CC BY
13
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АРАНОЗЫ, ЦИСПЛАТИНА
И ПАКЛИТАКСЕЛА В МОНОРЕЖИМЕ И В СОЧЕТАНИИ НА АКТИВНОСТЬ PD-L1 И PD-L2 В КЛЕТКАХ МЕЛАНОМЫ
А.А. Рудакова, В.А. Мисюрин, А.В. Пономарёв, О.С. Бурова, А.В. Мисюрин, М.А. Барышникова
ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Анна Андреевна Рудакова RudakovaAn93@yandex.ru
Введение. В настоящее время для лечения рака применяются следующие подходы: хирургическое удаление опухоли, химиотерапия, таргетная терапия и иммунотерапия. Комбинирование препаратов различных классов позволяет добиться большего терапевтического эффекта по сравнению с их применением в монорежиме. Более того, могут наблюдаться и другие эффекты, в том числе изменение уровня экспрессии белков PD—L1 и PD—L2, важных мишеней чекпойнт-терапии. Цель исследования — оценить влияние аранозы, цисплатина и паклитаксела в монорежиме или в комбинации на изменение уровня экспрессии мРНК и белков PD—L1 и PD—L2 в клеточных линиях меланомы и сопоставить результат со степенью дифференцировки клеток и наличием или отсутствием мутаций.
Материалы и методы. Исследования проводили на клеточных линиях меланомы человека, полученных из опухолевого материала больных. Уровень экспрессии генов PD—L1 и PD—L2 оценивали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В реакции иммунофлуоресценции оценивали экспрессию белков PD—L1 и PD—L2. Данные анализировали методами корреляционного анализа и медианного теста.
Результаты. Уровень экспрессии гена PD—L2 прямо коррелировал со степенью дифференцировки клеток (коэффициент Пирсона 0,937, p <0,15). Активность гена PD—L1 и белков PD—L1 и PD—L2 не связана со степенью дифференцировки, а также не зависит от наличия мутаций гена TP53. PD—L2 экспрессируется на меньшем уровне в клеточных линиях, имеющих мутации гена BRAF (p = 0,0117). Интересно, что мутации в гене TP53 наблюдаются при наличии мутаций BRAF (коэффициент Пирсона 1, p <0,15). Воздействие аранозы привело к увеличению уровня экспрессии гена PD—L1 (p = 0,23). Инкубация с цисплатином в комбинации с паклитакселом также приводила к увеличению уровня экспрессии белка PD—L1 (p = 0,037). Цисплатин и паклитаксел в монорежиме не оказывали влияния на экспрессию белка PD—L1. Уровень экспрессии гена и белка PD—L2 снижался под действием любого препарата, но статистически незначимо (р = 0,6). Выводы. Исследованные препараты практически не оказывают влияния на уровень экспрессии PD—L1 и PD—L2 как на уровне белка, так и на уровне мРНК. Из этого следует, что сочетание анти-PD терапии и противоопухолевых препаратов, таких как паклитаксел и араноза, потенциально не снизит эффективность чекпойнт-терапии и может иметь большие перспективы применения в будущем при создании протоколов комбинированной терапии.
Ключевые слова: меланома, PD—L1, PD—L2, араноза, цисплатин, паклитаксел
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-4-71-80
THE EFFECTS OF ARANOSE, CISPLATIN OR PACLITAXEL IN MONOTHERAPY AND IN COMBINATION ON THE EXPRESSION OF PD-L1 AND PD-L2 IN MELANOMA CELLS
A.A. Rudakova, V.A. Misyurin, A. V. Ponomarev, O. S. Burova, A. V. Misyurin, M.A. Baryshnikova
N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Introduction. Currently, the following approaches are used for cancer treatment: surgical tumor removal, chemotherapy, targeted therapy and immunotherapy. The combination of different drugs may have additional advantages due to cumulative effect. Moreover, some additional effects like changes in PD—L1 and PD—L2 expression levels may be observed.
Aim. The aim of this study was to determinate the influence of aranose, cisplatin orpaclitaxel and their combination on the expression of mRNA level and proteins PD—L1 and PD—L2 in melanoma cell lines and to compare the results with the differentiation status and with the appearance of mutations in melanoma cells.
Materials and methods. Melanoma cell lines used in this study were derived from surgical species of patients with disseminated melanoma. The mRNA expression level of PD—L1 and PD—L2 genes was measured by RQ-PCR. The expression of PD—L1 and PD—L2 proteins was measured by flow cytometry. The Pearson's correlation and median test were used for statistical analysis. Results. The expression level of PD—L2gene was correlated with melanomas cell's differentiation status (Pearson's coefficient 0.937, p <0.15). The expression levels of PD—L1 gene and PD—L1 and PD—L2 proteins were not correlated with differentiation status of melanoma cells as well as TP53 mutations. In case of BRAF mutations the expression of PD—L2 was low detectable (p = 0.0117).
