Разделение водных извлечений чаги с использованием этилацетата. Ii. Парамагнитные свойства хромогенов чаги Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 615.322:582.287.237

РАЗДЕЛЕНИЕ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТИЛАЦЕТАТА. II. ПАРАМАГНИТНЫЕ СВОЙСТВА ХРОМОГЕНОВ ЧАГИ

*

© М.А. Сысоева1, В.Р. Хабибрахманова1 , В. С. Минкин1, В. С. Гамаюрова1, В.Е. Петрашень2

1 Казанский государственный технологический университет, Казань,

Республика Татарстан, 420015 (Россия) E-mail: ramven@rambler.ru 2Казанский физико-технический институт РАН, Казань,

Республика Татарстан, 420015 (Россия)

Проведено исследование хромогенов - полифенолоксикарбоновых комплексов, сформированных при разделении золя водного извлечения чаги с использованием этилацетата методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Показано, что спектральные характеристики комплексов, сформированных в эмульсионном и водном слоях, отличаются между собой и от полифенолоксикарбонового комплекса водного извлечения чаги.

Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.»

Введение

Изучению парамагнитных характеристик природных объектов уделяется большое внимание. Особенно эти характеристики важны для лекарственных препаратов и БАД, предназначенных для лечения заболеваний, связанных со свободно радикальной этиологией, таких как лучевая болезнь, атеросклероз, рак [1]. Га-леновые препараты на основе чаги давно используются в народной и официнальной медицине в качестве иммуномодуляторов, а также для лечения предраковых и раковых заболеваний [2].

Основным компонентом дисперсной фазы золя водных извлечений чаги является хромоген - полифенолокси-карбоновый комплекс (ПФК), близкий по физико-химическим характеристикам к гуминовым кислотам (ГК). Он отличается от ГК растворимостью в воде, отсутствием в своем составе азота и большим количеством метоксильных групп [3]. Как ГК, так и ПФК являются сложно организованными природными объектами с невыясненной структурой. Определенную информацию о структурной организации указанных объектов можно получить с помощью ЭПР спектроскопии. Методы выделения и очистки могут существенно влиять на спектр ЭПР исследуемых объектов [4].

Спектр ЭПР гриба чаги состоит из одиночной линии с g-фактором, равным g-фактору свободного электрона, и имеет высокую интенсивность сигнала. Концентрация парамагнитных центров (ПМЦ) в чаге достигает 6,6-1018 спин/г. ПФК чаги имеет такие же параметры спектра ЭПР, как и наружный слой чаги, но интенсивность сигнала возрастает в 1,5 раза. Природа ПМЦ в чаге не изучена. Выдвинуто предположение о том, что сигнал ЭПР гриба чаги и ПФК обусловлен существованием в этих объектах энергетически выгодного равновесия: фенол - семихинон - хинон [5]. ПФК [5] и меланин [6], выделяемые из природной чаги, имеют один сигнал ЭПР спектра с g=2,00, слегка ассиметричной формы, что свидетельствует о близости их структурной организации. ЭПР спектры ГК [4], с которыми часто сравнивают ПФК, содержат три сигнала. Это говорит о наличии в них не менее трех типов ПМЦ. Одна полоса с g-фактором, равным 2,00, и малой шириной ДИ - менее 10 Э; вторая с g-фактором, равным 2,10, и шириной, лежащей в пределах 550-1600 Э; и третья с g-фактором, равным 4.30, и шириной 120-240 Э. Первый сигнал отнесен к свободнорадикальному источнику. Линии с g =4,30 и часть линии с g=2,10 обусловлены железом, входящим в органические комплексы ГК.

* Автор, с которым следует вести переписку.

Нами проведено разделение ПФК водного извлечения чаги в мягких условиях, с применением этилаце-тата. При обработке водного извлечения чаги этилацетатом образуются три слоя: этилацетатный, эмульсионный и водный [7]. Из эмульсионного слоя, осаждением этанолом выделен полифенол сложного состава, называемый далее ПФК из эмульсионного слоя (ПФК1). ПФК из водного слоя выделен осаждением соляной кислотой (ПФК2).

