Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

300.

6. Ethanol production from hexoses, pentoses, and dilute-acid hydrolyzate by Mucor indicus./ Sues A. [et al] // FEMS, 2005. -V.5. - P. 669-676.

7. Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора / Ефременко Е.Н. [и др.] // Патент РФ на изобретение № 2253677, 2002.

8. Способ получения иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков. // Ефременко Е.Н. [и др.]. // Патент РФ на изобретение № 2322499, 2008.

□Авторы статьи:

Степанов Николай Алексеевич, канд.техн.наук, младший научный сотрудник (Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН) Email: baltazar8181@mail.ru

Сенько Ольга Витальевна, научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ, младший научный сотрудник Института биохимической физики им.

Н.М. Эмануэля РАН ЕшаД:8епко@еп2уше.сЬеш.ш8и.га;

Ефременко Елена Николаевна, докт.биол.наук, проф., зав. лаб. «Экобиокатализа» каф. химической энзимологии МГУ, в.н.с. Института биохимической физики им. Н.М.

Эмануэля РАН ЕшаП:е1епа_е1хешепко@Н81ги,

УДК 579.66

О.В. Сенько, Н.А.Степанов, О.В. Маслова, И.В. Лягин, Е.Н. Ефременко

РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО

СЫРЬЯ

В настоящее время разработка энерго- и ресурсосберегающих технологий для целей химической отрасли является весьма актуальной. Частным случаем таких технологий является использование микроорганизмов - продуцентов коммерчески значимых продуктов для трансформации различных отходов пищевой, деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства.

Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов в различных процессах весьма привлекательно благодаря возможному значительному увеличению длительности использования одной и той же биомассы продуцента, повышению устойчивости клеток к негативным факторам, упрощению стадии отделения биомассы от культуральной жидкости [1].

Фумаровая кислота нашла широкое применение в различных областях: в пищевой промышленности в качестве регулятора кислотности, в медицине при лечении псориаза, для получения янтарной и яблочных кислот, в химической промышленности для получения различных полиэфиров, алкидных смол, пластификаторов. В настоящее время промышленный синтез фумаровой кислоты происходит с участием малеиновой кислоты и катализаторов в водных растворах при низких значениях рН. Альтернативой такому методу получения может служить биотехнологический способ, осуществляемый путем трансформации углеводсодержащих субстратов (моносахаров) в фумаровую кислоту под действием мицелиальных грибов рода Якгюрш'. Использование в качестве субстратов целлюлозосодержащих отходов дере-

вообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства должно обеспечить улучшение экономической и экологической составляющих процесса получения конечного продукта.

Данная работа была направлена на реализацию процесса получения фумаровой кислоты из различных ферментативных гидролизатов целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) под действием биокатализатора в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба Rhizopus oryzae.

Материалы и методы

В работе в качестве продуцента фумаровой кислоты использовался мицелиальный гриб R. oryzae F - 1032(ВКПМ).

Биокатализатор в виде иммобилизованных клеток мицелиального гриба R. oryzae был получен согласно ранее разработанной методике [2].

Ферментативные гидролизаты ЦСС (100 г с.в./л) получены путем обработки измельченной пшеничной соломы и осиновых опилок коммерческими препаратами целлюлаз (Sigma, США) в расчете 6 мг/г субстрата в течение 48 ч при 55°С.

Концентрация глюкозы в них определялась с использованием стандартного набора реагентов (Импакт, Россия).

Концентрацию фумаровой кислоты, накапливающейся в среде, определяли с использованием набора стандартных реагентов (Abcam, Англия).

Концентрация внутриклеточного АТФ в иммобилизованных клетках R. oryzae определялась биолюминесцентным люциферин-люцеферазным методом , описанным ранее [3].

112

О.В. Сенько, Н.А.Степанов, О.В. Маслова, И.В. Лягин, Е.Н. Ефременко

0,4

ей

Н

О

4

О

5 *

§

я

о

л

й

0,3

0,2

0,1

0 -V

5 6 Цикл

10

Накопление фумаровой кислоты в средах с ферментативными гидролизатами различного растительного сырья: ■ - пшеничной соломы, □ - осиновых опилок.

Результаты и обсуждения

Для исследования возможности трансформации ферментативных гидролизатов ЦСС в качестве субстрата использовалась пшеничная солома и опилки осины, представляющие собой отходы сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности. Концентрация глюкозы в них составляла, соответственно, для пшеничной соломы составила 34,8±0,1 г/л, а для осиновых опилок - 39,7±0,1 г/л.

Культивирование иммобилизованных клеток Я. огугав осуществлялось при 32 °С и использовании концентрации биокатализатора в питательной среде равной 65 г/л, Продолжительность цикла культивирования иммобилизованных клеток 48ч, после этого биокатализатор в отделялся от культуральной жидкости и в реактор с иммобилизованными клетками Я. огугав подавалась свежая питательная среда (ферментативные гидролизаты) аналогичного состава (рис.).