72
Оригинальные статьи
It is worth noting that the TP53 mutations were associated with BRAFmutations (Pearson's coefficient 1, p <0.15). The exposure of cells to aranose led to increased PD—L1 gene expression (p = 0,23). Incubation with cisplatin in combination with paclitaxel also resulted in an increase in PD—L1 protein expression (p = 0.037). Cisplatin or paclitaxel had no effect on the expression of PD—L1 protein. The expression level of PD—L2 gene and protein decreased under the action of any of these two drugs: these data are statistically (p = 0.6).
Conclusion. The tested drugs had no effect on the expression of PD—L1 and PD—L2 both at the protein level and at the mRNA level. It follows that the combination of anti-PD therapy and anticancer drugs, such as paclitaxel and aranose, will not potentially reduce the effectiveness of checkpoint therapy, and may have great prospects for future use in the creation of combined therapy protocols.
Key words: melanoma, PD—L1, PD—L2, aranose, cisplatin, paclitaxel
Введение
Меланома — агрессивная неоплазия, вызванная злокачественной трансформацией меланоцитов, пиг-ментгенерирующих клеток кожи, которая является причиной 75 % всех смертей, связанных с раком кожи. Меланома фенотипически и молекулярно-не-однородное заболевание, выделяют кожные, увеаль-ные, акральные и слизистые меланомы. Они имеют разные варианты клинических проявлений, лечения и прогноза, так как обладают различными мутационными профилями и различными факторами риска. Меланома кожи характеризуется наибольшим числом мутаций по сравнению с другими солидными опухолями [1, 2]. Идентифицированы онкогенные мутации BRAF (около 50 %), NRAS (около 15-20 %), c-Kit (около 2 %) и нуклеотид Guanine (GNAQ / GNA11) (около 50 % случаев увеальной меланомы) [3]. Идентификация этих молекулярных аномалий при мела-номе имеет значение для развития таргетной терапии [4].
Мутация в гене BRAF - наиболее распространенное событие, встречающееся примерно в половине случаев меланомы. Самыми распространенными онкогенными мутациями BRAF в меланоме являются BRAFV600E и BRAFV600K, представляющие 80-90 и 10-20 % всех мутаций BRAF соответственно [5, 6]. Киназы BRAFV600E и BRAFV600K — конститутивно активные, поддерживают передачу сигнала по MAPK-каскаду и стимулируют рост клеток. Фенотипически BRAFV600E и BRAFV600K придают агрессивное поведение клеткам меланомы [7, 8], а их наличие у больного коррелирует с неблагоприятным прогнозом [6].
Идентификация мутаций BRAF в опухолях мела-номы привела к разработке направленных на MAPK-каскад малых молекул — ингибиторов киназ, в частности ингибиторов BRAF и MEK. Блокируя сигнальный путь MAPK, эти агенты значительно улучшили выживаемость пациентов с мутацией BRAFV600, что привело к внедрению в клиническую практику вему-рафениба в 2011 г., дабрафениба и траметиниба в 2013 г. в США [9—11]. По разным данным, соматические мутации гена BRAF выявляются в 40—88 % случаев при местно-распространенных и метастатических формах меланомы [12]. И хотя больные, не
имеющие мутации BRAF, не могут получать анти-BRAF-терапию, для них возможны другие способы лечения.
Еще один перспективный метод лечения злокачественных новообразований — иммунотерапия [13—15]. PD-1 (белок запрограммированной гибели клеток/ programmed cell death-1) экспрессируется на поверхности активированных Т-лимфоцитов [16, 17]. Ассоциация PD-1 с лигандами приводит к инактивации Т-клеток. Известны 2 лиганда PD-1: PD—L1 и PD— L2 [18]. В физиологических условиях PD—L1 экс-прессируется на иммунных клетках, включая дендритные клетки (DCs), а также на негемопоэтических клетках [19], а PD—L2 экспрессируется лишь на активированных макрофагах и дендритных клетках [20]. Взаимодействие рецептора с лигандом PD—L1 на опухолевых клетках и клетках опухолевого микроокружения приводит к иммуносупрессии и подавлению противоопухолевого иммунного ответа [21—24]. Поэтому блокирование либо иммунного контрольного белка PD-1, либо его лигандов PD—L1 и/или PD—L2 — это новые стратегии противоракового лечения, которые уже доказали свою эффективность [25]. Однако к блокаторам PD-1 в некоторых случаях развивается резистентность [26]. Долгосрочные ответы на анти-PD-1-терапию наблюдались у 30—35 % пациентов с метастатической меланомой [27].
Несмотря на эти достижения, использование представленных подходов, а также химиопрепаратов в качестве монотерапии имеет значительные ограничения. Возрастает интерес к использованию комбинаций препаратов, так как ожидается взаимное усиление их лекарственного эффекта [28].
Иммунотерапия эффективна при разных типах опухолей, и поэтому сочетание химиотерапии с ингибиторами PD-1 может, во-первых, уменьшить токсическую нагрузку на организм, во-вторых, усилить противоопухолевый ответ путем воздействия на опухоль иммунных клеток и, в-третьих, непосредственно воздействовать на стромальные клетки опухоли. Выбор химиотерапевтического средства и время для применения комбинаций будет иметь большое значение, поскольку многие цитотоксические химиопрепараты нацелены на быстрое деление клеток [29].
