CC BY
50
УДК 615.322:582.287.237
М. А. Сысоева, В. Р. Хабибрахманова, В. С. Гамаюрова,
О. Ю. Кузнецова, Г. И. Халиуллина
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ VI. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В КИСЛЫХ СРЕДАХ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АЦЕТАТНОГО БУФЕРА
Проведено разделение хромогенов водного извлечения чаги с помощью электрофореза на бумажном носителе. Подобраны условия для разделения фракций водного извлечения чаги при применении горизонтального электрофореза с использованием буфера на основе уксусной кислоты, при рН близком к рН водного извлечения чаги.
Водное извлечение чаги это сложная по химическому составу коллоидная полидис-персная система, в которой присутствует большое количество природных хромогенов, придающих интенсивную окраску этому извлечению. Эти соединения находятся как в свободном, так и в связанном с дисперсной фазой золя, полифенолоксикарбоновым комплексом (ПФК), состоянии. Седиментация частиц золя происходит при подкислении среды водного извлечения чаги до рН 2,0-2,5 с помощью неорганических и органических кислот. Уксусная кислота не приводит к осаждению ПФК при изменении рН от 5,9 до 1,24 [1].
Электрофорез в ацетатном буфере применяют для разделения индивидуальных фенольных соединений. При использовании этой буферной системы с рН 5,2 подвижность простых фенолов, в отличие от аминофенолов, антоцианов, бетацианов и кислот, равна нулю [2]. Таким образом, для подвижности фенольных соединений в электрическом поле в этих условиях необходимо наличие полярной группы, как например у аминофенолов, ан-тоцианов, бетацианов и кислот, либо образования комплексов с металлами.
Золь водного извлечения чаги имеет рН 5,4-5,6. Поэтому применение ацетатного буфера должно облегчить распределение фракций хромогенов золя подвижных в электрическом поле по электрофоретограмме при рН близком к рН водного извлечения чаги. Высокое содержание зольных элементов от 25 до 50% должно способствовать комплексо-образованию хромогенов водного извлечения чаги и продвижению фракций к катоду.
Исследование структуры золя водных извлечений чаги и ассоциата ПФК представляет практический интерес, поскольку на их основе получают лекарственные формы для терапии рака и предраковых заболеваний. Химический гидролиз изучаемых объектов проходит в жёстких условиях [3-5], что часто искажает представление о выделяемых компонентах. Существует также сложность в очистке и выделении фрагментов и соединений из полученных гидролизатов. Использование электрофореза облегчает задачу разделения хромогенов водного извлечения и может способствовать выяснению организации ассоциата ПФК.
Целью проведения исследования является подбор условий электрофоретического разделения хромогенов водного извлечения чаги на фракции при сохранении нативного рН среды для дальнейшего исследования структурных фрагментов сложно организованного ассоциата ПФК.
Электрофорез водного извлечения чаги в ацетатном буфере может быть реализован при небольших напряжениях только при малой силе тока в 5мА. При силе тока в 10, 15 и
20мА электрофоретическое разделение золя водного извлечения чаги происходит только при напряжении в 400В.
Данные обсчёта форетограмм с помощью денситометра приведены на рис. 1-4.
Яркость, 103
ед
1 -0,8 -0 ,6 р -0 ,4 -0 ,2 0
■ 1(200 В) ■
-2(300 В) I
б
а
Рис. 1 - Электрофорез водного извлечения чаги при 5мА: а - электрофоретограмма и денситограмма при 350В; б - электрофоретограмма при 200В; денситограммы при 200В и 300В
При всех применённых режимах электрофоретического разделения хромогенов водного извлечения чаги на стартовой линии остаётся больше хромогенов, судя по тёмно коричневой окраске этой зоны. Это свидетельствует о малой подвижности хромогенов в этой буферной системе. Возможно, это связано с тем, что под действием электрического поля на стартовой линии мицеллы ПФК стабилизируются за счёт перераспределения зарядов на её поверхности и отделение фракций ПФК затруднено.
Электрофоретограммы водных извлечений чаги, полученные при 5мА и напряжении 100В имеют слабо окрашенный фронт (яркость около шести единиц) двигающийся, как по направлению к аноду, так и к катоду, до Кг 0,6 в оба направления от стартовой линии.
Начиная с 150В и до 400В при этой силе тока, не наблюдается движение интенсивно окрашенных фракций золя водного извлечения чаги по направлению к аноду. По направлению к катоду происходит смещение фракций хромогенов от стартовой линии, как показано на рис. 1б. С увеличением напряжения возрастает интенсивность окраски в диапазоне Кг от 0,1 до 0,4 и изменяется картина распределения хромогенов в дальней области электрофоретограмм. Максимальная интенсивность окраски зоны в диапазоне Кг От 0,1 до 0,4 наблюдается на электрофоретограммах, начиная с 250В, но характер распределения её по электрофоретограмме при различных напряжениях изменяется, как показано на рис. 1. При напряжении 350В в диапазоне Кг от 0,4 до 0,8 кроме этого можно отметить слабо окрашенную зону (яркость около пяти единиц), максимальной интенсивности для исследованных режимов. Такая картина на электрофоретограммах может быть обу-
словлена движением различных частиц ПФК, имеющих на своей поверхности положительный заряд, либо различно распределённый по поверхности частицы, либо частицы различаются по массе, и, следовательно, по заряду.
