CC BY
90
УДК 663.534
Н.А.Степанов, О.В. Сенько, Е.Н. Ефременко
ТРАНСФОРМАЦИЯ ВОЗОБНОВЛЯЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ ЭНЕРГИИ В ВИДЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ В БИОЭТАНОЛ
В связи с прогрессирующим дефицитом ископаемых топлив в настоящее время возник ряд проблем, связанных с поиском и технологическим освоением новых источников энергии, получаемых из возобновляемого сырья, к которым относится биоэтанол. Сегодня объем мирового рынка этанола оценивается в 50 млрд. л/год, из которых около 60% используется как добавка к моторному топливу. В последние годы процесс получения биоэтанола предполагает изпользование возобновляемого целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) с последующей его конверсией в целевой продукт [1-2]. Одной из проблем использования ЦСС для получения биотоплива является присутствие в этих источниках возобновляемой биомассы природных ингибиторов, останавливающих эффективное функционирование клеток [3]. Возникает необходимость преодоления этого ингибирующего воздействия на используемые продуценты биоэтанола. В свете этого актуальной является разработка и приминение гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток (ИК), обладающих повышенной резистентностью к воздействию негативных факторов [4].
Усовершенствованием организации процесса получения биоэтанола является применение продуцентов, способных осуществлять конверсию не только гексоз, но и пентоз в целевой продукт. Генно-модифицированные штаммы микроорганизмов, на получение которых было направленно большое количество научных проектов с целью получения такого рода продуцентов, не востребованы производством, по целому ряду причин. Среди которых необходимость введения индукторов в среды для биосинтеза необходимых фермен-
тов, антибиотиков для подавления аборигенной микрофлоры, решение вопросов по утилизации биомассы генно-модифицированных клеток. В связи с этим огромен интерес к природным штам-мам-продуцентам, чьё применение в этой области биотехнологии становится очень актуальным. В качестве таких клеток могут применяться природные (генетически немодифицированные) штаммы мицелиальных грибов родов Rhizopus, Aspergillus, Fuzarium и Mucor, способные осуществлять конверсию различных сахаров, в том числе и пентоз (ксилозы и арабинозы), в этанол [5-6].
Таким образом, данная работа была направлена на реализацию процесса получения биоэтанола из различных ферментативных гидролизатов целлюлозосодержащего сырья под действием биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов и дрожжей.
В работе в качестве продуцента этанола использовались клетки мицелиального гриба Mucor circinelloides F 1627 и клетки термотолерантных дрожжей Saccharomyces cerevisiae Т2.
Иммобилизацию клеток мицелиальных грибов и дрожжей в криогель поливинилового спирта проводилась согласно ранее разработанным способам, соответствующим разным типам клеток [78].
Ферментативный гидролиз ЦСС осуществлялся комплексом целлюлаз, включающим эндо- эк-зоглюканазы и р-глюкозидазу и секретируемым иммобилизованными клетками мицелиального гриба Aspergillus terreus, в течение 24-48 ч при 50°С. Гидролизаты содержали 0,2 г/л ампицилина и были приготовлены на основе 0,1 M натрий ацетатного буфера, рН -5,0.