Лечение ингибиторами BRAF улучшает противоопухолевый иммунный ответ на меланому, возможно, путем увеличения перекрестного представления антигенов из мертвых опухолевых клеток [30, 31]. Развитие резистентности к ингибиторам BRAF сопровождается увеличением уровня экспрессии PD—L1 на клетках меланомы [32]. Исследования с использованием мышиной модели с мутацией BRAFV600E показали, что блокада PD-1 или PD—L1 в сочетании с ингибированием BRAF увеличивает активность опухолеинфильтрирующих лимфоцитов и опосредует более продолжительную выживаемость [33]. На основе данных наблюдений в настоящее время ведутся клинические испытания, в которых оцениваются комбинации блокаторов PD-1 с ингибиторами BRAF, такими как вемурафениб (NCT01656642) или дабрафениб (Tafinlar; GlaxoSmithKline) [34]. Но даже такие комбинации оказались неидеальными. По этой причине классические цитотоксические препараты остаются актуальными, так как их тоже можно сочетать и с анти-PD1-терапией, и друг с другом.
Цисплатин, цисплатина или цис-диаммин-дихлорплатина (II) является хорошо известным хи-миотерапевтическим лекарственным средством. Он используется для лечения многочисленных онкологических заболеваний человека, включая рак мочевого пузыря, головы и шеи, легких, яичников и яичек. Эффективен при различных видах рака, включая карциномы, опухоли зародышевых клеток, лимфомы и саркомы. Однако из-за развития резистентности к цисплатину и многочисленных нежелательных побочных эффектов, таких как почечная недостаточность, аллергические реакции, снижение иммунитета к инфекциям, желудочно-кишечные расстройства, кровоизлияние и потеря слуха, особенно у более молодых пациентов, другие платиновые лекарственные средства, такие как карбоплатин, оксалиплатин и проч., стали чаще применяться в противоопухолевой терапии [35].
Начальная чувствительность к препаратам платины — высокая, но у большинства больных в конечном счете происходит рецидив заболевания, резистентного к цисплатину. Следовательно, лекарственная устойчивость развивается у многих пациентов. Для преодоления резистентности цисплатин обычно используется в сочетании с некоторыми другими препаратами [36].
К достоинствам цисплатина, помимо его эффективности, относится то, что механизм его противоопухолевой активности отличается от токсичности других противоопухолевых препаратов [37]. В связи с этим комбинированная химиотерапия с цисплати-ном стала основой для лечения многих видов рака.
Паклитаксел занимает особое место среди эффективных противоопухолевых химиопрепаратов.
Он характеризуется высокой терапевтической активностью при лечении рака молочной железы, яичников, головы и шеи, а также успешно применяется в случае злокачественных новообразований, не поддающихся традиционной химиотерапии [38].
Паклитаксел относится к цитотоксическим агентам таксана и к числу наиболее часто назначаемых химиотерапевтических средств в онкологии. Пакли-таксел является естественным экстрактом, полученным из коры тихоокеанского тисового дерева (Taxus brevifolia), который стал коммерчески доступным в 1992 г. Препарат препятствует сборке микротрубочек, способствует полимеризации тубулина в высокостабильные структуры, тем самым нарушает митоз и в конечном итоге приводит к гибели опухолевых клеток [39—42].
Частота положительных ответов во II фазе клинических испытаний таксанов варьирует от 3,3 до 17 %. Сочетания таксанов с платиновыми и другими химиопрепаратами продемонстрировали частоту ответа от 12 до 41 %, что свидетельствует о том, что они более эффективны в комбинированной химиотерапии. Таксаны, как в качестве отдельных агентов, так и в комбинации, могут быть вариантом лечения для некоторых пациентов с метастатической меланомой [43].
Еще одним химиопрепаратом, применяемым для лечения метастатической меланомы, является ара-ноза, разработанная в НИИ ЭДиТО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России [44—49]. Общая эффективность монотерапии арано-зой при лечении диссеминированной меланомы кожи составила 20,6 % [50].
В настоящее время сочетания химиопрепаратов с анти-PD—L! и PD—L2 интенсивно изучаются при опухолях разных локализаций и молекулярных подтипов. В связи с этим актуальным вопросом остается влияние различных сочетаний химиопрепаратов на уровень экспрессии PD—L1 и PD—L2, мишеней для чекпойнт-терапии.