При этих режимах электрофореза наблюдается максимальное движение фракций несущих положительный заряд за счёт комплексообразования с ионами металлов к катоду. Например, в ПФК, согласно данным ИК-спектроскопии, преобладают карбоксильные группы участвующие в соле- и комплексообразовании с металлами [6]. По-видимому, именно эта сила тока и диапазон напряжения способствуют стабилизации частиц ПФК несущих положительный заряд и их подвижность в электрическом поле. Оптимальным режимом можно считать ток в 5мА и напряжение 350В, позволяющие выделить две зоны на электрофоретограмме частиц хромогенов водного извлечения чаги двигающихся к катоду.
Электрофоретограмма, полученная при 10мА и напряжении 400В мало отличается от описанных ранее.
Яркость,103
Яркость, 103
«т
Рис. 2 - Электрофорез водного извлече- Рис. 3 - Электрофорез водного извле-
ния чаги при 15мА и 400В чения чаги при 20мА и 400В
Электрофорез водного извлечения чаги при 15мА и напряжении 400В приводит к коренному изменению распределения хромогенов по электрофоретограмме. Как показано на рис. 2 наблюдается фракция хромогенов двигающихся в сторону анода в диапазоне Кг от 0,1 до 0,4. Интенсивность её цвета достаточно высока 20-16 единиц. Движение хромогенов водного извлечения чаги в сторону катода менее выражено, хотя область Кг от 0,1 до 0,3 также имеет достаточно интенсивную окраску с яркостью от 20 до 6 единиц, но занимает достаточно узкий диапазон, недалеко отходящий от стартовой линии. На поверхности мицеллы ПФК находится достаточно большое количество метоксильных и карбонильных групп [7]. При проведении электрофореза в условиях ацетатного буфера при высоких силе тока и напряжениях, вероятно, более подвижными становятся полианионные фракции ПФК.
Увеличение силы тока до 20мА сказывается в снижении интенсивности окраски зон на электрофоретограмме продвигающихся к аноду и катоду, что продемонстрировано на рис. 3. Таким образом, увеличение силы тока снижает подвижность полианионных фракций ПФК.
Электрофорез водного извлечения чаги в ацетатном буфере позволил обнаружить как отрицательно, так и положительно заряженные фракции подвижные в электрическом поле. По высокой яркости зон на денситограммах, можно предположить, что на стартовой линии, в условиях электрического поля, мицеллы ПФК дезинтегрируются. Отделяющиеся фракции в среде ацетатного буфера формируют вторичные мицеллы, несущие на своей поверхности отрицательный, либо положительный заряд. Участие в формирование вторичных мицелл могут принимать как полифенолы, так и белки, полисахариды, зольные элементы, свободные и связанные, входящие в ассоциат ПФК. Оптимальными режимами для выявления положительно заряженных фракций водного извлечения чаги являются сила тока в 5мА и напряжениях 150, 200, 250, 300, 350 и 400В. Оптимальными режимами для движения отрицательно заряженных фракций являются сила тока в 15 и 20мА и напряжение в 400В.
Экспериментальная часть
Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети, производитель ЗАО «Фирма Здоровье». Вытяжки получали проведением процесса ремацерации [6].
Для проведения электрофореза использовали электрофоретическую камеру 8Е-1 и источник питания «Эльф-4». Для электрофореграмм использовали медленно фильтрующую бумагу.
Электрофорез водного извлечения чаги проводили: при силе тока в 5мА снимали элек-трофоретограммы при напряжении 100, 150, 200, 250, 300, 350 и 400В; при силе тока в 10, 15 и 20мА использовали напряжение в 400В.
После разделения электрофоретограммы обрабатывались парами аммиака [8].
Обсчет электрофоретограмм проводили с использованием программы «8огЬШ ТЬС».
Литература
1. Якимов П.А., Андреева С.М. Алексеева Е.В. //Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.- Л.: Наука, 1961, С. 113-119.
2. Чармс Ш., Фишбейн Л., Вагман Дж. и др. Хроматография: Практическое приложение метода Ч.2 / Под редакций Э.Хефтмана. М.: Мир, 1986. 422с.
3. Ловягина Е.В. // Биохимия. 1959. Т. 24. Вып.1. С.41-46.
4. Рыжова Г.Л. //Химико-фармацевтический журнал. 1997. № 10. С. 29-31.
5. Калашникова Е.А. Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата «Бефунгин». Автореф. дисс. на ск. уч. степ. к-та фарм. наук. Пятигорск, 2003. 23 с.
6. Сысоева М. А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С. и др. // Вестник Казанского технол. ун-та. Казань. 2003. №2. С.172-179.
7. Шиврина А.Н. // Почвоведение. 1962. № 11. С. 51-60.
8. ЗапрометовМ. Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высшая школа, 1974. 214 с.
© М. А. Сысоева - канд. хим. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; В. Р. Хабибрахма-нова - асс. той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф. зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; О. Ю. Кузнецова - канд. хим. наук, асс. той же кафедры; Г. И. Халиуллина - студ. КГТУ.