Цель работы - оценка структур ПФК водного извлечения чаги, а также ПФК, сформированных в эмульсионном и водном слоях, после обработки водного извлечения чаги этилацетатом (без дополнительной очистки, т.е. в нативном состоянии), основываясь на данных, полученных с помощью ЭПР спектроскопии.

Экспериментальная часть

В работе использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети, производитель - ЗАО «Фирма Здоровье».

Водные извлечения чаги получали ремацерацией [В]. Для получения эмульсионного и водного слоев водное извлечение чаги обрабатывали равным объемом этилацетата при температуре 35±1°С и постоянном перемешивании со скоростью 215 об/мин.

ПФК и ПФК2 получали, обрабатывая водную вытяжку чаги и соответственно водной слой HCl до рН=2,0. ПФК1 получали, обрабатывая эмульсионный слой равным объемом С2Н5ОН. Образовавшиеся осадки отделяли фильтрованием и высушивали при комнатной температуре в тонком слое.

Определение катионов проводили методом БХ после озоления исследуемых полифенолов согласно методике [9].

Исследование электронного парамагнитного резонанса осуществляли на спектрометре Germany ERS-230, спектры в виде производных кривых поглощения были записаны на частоте v=9340 МГц по методике [4, 10-12].

Обсуждение результатов

Нами продолжены исследования хромогенов чаги методом ЭПР в широком температурном интервале. В качестве объектов исследования были выбраны ПФК водного извлечения из природной чаги и ПФК, сформированные в эмульсионном (ПФК1) и водном (ПФК2) слоях, после обработки водного извлечения чаги этилацетатом.

На рисунке 1А приведены спектры ЭПР для образца ПФК, полученные при температуре 293 и 143 К. В спектрах наблюдаются два сигнала с g=2,00 и g=2,10. На рисунке 2А приведен спектр ЭПР сигнала с g=2,00 для полной идентификации структуры исследуемых ПФК. Регистрируемый узкий сигнал ЭПР в спектрах с g=2,00, который наблюдался в рецензируемых работах для ПФК и меланинов, полностью подтверждает полученные ранее данные (ДИ=5,В Э; концентрация ПМЦ ~6,8-101Вспин/г). Данный сигнал не изменяется с понижением температуры, концентрация ПМЦ и ширина линии его меняются незначительно (Д^6 Э; концентрация ПМЦ ~5-101Вспин/г).

Второй сигнал в ЭПР спектрах ПФК, с g=2,10, шириной линии ДИ=520 Э, имеет небольшую температурную зависимость ширины и интенсивности линии. При снижении температуры от 293 до 143 К интенсивность сигнала возрастает, а ширина линии увеличивается на 30 Э. Это связано с влиянием температуры на обменные процессы парамагнитной релаксации, происходящие в ПФК при увеличении температуры.

В ЭПР спектре образца ПФК1, приведенном на рисунке 1Б, также обнаруживаются два сигнала с g=2,00 и g=2,10, как и в образце ПФК. Как показано на рисунке 2Б, сигнал для свободного электрона у образца ПФК1 идентичен этому сигналу в ЭПР спектре для ПФК. Интенсивность этого сигнала для ПФК1 выше, чем для ПФК.

В спектрах ПФК и ПФК1 сигналы с g=2,10 имеют симметричную форму и близкие значения AH. Причем, при понижении температуры интенсивность этих сигналов увеличивается.

Необходимо отметить симметричность сигналов с g=2,00 и g=2,10 для ПФК и ПФК1, в отличие от аналогичных сигналов у природной чаги, меланинов и ГК, что связано, на наш взгляд, с более равномерным, возможно, радиальным распределением ПМЦ по образцам ПФК и ПФК1.

Сигнал с g=2,10 в спектре ПФК1 имеет = 4В0-500 Э, чуть меньше, чем в исходном ПФК, что указывает на большую подвижность структуры ПФК. Кроме описанных сигналов в ЭПР спектре ПФК1 в области g-фактора около

4, как у ГК, с g=3,85, наблюдается слабое проявление сигнала в спектре при понижении температуры от 293 к 143 К.