Материалы и методы
Клеточные линии
Исследования проводили на клеточных линиях меланомы человека mel Mtp, mel Z, mel Kor, mel Ibr, mel P, mel Is, mel Me, mel H, mel Hn, mel Bgf, mel Si, mel Rac, mel Gus, mel Gi, mel Ksen, mel Ch, mel Il, mel R, полученных из опухолевого материала больных, проходивших лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России [51]. Клеточные линии различались по степени дифференциров-ки и наличию или отсутствию мутаций генов BRAF и ТР53 [52—54]. Клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % сыворотки эмбриона теленка, 2мМ L-глутамина (Sigma, США),
74 Оригинальные статьи
пенициллин (25 000 Ед) — стрептомицин (25 000 мкг), Выделение РНК из предварительно обработан-пируват натрия, 0,1 % раствор аминокислот и 0,1 % ных образцов производилось по протоколу, предло-раствор витаминов при +37 °C в атмосфере 5 % СО2. женному P. Chomczynski и N. Sacchi [55]. Подготов-Культуры клеток пересевали через 3—4 дня. ленный клеточный материал лизировали в 0,5 мл гуанидин-тиоционатного буфера (4 моль тиоционата МТТ-тест гуанидина, 25 ммоль цитрата натрия, 0,5 % N-лау-В МТТ-тесте изучали цитотоксическое действие рил-саркозината натрия и 0,1 моль меркаптоэтано-на клеточные линии противоопухолевых препаратов: ла). Во время лизиса материал пропускали через иглу аранозы, цисплатина и паклитаксела. Препараты 19G не менее 20 раз. Далее в пробирку добавляли добавляли как в монорежиме, так и в комбинации. 0,5 мл водонасыщенного фенола (pH 5,2) и 0,125 мл Клетки вносили в 96-луночные плоскодонные раствора ацетата натрия (pH 4,2), встряхивали и до-планшеты по 7 х 103 клеток в 180 мкл ростовой среды бавляли 0,25 мл хлороформа. Полученную смесь на лунку. Через 24 ч в лунки с клетками добавляли по встряхивали до молочно-белого цвета и центрифуги-20 мкл препаратов. Аранозу добавляли в концентрациях ровали в течение 10 мин при 12 000 об/мин и охлаж-125, 250 и 500 мкг/мл. Для цисплатина и паклитаксела дении до +4 °C. После центрифугирования отбирали было выбрано по 9 концентраций с 2-кратным шагом 0,65 мл верхней водной фазы, содержащей клеточную разведения: 0,39—100 мкг/мл и 1,171—300 мкг/мл. РНК, и смешивали с 0,65 мл изопропанола. Инкуби-Клетки инкубировали с препаратами в течение рование РНК в изопропаноле проводилось в течение 24 ч при +37 °С и 5 % СО2. После инкубации в ка- 20 ч при температуре —20 °C. После инкубирования ждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин (1 мг/мл, Sigma, Chemical Co, США) и оставляли еще при 12 000 об/мин, удаляли супернатант и 2 раза про-на 4 ч при +37 °C при 5 % СО2. По окончании инку- мывали в 80 % этаноле. После промывок осадок РНК бации планшеты центрифугировали, отбирали супер- высушивали в термостате в течение 20 мин при натант и вносили в лунки по 150 мкл диметилсульфок- +37 °С, растворяли в 20 мкл деионизованной воды сида (ПанЭко, Россия) для растворения кристаллов и измеряли концентрацию раствора. формазана, после чего планшеты встряхивали на шей- Для синтеза кДНК с использованием ревертазы кере для равномерного распределения окрашивания. брали 2 мкг мРНК, выделенной на предыдущем этапе. Оптическую плотность раствора формазана опреде- Реакцию обратной транскрипции проводили с ис-ляли на фотометрическом анализаторе иммунофер- пользованием фермента RevertAid Transcriptase и ком-ментных реакций «Multiscan EX» (ThermoLabsystems, мерческого набора реактивов (Fermentas, США) Германия) при длине волны 540 нм. Величина погло- в условиях, предложенных фирмой-производителем. щения прямо пропорциональна числу живых клеток. Для отжига использовали смесь случайных гексаме-Процент живых клеток вычисляли по формуле: ров («Синтол», Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления N0 = Nj / N2 • 100 %, РНК. Пробу доводили до конечного объема 165 мкл деионизованной водой. где Ng — процент живых клеток; Nj — средняя оптическая плотность в лунках, содержащих клетки и пре- Количественная полимеразная цепная реакция парат; N2 — средняя оптическая плотность в кон- в реальном времени трольных лунках, содержащих только клетки. Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили с использованием Подготовка клеточного материала 2-кратной реакционной смеси (40 ммоль трис-HCl, и выделение общей РНК 100 ммоль KCl, 4 ммоль MgCl2, 1 ммоль каждого из Клетки снимали с культуральных флаконов 0,02 % 4 дезоксирибонуклеотидов и 0,2 ммоль ß-меркапто-раствором Версена объемом 2 мл, содержащим этанола) и Taq-полимеразы (Fermentas, США). В ка-0,25 % трипсина. Клетки находились в трипсине 2 мин ждую пробу было добавлено 5 мкл кДНК, 250 нмоль при постоянном наблюдении за их состоянием с по- прямого и 250 нмоль обратного праймера и 140 нмоль мощью микроскопа. Добавляли 10 мл буфера STE флуоресцентного зонда. Подбор праймеров и флуо-(0,1 моль NaCl, 1 моль Трис-HCl pH 8,0, 1 ммоль ресцентных зондов проводили с использованием этилендиаминтетрауксусной кислоты) и центрифу- программы Vector NTI 10 на основе данных нуклео-гировали в течение 5 мин при 800 об/мин. Удаляли тидных последовательностей генов PD—L1 и PD—L2, супернатант, а клеточный осадок ресуспендировали доступных на интернет-ресурсе PubMed (http://www. в 5 мл 0,9 % физиологического раствора и центрифу- ncbi.nlm.nih. gov/pubmed). гировали в течение 5 мин при 1200 об/мин. Из полу- В каждом образце был исследован уровень экс-ченного осадка клеток далее выделяли РНК. прессии генов PD—L1 и PD—L2. Уровень экспрессии
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 4'2018 том 17 | vol. 17
рассчитывали количественно относительно уровня экспрессии гена ABL.