Таблица 1. Брожение ферментативных гидролизатов различного ЦСС ИК дрожжей
£. cerevisiae T2 при 42оС
Ферментативный гидролизат Исходная концентрация глюкозы, г/л Этанол, г/л Выход, %
Рисовой соломы 19,9±0,4 9,1±0,2 90,0±1,0
Свекловичного жома 13,0±0,2 6,0±0,1 90,5±0,5
Пергамента 23,0±0,5 10,7±0,1 91,0±1,0
Пшеничной соломы 24,0±0,3 11,2±0,1 92,0±1,0
Сосновых опилок 49,3±1,4 21,5±0,3 85,0±2,0
Осиновых опилок 26,6±1,2 10,9±0,3 80,0±2,5
Березовых опилок 15,2±0,6 6,7±0,2 87,0±1,5
Дубовых опилок 14,6±1,0 6,4±0,4 86,0±1,0
Тростниковой багассы 18,5±0,3 8,5±0,2 90,0±0,5
Стеблей топинамбура 23,0±0,7 10,6±0,1 90,0±0,5
iiG
Н.А.Степанов, О.В. Сенько, Е.Н. Ефременко
Таблица 2. Характеристики процесса получения биоэтанола из ферментативных гидролизатов ЦСС под действием свободных и ИК мицелиального гриба Mucor circinelloides
Ферментативный гидролизат ЦСС Концентрация ВС, г/л Свободные клетки ИК
Этанол, г/л Выход, % Этанол, г/л Выход, %
Пшеничной соломы 42,G±G,5 9,G±G,4 42,G±i,G i3,i±G,2 6i,G±G,5
Сосновых обессмоленных опилок 6G,G±2,G ii,G±i,G 36,G±2,G i3,5±G,5 44,G±2,G
Свекловичной багассы 36,G±i,G S,G±G,4 43,G±G,5 9,7±G,3 53,G±G,5
Кукурузных стеблей 46,G±2,G iG,6±G,2 45,G±i,G i3,S±G,5 5S,G±i,G
Рисовой соломы 4G,G±i,G iG,5±G,3 5i,G±i,G i4,G±G,i 6S,G±i,G
Осиновых опилок 54,G±2,G 6,G±G,5 2i,G±2,G i3,G±G,3 46,G±2,G
Концентрация сахаров в различных средах определялась методом жидкостной хроматографии высокого давления (хроматограф Agilend 1100 с амперометрическим детектором, США), с применением анионообменного носителя Бюпех Саг-Ьорак РА-20. Раствор 7,5 мМ №ОИ применялся в качестве элюента. Концентрация этанола определялась методом газовой хроматографии на хроматографе «Кристалюкс 4000 М» с пламенноионизационным детектором (ПИД). В качестве газа-носителя использовался азот. Температура термостата-колонок была 190оС, детектора и испарителя по 240 и 260оС, соответственно.
Изучалась возможность конверсии глюкозы, содержащейся в различных отходах промышленности и сельского хозяйства после их ферментативной обработки, для получения этанола ИК термотолерантных дрожжей (табл. 1).
Было показано, что во всех протестированных образцах ферментализатов ЦСС. разработанный биокатализатор в виде ИК термотолерантых дрожжей успешно функционировал, обеспечивая выход целевого продукта, превышающий 80%. Максимальная концентрация этанола (21,5 г/л) была получена в пробах при использовании в качестве субстрата ферментативного гидролизата сосновых опилок. При этом выход этанола от теоретически возможного уровня составил 85 %. Максимальный выход этанола был в случае использования в качестве субстрата гидролизата пшеничной соломы (92,0 %), это означало, что практически вся глюкоза была конвертирована
непосредственно в целевой продукт.
Как и в случае с ИК дрожжей, для биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток ми-целиального гриба были проведены исследования по конверсии ферментализатов различного ЦСС в этанол (табл. 2). В качестве контроля эффективности функционирования ИК использовались нативные клетки мицелиального гриба M. circinelloides. Следует отметить, что в полученных ферментали-затах ЦСС помимо глюкозы содержались ксилоза и арабиноза, поэтому выход этанола рассчитывался исходя из концентрации всех восстанавливающих сахаров (ВС), содержащихся в ферментативных гидролизатах ЦСС.
Сравнительный анализ эффективности функционирования свободных клеток и биокатализатора на основе ИК мицелиального гриба M. circinel-loides в процессе получения этанола показал, что концентрация накапливающегося целевого продукта при использовании ИК за один и тот же период времени в 1,2-2,2 раз выше (табл. 2), чем у свободных.
Таким образом, была показана высокая эффективность получения биоэтанола из разнообразных отходов промышленности и сельского хозяйства с использованием биокатализаторов на основе клеток дрожжей и мицелиальных грибов, иммобилизованных в криогель ПВС.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (контракт № 11-04-93002 Вьета»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nigam P.S. Production of liquid biofuels from renewable resources / Nigam P.S., Singh A // Progr Energ Combust Sci, 2011. - V. 37. - P. 52-68.
2. BalatM. Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway: a review // Energ Convers Manag, 2011. - V. 52. - P. 858-875.