В спектре ПФК2, представленном на рисунке 1В, наблюдаются три линии поглощения, одна из которых, узкая компонента с g=2,00, относится к g-фактору свободного электрона. Кроме этого в спектре ПФК2 также наблюдается асимметричный сигнал с g=2,10. Ширина этого сигнала возрастает до 750 Э по сравнению с ДH ПФК и ПФК1. В отличие от ранее рассмотренных спектров, в спектре ПФК2 наблюдается явно выраженный сигнал с g=3,90 и ДH около 170-200 Э при температуре 293 К.

Рис. 1. Вид спектров ЭПР при различных температурах. А - ПФК; Б - ПФК1; В - ПФК2

А)

Рис. 2. Сигнал я=2,00 в ЭПР спектрах. А - ПФК; Б - ПФК1; В - ПФК2

Идентичным для всех спектров исследованных образцов является наличие фрагмента с g=2,00. Проведены качественные реакции всех выделенных хромогенов с Н2О2, КМпО4, БеС13 [13], согласно которым определяют их отнесение к меланинам. Все три объекта дали положительную реакцию на принадлежность исследуемых объектов к меланинам. Это свидетельствует о наличии в их составе хиноидных или иных фенольных структур, способных давать в ЭПР спектрах сигнал свободного электрона. Как показано на рисунке

2, количественная характеристика этого сигнала в исследуемых объектах значительно отличается в сторону увеличения (почти в 1,4 раза) для ПФК1.

Большой интерес с точки зрения образующихся структур ПФК представляет появление в ЭПР спектрах ПФК1 и ПФК2 сигналов с g факторами, равными 3,90 и 3,85 соответственно. Опираясь на характеристику спектров ГК [4] и литературные данные [14], можно отнести появление этих сигналов в комплексах, формируемых в эмульсионном и водном слоях, за счет участия ионов железа.

Водные извлечения чаги имеют высокую зольность, часто более 25% [15]. В их состав входят катионы, обладающие парамагнитными свойствами (по убыванию содержания): М£> Мп> >А1> 2п>Ре>>Си.

Для подтверждения наличия в исследуемых образцах ионов железа проведен их анализ после озоления с применением бумажной хроматографии. Во всех исследуемых образцах показано присутствие ионов Ре3+, а также не идентифицированных голубых пятен на старте. Из перечисленных ранее металлов, которые могут присутствовать в водных извлечениях чаги, в этой системе растворителей над стартовой линией на хроматограмме могут быть обнаружены А1, Мп. Однако эти металлы не проявляются желтой кровяной солью, которую использовали для подтверждения наличия ионов железа в анализируемых объектах. Медь ни на хроматограммах, ни с помощью качественных реакций в исследуемых образцах обнаружить не удалось. Возможно, это связано с ее очень низким содержанием в комплексах.

Отличие g-факторов и форма линий данных сигналов в спектрах ПФК1 и ПФК2 свидетельствуют о том,

3+

что ионы Ре в них имеют различное окружение, следовательно, они отличаются структурной организацией. В случае ПФК2 координационное число иона Ре3+ должно быть большим, чем для ПФК1.

Во всех анализируемых объектах наряду с присутствием в ЭПР спектрах сигнала g=2,00, отвечающего за органическую компоненту этих объектов, присутствует сигнал с g=2,10, который, по аналогии со спектрами ГК [4], вероятно, характеризует парамагнитные свойства как органической, так и неорганической компоненты этих объектов.

В ПФК, полученных при обработке водного извлечения этилацетатом, роль неорганической компоненты в формировании этих комплексов возрастает, что наблюдается в появлении в их ЭПР спектрах сигналов с g=3,85 (ПФК2) и g=3,90 (ПФК1), связанных с парамагнитными свойствами иона Ре3+.

Анализ полученных нами данных позволяет поставить исследуемые объекты в ряды с возрастанием соответствующих свойств:

- по подвижности структурных элементов, входящих в состав хромогенов: ПФК2>ПФК>ПФК1, на основании изменения ширины линии сигнала с g=2,10 ЭПР спектров;

- по возрастанию парамагнитных свойств органической компоненты объектов исследования: ПФК> ПФК2 > ПФК1, на основании относительного возрастания сигнала с g=2,00 ЭПР спектров, соотнесенных как - 1 : 1,1 : 1,4,соответственно;

- по возрастанию парамагнитных свойств неорганической компоненты объектов исследования: ПФК>ПФК1>ПФК2, на основании появления сигнала с g=3,90 (ПФК1 при температуре 143 К) и g=3,85 (ПФК2 при температуре 293 К) в ЭПР спектрах.