Данный эксперимент проводили на приборе DTlite («ДНК-технология», Россия).
Программа проведения реакций была следующей: предварительная обработка в течение 5 мин при +94 °C и 45 циклов денатурации в течение 10 с при +94 °C с последующим отжигом праймеров и синтезом в течение 12 с при +60 °C.
Для детекции флуоресценции был выбран канал Hex. Измерения велись по общепризнанной методике относительно гена ABL, уровень экспрессии которого был принят за 100 % [56]. В качестве положительного контроля использовали векторы pET-15b, экспрессирующие клонированные геномные последовательности. Правильность синтезированных оли-гонуклеотидных последовательностей подтверждена секвенированием по Сэнгеру на анализаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).
Реакция иммунофлуоресценции
После 24 ч инкубации с исследуемыми препаратами клетки снимали с культуральных флаконов раствором Версена и 2 раза отмывали в PBS. Разносили в пробирки по 50 мкл и добавляли по 20 мкл антител к PD-L1 (CD274FITC, 558065, BD Phar-mingen™) и к PD-L2 (CD273APC, 557926, BD Phar-mingen™). Инкубировали в течение 30 минут, после чего дважды отмывали в PBS. Подсчет проводили на проточном цитофлуориметре FACSCantoII, с использованием программного обеспечения FACSDiva (Bekton Dikenson).
Анализ данных
Для статистического анализа данных использовались непараметрические критерии. Для определения связи между цитотоксичностью препаратов и наличием мутаций в генах BRAF и TP53 или степенью дифференцировки клеток, между наличием мутаций в генах BRAF и TP53 и уровнем экспрессии PD—L1 и PD—L2, а также для сравнения цитотокси-ческой активности различных комбинаций препаратов и связи этих препаратов с уровнем экспрессии PD—L1 и PD—L2 на уровне белка и мРНК использовался критерий Манна—Уитни. Для изучения корреляции между уровнем экспрессии генов PD—L1 и PD—L2 и степенью дифференцировки клеток вычислялся коэффициент корреляции Пирсона.
Результаты
Для определения эффективных концентраций исследуемых препаратов изучили их цитотоксиче-скую активность на линиях клеток меланомы человека с помощью МТТ-теста, по результатам которого рассчитывали IC50 — концентрацию, при которой
детектировали ингибирование метаболической активности 50 % клеток (см. таблицу).
Определение чувствительности клеток меланомы человека к цитотоксическому действию препаратов показало, что при сопоставлении величины IC50 с наличием мутаций генов BRAF или TP53 связь не выявлена (p >0,5 во всех случаях). Высокодиффе-ренцированные линии несколько более чувствительны к препаратам, так как для достижения IC50 требовалась меньшая концентрация препаратов (p = 0,154). IC50 комбинации цисплатина с пакли-такселом и паклитаксела в монорежиме не различаются (p = 0,431).
Определен уровень экспрессии поверхностных белков PD—L1 и PD—L2 в клеточных линиях метастатической меланомы человека (рис. 1). Активность белков PD—L1 и PD—L2 не связана со степенью дифференцировки, а также не зависит от наличия мутаций гена TP53. Наличие мутации BRAF в клеточных линиях меланомы человека связано с меньшим уровнем экспрессии PD—L2 (p = 0,0117). Инкубация цисплатина в комбинации с паклитакселом также увеличивает уровень экспрессии белка PD—L1 (p = 0,037). Цисплатин и паклитаксел в монорежиме не оказывают влияния на экспрессию белка PD—L1. Уровень экспрессии белка PD—L2 несколько снижается под действием любого препарата, но статистически незначимо (p = 0,609).
Также был определен уровень экспрессии мРНК PD—L1 и PD—L2 (рис. 2). Уровень экспрессии PD—L2 прямо коррелировал со степенью дифференцировки клеток (коэффициент Пирсона 0,937,p <0,15), а активность гена не связана со степенью дифференци-ровки. Наличие гена TP53 не оказывает никакого влияния на экспрессию генов PD—L1 и PD—L2. Интересно, что мутации в гене TP53 наблюдаются в случае мутаций гена BRAF (коэффициент Пирсона 1, p <0,15). Араноза незначимо повышает уровень экспрессии мРНК PD—L1 в линиях меланомы (p = 0,23).
