данным таблицы 1, у меланинов водных извлечений, полученных методом мацерации с СВЧ - обработкой, значения антиоксидантной активности выше, по сравнению со значением меланина водного извлечения, полученного методом ремацерации. Это может свидетельствовать об отличии в их структурной организации.
Для более детального изучения водных извлечений, подтверждения схожести их структурной организации и безопасности их применения был проведен гидролиз водных извлечений ферментами желудочно-кишечного тракта [11]. Протекание гидролиза водных извлечений чаги оценивали по накоплению продуктов гидролиза - пептидов и аминокислот, методом бумажной хроматографии, а также по убыванию содержания белка в изучаемых объектах исследования [11]. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 1 - Физико-химические свойства водных извлечений и меланинов чаги, полученных различными способами экстракции
Способ получения водного извлечения чаги Масса сухого остатка, г Золь- ность, г Масса меланина, % Коли- чество белка, мг/мл АОЕ * водного извлечения чаги, Кл/мл АОЕ, кКл/100г меланина
Ремацерация (контроль) 1,3791 0,3279 7,66 0,1344 3,70±0,2 37,0±2,0
Мощность СВЧ -90 вт 1,1550 0,2960 6,45 0,0665 3,38±0,06 43,0±1,0
Мощность СВЧ -180 вт 1,3250 0,3275 7,64 0,0824 3,52±0,07 48,2±0,9
Мощность СВЧ -360 вт 1,1850 0,3050 6,82 0,0785 2,80 ±0,04 49,0±1,0
Примечание: АОЕ - антиоксидантная ёмкость.
Таблица 2 - Физико-химические характеристики гидролизатов водных извлечений чаги
Способ получения водного извлечения чаги Характеристики гидролизата Концентрация белка*, мг/мл Глубина протекания гидролиза, %
Масса сухого остатка, г Масса меланина, % Исходная Итоговая
Ремацерация 0,1344 2,870 0,0808 0,0351 56,6%
Мацерция, режим СВЧ - обработки 90 вт 0,0635 1,728 0,0554 0,0421 25,6%
180 вт 0,0809 3,168 0,0742 0,0329 56,6%
360 вт 0,0779 2,472 0,0652 0,0423 35,1%
Примечание: *- при протекании гидролиза.
Наиболее близки по глубине протекания гидролиза водные извлечения, полученные ремацерацией и мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180вт. Это может свидетельствовать о близости структурной организации этих коллоидных систем. Для подтверждения этого предположения были определены размеры частиц меланинов и антиоксидантная активность водных извлечений чаги и гидролизатов, которые приведены в таблице 3. Водные извлечения чаги, полученные разными способами экстракции, существенно отличаются размерами частиц дисперсных фаз.
Способ получения водного извлечения чаги Водные извлечения чаги Гидролизат
Содер- жание частиц, % Эффек- тивный радиус частиц, нм Содержание частиц, % Эффек- тивный радиус частиц, нм АОЕ*, Кл/мл
Ремацерация 85,3 161,1 92,4 117,1 5,10±0,04
Мацерация, режим СВЧ - обработки 90 вт 77,4 89,82 88,2 123,4 3,21±0,07
180 вт 76,3 104,1 52,1 115,5 5,70±0,10
360 вт 79,0 136,7 89,2 122,8 4,71±0,07
Примечание: *- получены с учётом разведения.
После проведения гидролиза извлечений, частицы меланинов в них меньше отличаются по размерам между собой. Следует отметить, что размеры меланинов, выделенных из извлечений, полученных мацерацией с СВЧ обработкой в режимах 90вт и 180вт, меньше по сравнению с меланином, выделенным из извлечения, полученного с помощью ремацерации. В физиологических условиях можно ожидать повышения их биодоступности. Однако, гидролизаты извлечений, полученных ремацерацией и мацерацией с СВЧ обработкой в режиме 180 вт, практически не отличаются по размеру частиц и обладают близкой антиоксидантной активностью. Согласно электронной микроскопии меланина чаги, пигменты этой частицы окружены белково-полисахаридным матриксом [18]. В результате гидролиза происходит разрушение белков, находящихся в дисперсионной среде, а также ассоциированных с частицей меланина. Накопление в дисперсионной среде пептидов малой молекулярной массы и аминокислот приводит к изменению агрегационных и дезагри-гационных взаимодействий частиц меланина. Это отражается в изменении их размеров (табл. 3), а также на антиоксидантной активности гидролизатов. Она увеличивается по сравнению с водными извлечениями, взятыми для проведения гидролиза (таблица 2). Гидролизаты с меньшими частицами меланинов проявляют антиоксидантную активность в полтора раза выше, чем соответствующие водные извлечения.
