CC BY
175
ных исследований №3 «Энергетические аспекты ляемого глеродсодержащего сырья»). глубокой переработки ископаемого и возобнов-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола. / Ефременко Е.Н. [и др.] // Катализ в промышленности, 2010. - T. 5. - С.70-76.
2. Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора / Ефременко Е.Н. [и др.] // Патент РФ на изобретение № 2253677, 2002.
3. Rhizopus oryzae fungus cells producing L(+)-lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogel-entrapped mycelium./ Efremenko E.N. [et al] // Appl Microb Biotech, 2006. -V.72. - P.480-485.
4. Co-production of fumaricacid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material - dairy manure -using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344 / Liao W. [et al] //Bioresour Technol, 2008.
- V. 99. - P. 5859-5866.
5. Fermentative production of fumaric acid from Eucalyptus globulus wood hydrolyzates / Rodriguez-Lopez. [et al] // J Chem Technol Biotech, 2012. -V. 87. - P. 1036-1040.
6. Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse / Carta F.S. [et al] // Bioresour Technol, 1999. - V. 68. - P. 23-28.
7. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production. / Xu Q. [et al] // Bioresour Technol, 2010. - V. 101. - P. 6262-6266.
□Авторы статьи:
Сенько Ольга Витальевна, научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ, мл. научн. сотр. Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН ЕшаД:8епко@еп2уше.сЬеш.ш8и.га
Степанов Николай Алексеевич, канд.техн.наук, младший научный сотрудник (Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН) Email: [email protected]
Лягин Илья Владимирович, к.х.н., старший научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ Email: [email protected]
Маслова Ольга Васильевна, младший научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ Email: [email protected]
Ефременко Елена Николаевна, докт.биол.наук, проф., зав. лаб. «Экобиокатализа» каф. химической энзимологии МГУ, в.н.с. Института биохимической физики им. Н.М.
Эмануэля РАН Email:[email protected]
УДК 579.695
Ф. Т. Мамедова, А.Б. Никольская, Е.Н. Ефременко
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СТОЧНЫХ ВОД ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
В настоящее время биомасса микроводорослей представляет большой интерес как один из ценных источников возобновляемого сырья для получения различных коммерчески значимых продуктов, используемых в химической, нефтехимической и пищевой промышленностях [1]. Для культивирования микроводорослей обычно используют синтетические минеральные среды. Однако при использовании таких сред себестоимость получаемой биомассы оказывается достаточно высокой, поскольку требует использования различных реактивов, их взвешивания, растворения, транспортировки к месту наращивания микроводорослей. Одним из способов удешевления производства является комплексное использование полученной биомассы, ее глубокая трансформация в
различные конечные продукты. Другим способом повышения экономической эффективности представляется выращивание клеток на сточных водах, загрязненных различными соединениями, способными выполнять роль биогенов для микроводорослей. Это позволит удешевить питательную среду и решить проблему очистки сточных вод и накопления целевой биомассы. В этой связи актуальна разработка методов культивирования микроводорослей как концентраторов биогенных элементов, содержащихся в сточных водах.
Целью данной работы являлось исследование возможности использования сточных вод для накопления биомассы микроводорослей на примере зеленой микроводоросли Chlorella vulgaris С-1.
114
Ф. Т. Мамедова, А.Б. Никольская, Е.Н. Ефременко
Материалы и методы. Объектом исследования в работе были клетки зеленой микроводоросли Chlorella vulgaris С-1. Культивирование клеток осуществляли на модельных питательных средах, имитирующих сточные воды разной очистки. Состав раствора №1, имитирующего бытовые сточные воды после биологической очистки, был следующим (мг/л): NaCl - 7; CaCl2 - 4; MgSO4-7H2O -2; NH4Cl - 10; K2HPO4-3H2O - 28,4; KH2PO4 - 8,5; Na2HPO4 - 33,4. Состав раствора №2,
имитирующего сточные воды с высоким содержанием органических веществ после механической очистки, был таким (мг/л): ацетат Na - 5000; цитрат Na - 0,1; дрожжевой экстракт -1; NH4Cl - 245,2; CaCl2 - 446,8; NaCl - 123; MgSO4-7H2O - 751,3; NaHCO3 - 137,7;
K2HPO4-3H2O - 393,1; KH2PO4 - 62,2; FeSO4-7H2O
- 15,26; MnCl2-4H2O - 10,1; H3BO3 - 1,6. Также в 1 л данного модельного раствора вносили 1 мл раствора микроэлементов следующего состава (в мг/л): NiSO4-6H2O - 121,7; CuSO4-5H2O - 39,1; ZnSO4-7H2O - 88,3 [3, 4]. Модельные растворы №3 и №4 были получены путем разбавления раствора №2 в 2 и 4 раза соответственно. pH всех растворов было 7,2 ^ 7,5. Культивирование проводилось в колбах объемом 750 мл, заполненных 100 мл соответствующей питательной среды в аэробных условиях в статическом режиме при температуре
21 ± 1 0С и постоянном освещении лампами Osram Fluora 77 (30 Вт). Инокулят клеток вносили в 10%-ном соотношении к объему среды. Рост клеток контролировали спектрофотометрически по оптической плотности культуральной суспензии при длине волны 540 нм (спектрофотометр Agilent UV-853, Германия).
Определение биохимического состава клеток. Экстракция липидов из биомассы и их дальнейшее определение осуществлялись по методу Фольша [2]. Осадки биомассы после экстракции липидов высушивались при 50оС в течение 20 ч. Экстракция белков и их определение проводились по методу, описанному в [3]. Осадки биомассы после экстракции белков высушивались при 60оС в течение 20 ч. Определение углеводов проводилось с использованием фенольного метода [4].