Заключение
Согласно полученным нами результатам мутации генов BRAF или TP53 не оказывают влияния на чувствительность к препаратам, представленным в исследовании. Степень дифференцировки клеток также оказывает незначимое влияние. Из этого следует, что паклитаксел, цисплатин и аранозу можно применять независимо от наличия мутаций BRAF или TP53.
Комбинация цисплатина с паклитакселом по проявленной цитотоксичности может не обладать особыми преимуществами по сравнению с паклитак-селом в монорежиме. Не удалось обнаружить каких-то признаков, при которых применение цисплатина с паклитакселом одновременно могло бы быть полезным в клинической практике, так как паклитаксел
76
Оригинальные статьи
Наличие мутаций в клеточных линиях меланомы и IC50 аранозы, цисплатина и паклитаксела, а также сочетания цисплатина и паклитаксела
Клеточные линии Мутации BRAF Мутации ТР53 Араноза, IC50, мкг Цисплатин, IC50, мкг Паклитаксел, IC50, мкг Сочетание цисплатина и паклитаксела, 1С50, мкг
Mel BGF Нет - 2000 - - -
Mel Ch Нет Нет 1300 - - -
Mel Gus Нет Нет 2000 8,4 14,2 3,62
Mel H Нет - 1800 - - -
Mel Hn V600E Р15^ и S240F 1500 12,5 2,9 3,54
Mel Ibr V600E Е171А 2000 6,6 10 3,82
Mel Il V600K Нет 1900 8 9,7 1,42
Mel Is V600E Нет 1300 28 11 3,12
Mel Kor Нет Нет 500 - - -
Mel Ksen V600E - 2000 - - -
Mel Me Нет - 2000 11,4 8,6 2,00
Mel Mtp Нет - 2000 - - -
Mel P V600E - 1000 - - -
Mel R V600E - 1500 - - -
Mel Rac Нет Нет 1250 3,3 2,1 1,08
Mel Si L597Q - 1350 - - -
Mel Z V600E - 800 - - -
Mel Gi V600E Нет 1550 - - -
Примечание. «Нет» — отсутствует экспрессия;«—» нет данных.
70
60
50
40
20
10
I 0
3
2 £
I
Q
I
Q
^ 1=
I
Q
Рис. 1. Уровень экспрессии белков РО—Ы и РО—Ь2, подвергнутых воздействию различными химиопрепаратами
< о
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
о
а.
>
20
10
-1- -1-1-1-1-
-J- □
Г51 _j m □ пп
с
о
С
О
I
Q
I
Q
I
Q
I
Q
Рис. 2. Уровень экспрессии генов PD—L1 и PD—L2, подвергнутых воздействию различными химиопрепаратами
0
в монорежиме менее токсичен для организма больного в целом.
С опухолью взаимодействуют не только химио-препараты, но и иммунная система. Мы показали, что наличие мутаций в гене BRAF несколько снижает экспрессию PD—L2. Это открывает новые возможности лечения, так как больные, имеющие мутации BRAF, могут получать таргетную терапию не только против киназы BRAF, но и анти-PD-терапию.
Исследованные препараты практически не оказывают влияния на уровень экспрессии PD—L1 и PD—L2
как на уровне белка, так и на уровне мРНК. Из этого следует, что сочетание анти-PD-терапии и противоопухолевых препаратов, таких как паклитаксел и ара-ноза, потенциально не снизит эффективность чек-пойнт-терапии, и может иметь большие перспективы.
Таким образом, при терапии больных сочетанием цисплатина и паклитаксела можно порекомендовать использование ингибиторов взаимодействия PD-1 и PD—Ls. Возможно, лучше не включать в терапию паклитаксел из-за опасности ухода опухоли от иммунного ответа.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Berger M.F., Hodis E., Heffeman T.P. et al. Melanoma genome sequencing reveals frequent PREX2 mutations. Nature 2012;485(7399):502-6. PMID: 22622578.
DOI: 10.1038/nature11071.
2. Pleasance E.D., Cheetham R.K., Stephens P.J. et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature 2010;463(7278):191-6.
PMID: 20016485. DOI: 10.1038/nature08658.
3. van den Hurk K., Niessen H.E., Veeck J. et al. Genetics and epigenetics
of cutaneous malignant melanoma: a concert out of tune. Biochim Biophys Acta 2012;1826(1):89-102. PMID: 22503822. DOI: 10.1016/j.bbcan.2012.03.011.
4. Sosman J.A., Kim K.B., Schuschter L. et al. Survival in BRAF V600-mutant advanced melanoma treated with vemurafenib. N Engl J Med 2012;366(8):707-14. PMID: 22356324. DOI: 10.1056/NEJMoa1112302.