Для подтверждения безопасности водных извлечений, получаемых с применением СВЧ, проанализирована токсичность, данные по которой приведены в таблице 4. Токсичность водных извлечений, полученных при различных режимах мощности этим методом экстракции, имеет близкие значения. Эти извлечения по токсичности относятся к группе малотоксичных соединений по [19]. Их токсичность в два раза превышает токсичность препарата «Бефунгин», который производят фармацевтические предприятия Российской Федерации. Однако они менее токсичны, чем лекарственные препараты, широко применяемые в медицинской практике (табл. 4).
Объекты исследования и лекарственные препараты Токсичность ЛД50, мг/кг веса животного
Водное извлечение чаги полученное Мацерацией с СВЧ - обработкой 90 вт 2913
180 вт 2705
360 вт 3043
Гидролизаты водных извлечений чаги полученных 90 вт 7260
180 вт >8000
360 вт 6400
«Бефунгин» 6500
Гидролизат «Бефунгина» 2680
Парацетамол (обладающий жаропонижающими свойствами) 340*
Карсил (гепатопротектор) 1000**
Примечание: литературные данные *- [19], **- [20].
Токсичность гидролизатов, полученных после гидролиза водных извлечений ферментами желудочно-кишечного тракта, в условиях близких к физиологическим, намного ниже, чем у гидролизата препарата «Бефунгин», что позволяет отнести их к группе не токсичных соединений по [21]. Самой низкой токсичностью обладает гидролизат водного извлечения, полученного с СВЧ обработкой в режиме 180 вт, что может свидетельствовать о безопасности применения этого режима мощности СВЧ в экстракции чаги.
Выводы
1. Установлено, что водные извлечения чаги, полученные ремацерацией и мацерацией с применением СВЧ - обработки в режиме 180 вт: обладают наиболее близкими физикохимическими характеристиками; глубина протекания протеолиза этих извлечений ферментами желудочно-кишечного тракта одинакова, и составляет 56,6%.
2. В гидролизатах водного извлечения чаги, полученного ремацерацией и мацерацией с применением СВЧ - обработки в режиме 180 вт формируются коллоидные системы с близкими размерами частиц меланина, их эффективный радиус составляет около 116нм.
3. Гидролизаты водного извлечения чаги, полученного ремацерацией и мацерацией с применением СВЧ - обработки в режиме 180 вт имеют близкие значения антиоксидантной активности, превышающие антиоксидантную активность исходных водных извлечений в полтора раза.
4. Гидролизат, водного извлечения, полученного с СВЧ обработкой в режиме 180 вт, обладает самой низкой токсичностью, по сравнению с другими объектами исследования.
Заключение
Все полученные характеристики могут свидетельствовать о безопасности применения этого режима мощности СВЧ в экстракции чаги.
Литература
1. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами / М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, В.С. Гамаюрова, Ф.Г. Халитов, П.П. Суханов// Вестник Казан. технол. ун-та. -2003. - № 2. - С.172-176.
2. Сысоева, М.А. Исследование золя вводных извлечений чаги III. Влияние состава сырья на выход экстрактивных веществ водных извлечений чаги/ М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, В.С. Гамаюрова, П.П. Суханов, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // Химия растительного сырья. - 2004. - 4. - С.15-21.
3. Сысоева, М.А. Исследование золя вводных извлечений чаги. IX. Определение размеров частиц дисперсной фазы золя извлечений из чаги / М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, В.С. Гамаюрова, Л. А. Кудрявцева // Химия растительного сырья. - 2008 - 2. - С.75 - 80.