3. Palmqvist E. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II. inhibitors and mechanisms of inhibition / Palmqvist E., Hahn-Hagerdal B. // Bioresour Technol, 2000. - V.74. - P. 25-33.
4. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола. / Ефременко Е.Н. [и др.] // Катализ в промышленности, 2010. -T. 5. - С. 70-76.
5. Millati R. Performance of Rhizopus, Rhizomucor and Mucor in ethanol production from glucose, xylose, and wood hydrolyzates./ Millati R., Edebo L., Taherzadeh M.J. //Enz Microb Technol, 2005. -V.36. - P. 294-
300.
6. Ethanol production from hexoses, pentoses, and dilute-acid hydrolyzate by Mucor indicus./ Sues A. [et al] // FEMS, 2005. -V.5. - P. 669-676.
7. Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора / Ефременко Е.Н. [и др.] // Патент РФ на изобретение № 2253677, 2002.
8. Способ получения иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков. // Ефременко Е.Н. [и др.]. // Патент РФ на изобретение № 2322499, 2008.
□Авторы статьи:
Степанов Николай Алексеевич, канд.техн.наук, младший научный сотрудник (Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН) Email: [email protected]
Сенько Ольга Витальевна, научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ, младший научный сотрудник Института биохимической физики им.
Н.М. Эмануэля РАН ЕтаД:8епко@епгуте.сЬет.т8и.га;
Ефременко Елена Николаевна, докт.биол.наук, проф., зав. лаб. «Экобиокатализа» каф. химической энзимологии МГУ, в.н.с. Института биохимической физики им. Н.М.
Эмануэля РАН ЕтаП:е!епа_е1хетепко@Н81т,
УДК 579.66
О.В. Сенько, Н.А.Степанов, О.В. Маслова, И.В. Лягин, Е.Н. Ефременко
РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО
СЫРЬЯ
В настоящее время разработка энерго- и ресурсосберегающих технологий для целей химической отрасли является весьма актуальной. Частным случаем таких технологий является использование микроорганизмов - продуцентов коммерчески значимых продуктов для трансформации различных отходов пищевой, деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства.
Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов в различных процессах весьма привлекательно благодаря возможному значительному увеличению длительности использования одной и той же биомассы продуцента, повышению устойчивости клеток к негативным факторам, упрощению стадии отделения биомассы от культуральной жидкости [1].
Фумаровая кислота нашла широкое применение в различных областях: в пищевой промышленности в качестве регулятора кислотности, в медицине при лечении псориаза, для получения янтарной и яблочных кислот, в химической промышленности для получения различных полиэфиров, алкидных смол, пластификаторов. В настоящее время промышленный синтез фумаровой кислоты происходит с участием малеиновой кислоты и катализаторов в водных растворах при низких значениях рН. Альтернативой такому методу получения может служить биотехнологический способ, осуществляемый путем трансформации углеводсодержащих субстратов (моносахаров) в фумаровую кислоту под действием мицелиальных грибов рода Rhizopus. Использование в качестве субстратов целлюлозосодержащих отходов дере-
вообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства должно обеспечить улучшение экономической и экологической составляющих процесса получения конечного продукта.
Данная работа была направлена на реализацию процесса получения фумаровой кислоты из различных ферментативных гидролизатов целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) под действием биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae.
Материалы и методы
В работе в качестве продуцента фумаровой кислоты использовался мицелиальный гриб R. oryzae F - 1032(ВКПМ).
Биокатализатор в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба R. oryzae был получен согласно ранее разработанной методике [2].
Ферментативные гидролизаты ЦСС (100 г с.в./л) получены путем обработки измельченной пшеничной соломы и осиновых опилок коммерческими препаратами целлюлаз (Sigma, США) в расчете 6 мг/г субстрата в течение 48 ч при 55°С.
Концентрация глюкозы в них определялась с использованием стандартного набора реагентов (Импакт, Россия).
Концентрацию фумаровой кислоты, накапливающейся в среде, определяли с использованием набора стандартных реагентов (Abcam, Англия).
Концентрация внутриклеточного АТФ в иммобилизованных клетках R. oryzae определялась биолюминесцентным люциферин-люцеферазным методом , описанным ранее [3].