5. Jakob J.A., Bassett R.L. Jr., Ng C.S. et al. NRAS mutation status is an independent prognostic factor
in metastatic melanoma. Cancer
2012;118(16):4014-23. PMID: 22180178. DOI: 10.1002/cncr. 26724.
6. Long G.V., Menzies A.M., Nagrial A.M. et al. Prognostic and clinicopathologic associations of oncogenic BRAF
in metastatic melanoma. J Clin Oncol
2011;29(10):1239-46.
PMID: 21343559.
DOI: 10.1200/Jc0.2010.32.4327.
7. Klein R.M., Aplin A.E. Rnd3 regulation of the actin cytoskeleton promotes melanoma migration and invasive outgrowth in three dimensions. Cancer Res 2009;69(6):2224-33. PMID: 19244113. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-08-3201.
78 Оригинальные статьи
8. Arozarena I., Sanchez-Laorden B., Packer L. et al. Oncogenic BRAF induces melanoma cell invasion by downregulating the cGMP-specific phosphodiesterase PDE5A. Cancer Cell 2011;19(1):45—57. PMID: 21215707. DOI: 10.1016/j.ccr.2010.10.029.
9. Zelboraf® (Vemurafenib) US prescribing information 2014. Genentech USA, Inc. South San Francisco, CA [Электронный ресурс]. URL: http://www.gene. com/download/pdf/zelboraf_ prescribing.pdf.
10. Tafinlar® (Dabrafenib) US prescribing information 2014. GlaxoSmithKline. Research Triangle Park, NC [Электронный ресурс]. URL: http://us.gsk.com/ products/assets/us_tafinlar. pdf.
11. Mekinist® (Trametinib) US prescribing information 2014. GlaxoSmithKline. Research Triangle Park, NC [Электронный ресурс]. URL: http://us.gsk.com/ products/assets/us_mekimst. pdf.
12. Davies H., Bignell G.R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002;417(6892):949-54. PMID: 12068308. D0I:10.1038/nature00766.
13. Ключагина Ю.И., Соколова З.А., Барышникова М.А. Роль рецептора PD1 и его лигандов PDL1 и PDL2 в иммунотерапии опухолей. Онкопедиатрия 2017;4(1):49-55.
DOI: 10.15690/onco.v4i1.1684. [Klyuchagina Y.I., Sokolova Z.A., Baryshnikova M.A. Role of PD-1 Receptor and Its Ligands PD—L1 and PD—L2 in Cancer Immunotherapy. Onkopediatriya = Oncopediatrics 2017;4(1):49-55. (In Russ.)].
14. Чкадуа Г.З. Подходы к иммунотерапии опухолей. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(1):118. [Chkadua G.Z. Approaches to Cancer Immunotherapy. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2016;15(1):118 (In Russ.)].
15. Барышникова М.А., Кособокова Е.Н., Косоруков В.С. Неоантигены в иммунотерапии опухолей. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(2):6—14.
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-2-6-14 . [Baryshnikova M.A., Kosobokova E.N., Kosorukov V.S. Neoantigens in tumor immunotherapy Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(2):6—14. (In Russ.)].
16. Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., Honjo T. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J 1992;11:3887-95.
PMID: 1396582.
DOI:10.1002/j.1460-2075.1992. tb05481. .
17. Пономарев А.В., Мисюрин В.А., Рудакова А.А. и др. Изменение экспрессии PD-L1 и PD-L2 в клеточных линиях меланомы человека при воздействии различных лекарственных форм аранозы и «пустых» липосом. Российский биотерапевтический журнал 2017;16(2):74-81. DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-7 4-81. [Ponomarev A.V., Misyurin V.A., Rudakova A.A. et al. The influence
of aranoza drug formulations and "empty" liposomes on the expression of PD-L1 и PD-L2 in human melanoma cell lines. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(2):74-81. (In Russ.)].
18. Pedoeem A., Azoulay-Alfaguter I., Strazza M. et al. Programmed death-1 pathway in cancer and autoimmunity. Clin Immunol 2014;153(1):145-52. PMID:24780173. DOI:10.1016/j.clim.2014.04.010.
19. Francisco L.M., Sage P.T., Sharpe A.H. The PD-1 pathway in tolerance and auto-immunity. Immunol Rev 2010;236:219-42. PMID: 20636820.
DOI: 10.1111/j.1600-065X.2010.00923.x.
20. Ishida M., Iwai Y., Tanaka Y. et al. Differential expression of PD-L1 and PD-L2, ligands for an inhibitory receptor PD-1, in the cells
of lymphohematopoietic tissues. Immunol Lett 2002;84(1):57-62. PMID: 2161284.
DOI: 10.1016/s0165-2478(02)00142-6.
21. Shin D.S., Ribas A. The evolution of checkpoint blockade as a cancer therapy: what's here, what's next? Curr Opin Immunol 2015;33:23-35. PMID: 25621841.
DOI: 10.1016/j.coi.2015.01.006.