Выявленные закономерности позволяют заключить, что при разделении водного извлечения чаги этилацетатом на основе дисперсионной и дисперсной фаз (ПФК) золя водного извлечения чаги с участием этил-ацетата формируются дисперсные фазы эмульсионного (ПФК1) и водного (ПФК2) слоев, отличные между собой и от исходной дисперсной фазы водного извлечения чаги.

Выводы

1. Установлено различие структур хромогенов (ПФК) водного извлечения чаги и ПФК, сформированных в эмульсионном и водном слоях после обработки водного извлечения чаги этилацетатом. Показано их отличие от структур ПФК и меланинов, выделенных ранее из чаги. Это подтверждает мнение о том, что методы выделения и очистки могут существенно влиять на ЭПР спектры хромогенов и ГК.

2. Показано, что парамагнитные свойства анализируемых хромогенов чаги обеспечиваются как органической, так и неорганической компонентой, входящих в их состав. Установлено, что ионы Ре3+, обладающие парамагнитными свойствами, имеют разную координацию в комплексах ПФК1 и ПФК2, формируемых в эмульсионном и водном слоях при разделении водного извлечения этилацетатом.

3. Обнаружено различие структур хромогенов чаги (ПФК), формируемых в составе золя водного извлечения чаги и золях, образующихся при его разделении этилацетатом (ПФК1 и ПФК2), по подвижности их структурных компонентов. Хотя ПФК и ПФК2 формируются в водной среде, подвижность структурных компонентов ПФК2 существенно выше, чем ПФК.

Список литературы

1. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. М., 1993. Т. 2. 415 с.

2. Сысоева М.А., Хабибрахманова В.Р., Гамаюрова В.С. Муллина Д.В. и др. Использование гидролаз некрахмалистых полисахаридов. Антиоксидантная активность полученных извлечений // Бутлеровские сообщения. 2005. Т. 7. №3. С. 1-3.

3. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К вопросу о природе и происхождении водорастворимого пигментного комплекса, образуемого трутовым грибом чага // Биохимия. 1959. Т. 24. №1. С.67-72.

4. Бабанин В.Ф., Ильин Н.П., Орлов Д.С., Федотова Т.В., Яблонский О.П. О природе линий в спектрах ЭПР гумусовых кислот // Почвоведение. 1977. №1. С. 65-72.

5. Соловьев В.А., Кутневич А.М. Применение метода парамагнитного резонанса для изучения чаги и продуктов метаболизма некоторых других дереворазрушающих грибов // Высшие грибы и их физиологически активные соединения. Л., 1973. С. 35-39.

6. Кукулянская Т.А., Курченко Н.В., Курченко В.П., Бабицкая В.Г. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. №1. С. 68-72.

7. Юмаева Л.Р., Хабибрахманова В.Р., Сысоева М.А., Гамаюрова В.С. Извлечение липидов из водной вытяжки чаги // Пищевые технологии: Мат. общероссийской конф. молодых ученых с международным участием. Казань, 2006. С. 118-119.

8. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-179.

9. Хайс И.М., Мацек К. Хроматография на бумаге. М., 1962. 852 с.

10. Куска Х., Роджерс М. ЭПР комплексов переходных металлов. М., 1970. 217 с.

11. Минкин В.С., Аверко-Антонович Л.А., Кирпичников П.А. Исследование процессов вулканизации жидких ти-оклов диоксидом марганца // Высокомолекулярные соединения. Сер. Б. 1981. Т. 23. С. 593-596.

12. Альтшулер С.А., Козырев Б.М. ЭПР соединений элементов промежуточных групп. М., 1972. 262 с.

13. Лях С.П. Микробный меланогенез и его функции. М., 1981. 273 с.

14. Эйхгорн Г. Неорганическая биохимия. М., Т. 2. 1978. 737 с.

15. Якимов П.А., Ступак М.Ф. Зольные элементы чаги и препарата из нее // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 50-55.

Поступило в редакцию 6 июня 2007 г.