4. Якимов, П.А. О причинах изменения устойчивости пигментного комплекса в водных экстрактах из чаги/ П.А. Якимов, С.М.Андреева // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. - М.-Л.: Наука, 1961. - С. 113-119.
5. Сысоева, М.А. Высокоактивные антиоксиданты на основе гриба Inonotus obliquus: авто-реф. дис. док. хим. наук/М.А.Сысоева. - Казань, 2009. - 32 с.
6. Bruno J.R. Nicolaus < Malattie Molecolari >, Accademia Pontaniana, Napoli, Quaderno 34 (2002).
7. L. Zeise, B.L. Murr, M.R. Chedekel < Melanin standard method : particle description > Pigment Cell Research (1992), 5,133-142 ; Pigment Cell Research Suppl.2,(1992), 48-53;
8. Thathachari, Y.T. Phisical stadies on melanins II. X-ray diffraction/ Y.T. Thathachari, M.S. Blois// Biophisical Journal. - 1969. - 9. - P.77-89; Bolognia, J.L. Melanocyte biology/S.J. Bo-lognia, J.L. Orlov//Skin biology-N.Y. -2007. - P. 43-54.
9. Bolognia, J.L. Melanocyte biology/S.J. Bolognia, J.L. Orlov//Skin biology-N.Y. -2007. -P. 43-54.
10. Сысоева, М.А. Протеолиз водных извлечений чаги ферментами желудочно-кишечного тракта/ М.А Сысоева, Е.В. Сысоева, Д.И. Вахитова, В.С. Гамаюрова/ Х! Межд. конф. молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (г.Казань, 13-16 апреля 2010г.) Сб. тез. докл.Ч.1.-Казань: Изд-во «Отечество», 2010. - С. 284
11. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. X. Протеолиз водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта / М.А. Сысоева, Е.В. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова, В.С. Гамаюрова, Л. А. Кудрявцева // Химия растительного сырья. -2008 - 2. - С.81 - 86 .
12. Патент (19)RU(11) 2 339 390 (13) C1. Способ получения водных извлечений и полифенолов чаги, обладающих антиоксидантной активностью/ Сысоева М.А., Хабибрахманова В.Р., Гамаюрова В.С., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К.: заявитель и патентообладатель КГТУ. - №2339390; заявл.2007109396/15, 06.03.2007 ; опубл. 27.11.2008 Бюл.№33.
13. Фармакопейная статья на Бефунгин «ФС 42-3291-96»
14. Государственная фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа. 11- е изд., доп. -М.: Медицина, 1987. 336с.
15. Сысоева, М.А. Применение фотон-корреляционной спектроскопии в исследовании водной вытяжки чаги / М.А.Сысоева, Л.З.Ризванова, О.Ю.Кузнецова, В.С. Гамаюрова, Л.А.Кудрявцева// Общероссийская конференция молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии», Казань, 2006, С.115-116.
16. Абдуллин, И.Ф. Применение электрогенерированного брома для оценки интегральной антиоксидантной способности лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе/ И.Ф. Абдуллин, Е.Н. Турова, Г.Х. Гайсина, Г.К. Будников //Журнал аналитической химии. - 2002.- Т.57.- №6.- С.666-670.
17. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ./Под ред. Р. У. Хабриева - Москва, 2000. - 398 с.
18. Сысоева, М.А. Сравнительный анализ меланинов чаги с помощью электронной микро-скопии/М.А. Сысоева, М.В. Харина, П.Р. Хуснутдинов, В. А. Гревцев / Х1 Межд. конф. молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (г.Казань, 13-16 апреля 2010г.) Сб. тез. докл. Ч.1. - Казань: Изд-во «Отечество», 2010. - С. 285.
19. http://www.vita.org
20. http://www.medhelp.su
21. Сборник нормативно-методических документов по обращению с отходами производства и потребления. Приложение 1. - М.:Логус, - 1996. - С.67-68.
© Е. В. Сысоева - асс. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, inonotus@mail.ru; М. А Сысоева - д-р хим. наук, зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; Д. И. Вахитова - магистр КГТУ.