Определение кинетических параметров процессов. При проведении расчетов предполагалось, что изучалась закрытая (периодическая) система, в которой существенные для роста компоненты в процессе роста клеток не поступали в систему дополнительно и не покидали ее в течение каждого цикла. В закрытой системе скорость роста биомассы в конечном итоге стремится к нулю либо из-за недостатка субстрата, либо из-за ингибирования продуктом при его дальнейшем накоплении.
С учетом вышеизложенного положения дель-
Время, сутки
Рис. 1. Кинетика накопления биомассы Chlorella vulgaris C-1 в образцах №1 (я), №2 (▲), №3 (А), №4 (о) модельных сточных вод и в среде Тамийя, содержащей глюкозу (+). OD540 - оптическая плотность при длине волны 540 нм.
Таблица 1. Параметры процесса накопления биомассы Chlorella vulgaris в модельных стоках и в сре-_________________________________де Тамийя, содержащей глюкозу. __________________________________
Питательные среды Раствор №1 Раствор №2 Раствор №3 Раствор №4 Тамийя, содержащая глюкозу
ц, сут-1 0,11 0,41 0,35 0,50 0,42
С, г/л/сут 0,41 1,52 1,43 1,77 1,53
Таблица 2. Биохимический состав биомассы клеток микроводоросли Chlorella vulgaris С-1, выра-_______________________________щенной в модельных стоках.____________________________
№ раствора Содержание, %
липидов белков углеводов
2 18,9±1,1 33,7±3,2 45,2±1,9
3 19,1±2,3 24,7±1,5 53,3±2,7
4 27,0±2,5 41,6±2,7 30,4±3,5
ная скорость роста /л представляет собой скорость роста единицы популяции:
dC = /иС-dt, dC/dt = /л-С,
где t - время роста культуры, сут; С - концентрация клеток в момент времени t, г/л; л - удельная скорость роста, сут-1.
На участке экспоненциального (логарифмического) роста удельная скорость роста постоянна, она определялась из уравнения:
lnC = lnCo+U't, где С0 - начальная концентрация клеток, г/л.
Продуктивность процесса по биомассе Qc, г/л/сут, рассчитывалась по формуле:
Qc = C/t,
где С - концентрация клеток в момент времени t, г/л.
Результаты и обсуждение. Было установлено (рис.1, табл.1), что сточные воды, особенно включающие в свой состав органические вещества, могут быть эффективно использованы в качестве питательных сред для накопления клеток микроводорослей. Наличие органических веществ позволило более чем в 3 раза повысить скорость роста клеток и продуктивность системы по биомассе. Основной прирост клеток Chlorella vulgaris С-1 происходил в течение первых 8-ми суток культивирования. Необходимо также отметить, что в сравнении с результатами, полученными при культивировании клеток в питательной среде Та-мийя с добавлением глюкозы в качестве источника органического углерода, получено, что рост клеток микроводорослей на модельной сточной воде, содержащей органические вещества (раствор №2), практически не отличался от роста клеток на среде Тамийя. Однако при разбавлении раствора
№2 в 4 раза (раствор №4) скорость роста составила 0,50 сут-1, а продуктивность по биомассе 1,77 г/л/сут, что превысило данные, полученные для среды Тамийя в 1,2 раза.
Анализ биохимического состава микроводоросли Chlorella vulgaris C-1, накопленной на модельных сточных водах, содержащих органические вещества (табл. 2), показал, что наибольшая доля липидов и белков накапливалась в биомассе клеток, культивирование которых проводилось в образце модельной сточной воды №4, то есть при максимальном из исследованных разбавлении модельных сточных вод после их механической очистки. Максимальная концентрация углеводов в биомассе клеток Chlorella vulgaris C-1 была получена в случае использования для культивирования раствора №3.
Вероятно, используя различные образцы сточных вод, а также изменяя концентрации веществ в них путем разбавления, можно накапливать биомассу микроводорослей требуемого биохимического состава. В целом очевиден огромный потенциал этого способа получения биомассы микроводорослей, способных расти в гетеротрофных или миксотрофных условиях, для ее последующей трансформации в различные продукты для нефтехимической, нефтеперерабатывающей и топливной промышленности.
Работа поддержана государственным контрактом № 16.526.11.6003 Федеральной целевой программы “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы”.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Efremenko E.N. Production of biofuels from pretreated microalgae biomass by anaerobic fermentation with immobilized Clostridium acetobutylicum cells / Efremenko E.N., Nikolskaya A.B., Lyagin I.V., Senko O.V., Makhlis T.A., Stepanov N.A., Maslova O.V., Mamedova F., Varfolomeyev S.D. // Bioresour. Technol, 2012. - V.114. -P.342-348.
2. Folch J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues / Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. // J. Biol. Chem.,1957. - V. 226. - P.497-509.
3 Досон Р. Справочник биохимика / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.; перевод с англ. В.Л.
Друцы и О.Н. Королевой. - М.: Мир, 1991. - 544 с
4. Dubois M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / Dubois M., Gilles K.A.,
Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. // Anal. Chem., 1956. - V.28. - P.350-356.
□Авторы статьи:
Мамедова Фахрия Тахир-кызы, аспирант каф. химической энзимологии МГУ E-mail: [email protected]
Никольская Анна Борисовна, инженер-исследователь (Институт Биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН) E-mail: [email protected]
Ефременко Елена Николаевна, докт.биол.наук, проф., зав. лаб. «Экобиокатализа» каф. химической энзимологии МГУ, в.н.с. Института биохимической физики им. Н.М.
Эмануэля РАН ЕтаП:е1епа_е&етепко@^1ги,