Общая продолжительность культивирования иммобилизованных клеток Я. огугав составила 480

ч. За время использования биокатализатора было отмечено снижение его продуктивности на 11,4±0,2%. По окончании каждого цикла контролировалась концентрация внутриклеточного АТФ в иммобилизованных клетках, как одного из показателей, свидетельствующих об их физиологиче-

ском состоянии. Было установлено, что уровень данного параметра колебался в пределах одного порядка, что подтверждало уровень метаболической активности иммобилизованных клеток мице-лиального гриба Я. огугав на протяжении всего процесса использования для получения фу-маровой кислоты из ферментативных гидролизатов ЦСС. Более низкие концентрации накапливающегося конечного продукта были отмечены при использовании в качестве субстрата осиновых опилок (рис.).

Как видно из таблицы, полученные в данной работе результаты по выходу фумаровой кислоты соответствуют лучшим мировым аналогам, однако использование продуцента в иммобилизованном виде для трансформации гидролизатов ЦСС позволяет более, чем в 2 раза (в зависимости от источника сырья) увеличить срок использования клеток мицелиального гриба Я. огугав, взятых не в свободном, а в иммобилизованном виде.

Таким образом, была продемонстрирована возможность использования иммобилизованных клеток мицелиального гриба Я. огугав для реализации ресурсосберегающего процесса получения фумаровой кислоты из ферментативных гидролизатов ЦСС.

Работа выполнена при финансовой поддержке Президиума РАН (программа фундаменталь-

4

Таблица. Основные характеристики процесса получения фумаровой кислоты из ферментативных _______________________________________гидролизатов ЦСС________________________________________

Клетки Сырье Максимальный выход фумаровой кислоты, г/г субстрата Длительность применения, ч Ссылка

Я. отуїае Навоз, содержащий включения ЦСС 0,31 90 [4]

Я. аггкіїш' Древесина эвкалипта 0,35 230 [5]

Я. рогшоїа Жом маниоки 0,22 24 6]

Я. отуїае (генно -модифицированный штамм) Кукурузная солома 0,35 120 [7]

Я. отуїае (иммобилизованные) Пшеничная солома, осиновые опилки 0,35 480 Данная работа

ных исследований №3 «Энергетические аспекты ляемого глеродсодержащего сырья»). глубокой переработки ископаемого и возобнов-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола. / Ефременко Е.Н. [и др.] // Катализ в промышленности, 2010. - T. 5. - С.70-76.

2. Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора / Ефременко Е.Н. [и др.] // Патент РФ на изобретение № 2253677, 2002.

3. Rhizopus oryzae fungus cells producing L(+)-lactic acid: kinetic and metabolic parameters of free and PVA-cryogel-entrapped mycelium./ Efremenko E.N. [et al] // Appl Microb Biotech, 2006. -V.72. - P.480-485.

4. Co-production of fumaricacid and chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material - dairy manure -using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC 20344 / Liao W. [et al] //Bioresour Technol, 2008. - V. 99. - P. 5859-5866.

5. Fermentative production of fumaric acid from Eucalyptus globulus wood hydrolyzates / Rodriguez-Lopez. [et al] // J Chem Technol Biotech, 2012. -V. 87. - P. 1036-1040.

6. Production of fumaric acid by fermentation of enzymatic hydrolysates derived from cassava bagasse / Carta F.S. [et al] // Bioresour Technol, 1999. - V. 68. - P. 23-28.

7. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production. / Xu Q. [et al] // Bioresour Technol, 2010. - V. 101. - P. 6262-6266.

□Авторы статьи:

Сенько Ольга Витальевна, научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ, мл. научн. сотр. Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН ЕшаД:8епко@еп2уше.сЬеш.ш8и.га

Степанов Николай Алексеевич, канд.техн.наук, младший научный сотрудник (Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН) Email: baltazar8181@mail.ru

Лягин Илья Владимирович, к.х.н., старший научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ Email: lyagin@mail.ru

Маслова Ольга Васильевна, младший научный сотрудник каф. химической энзимологии МГУ Email: olga-still@mail.ru

Ефременко Елена Николаевна, докт.биол.наук, проф., зав. лаб. «Экобиокатализа» каф. химической энзимологии МГУ, в.н.с. Института биохимической физики им. Н.М.

Эмануэля РАН Email:elena_efremenko@list.ru

УДК 579.695

Ф. Т. Мамедова, А.Б. Никольская, Е.Н. Ефременко

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СТОЧНЫХ ВОД ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

В настоящее время биомасса микроводорослей представляет большой интерес как один из ценных источников возобновляемого сырья для получения различных коммерчески значимых продуктов, используемых в химической, нефтехимической и пищевой промышленностях [1]. Для культивирования микроводорослей обычно используют синтетические минеральные среды. Однако при использовании таких сред себестоимость получаемой биомассы оказывается достаточно высокой, поскольку требует использования различных реактивов, их взвешивания, растворения, транспортировки к месту наращивания микроводорослей. Одним из способов удешевления производства является комплексное использование полученной биомассы, ее глубокая трансформация в

различные конечные продукты. Другим способом повышения экономической эффективности представляется выращивание клеток на сточных водах, загрязненных различными соединениями, способными выполнять роль биогенов для микроводорослей. Это позволит удешевить питательную среду и решить проблему очистки сточных вод и накопления целевой биомассы. В этой связи актуальна разработка методов культивирования микроводорослей как концентраторов биогенных элементов, содержащихся в сточных водах.

Целью данной работы являлось исследование возможности использования сточных вод для накопления биомассы микроводорослей на примере зеленой микроводоросли Chlorella vulgaris С-1.