22. Рудакова А.А., Пономарев А.В., Бурова О.С. и др. Изменение уровня экспрессии лигандов белка PD1
в клетках линий меланомы человека после воздействия субстанции и ли-посомальной лекарственной форм аранозы Российский биотерапевтический журнал 2017;16(1):68. [Rudakova A.A., Ponomarev A.V., Burova O.S. et al. Change of PD1 ligands expression level after Aranose substance and liposomal drug formulation in melanoma cell lines. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(1):68. (In Russ.)].
23. Рудакова А.А., Мисюрин В.А., Пономарев А.В. и др. Возможность моделирования активности маркеров PD-L1 и PD-L2 на поверхности кле-
ток меланомы. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(спецвы-пуск): 64. [Rudakova A.A., Misyurin V.A., Ponomarev A.V. et al. Modulation of PD-L1 and PD-L2 activity on melanoma cells. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(Special Issue): 64. (In Russ.)].
24. Intlekofer A.M., Thompson C.B. At the bench: preclinical rationale for CTLA-4 and PD-1 blockade as cancer immunotherapy. J Leukoc Biol 2013;94(1):25-39. PMID:23625198. DOI: 10.1189/jlb.1212621.
25. Iwai Y., Terawaki S., Honjo T. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol 2005;17(2):133-44. PMID: 15611321.
DOI: 10.1093/intimm/dxh194.
26. Жуликов Я.А., Фетисов Т.И., Самой-ленко И.В., Демидов Л.В. Механизмы резистентности метастатической меланомы кожи к анти-PD-! терапии. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):34-46.
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-134-46. [Zhulikov Ya.A., Fetisov T.I., Samoylenko I.V., Demidov L.V. Mechanisms of resistance to anti-PD-1 therapy in metastatic cutaneous melanoma Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(1):34-46. (In Russ.)].
27. Topalian S.L., Sznol M., McDermott D. F. et al. Survival, durable tumor remission, and long-term safety
in patients with advanced melanoma receiving nivolumab. J Clin Oncol 2014;32:1020-30. PMID: 24590637. DOI: 10.1200/JCO.2013.53.0105.
28. Wargo J.A., Reuben A., Cooper Z.A. et al. Immune effects of chemotherapy, radiation, and targeted therapy and opportunities for combination with immunotherapy. Semin Oncol 2015;42(4):601-16. PMID: 26320064. DOI: 10.1053/j.seminoncol.2015.05.007.
29. Postow M.A., Chasalow S.D., Yuan J. et al. Pharmacodynamic effect
of ipilimumab on absolute lymphocyte count (ALC) and association with overall survival in patients with advanced melanoma. J Clin Oncol 2013;31(15):abstr 9052.
30. Donia M., Fagone P., Nicoletti F. et al. BRAF inhibition improves tumor recognition by the immune system: potential implications for combinatorial therapies against melanoma involving adoptive T-cell transfer. Oncoimmunology 2012;1:1476-83. PMID: 23264894.
DOI: 10.4161/onci.21940.
31. Frederick D.T., Piris A., Cogdill A.P.
et al. BRAF inhibition is associated with enhanced melanoma antigen expression and a more favorable tumor microenvironment in patients with metastatic melanoma. Clin Cancer Res 2013;19:1225-31. PMID: 23307859. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-1630.
32. Jiang X., Zhou J., Giobbie-Hurder A. et al. The activation of MAPK
in melanoma cells resistant to BRAF inhibition promotes PD-L1 expression that is reversible by MEK and PI3K inhibition. Clin Cancer Res 2013;19:598-609. PMID: 23095323. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-2731.
33. Cooper Z.A., Juneja V.R., Sage P.T. et al. Response to BRAF inhibition
in melanoma is enhanced when combined with immune checkpoint blockade. Cancer Immunol Res 2014;2:643-54. PMID: 24903021. DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0215.
34. Ribas A., Hodi F.S., Callahan M. et al. Hepatotoxicity with combination
of vemurafenib andipilimumab. N Engl J Med 2013;368(14):1365-6. PMID: 23550685. DOI: 10.1056/NEJMc1302338.
35. Dasari S., Tchounwou P.B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. Europ J Pharm 2014;740:364-78. PMID: 25058905. DOI: 10.1016/j. ejphar. 2014.07.025P.
36. Gottesman M.M., Fojo T., Bates S.E. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters. Nat Rev 2002;2:48-58. PMID: 11902585. DOI: 10.1038/nrc706.
37. O'Dwyer P.J., Stevenson J.P., Johnson S.W. Clinical Pharmacokinetics and administration of established platinum drugs. Drugs 2000;59:19-27. PMID: 10864227. DOI: 10.2165/ 00003495-200059004-00003.
38. Мартынова М.А., Бушмакина И.М., Шуканова Н.А., Молчан М.М. Влияние нанолипосомальной формы паклитаксела на злокачественные опухоли женских репродуктивных органов. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(спецвыпуск):44. [Martynova M.A., Bushmakina I.M., Shukanova N.A., Molchan M.M. Effect of nanoliposomal Paclitaxel on tumors of female reproductive system. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(Special Issue):44. (In Russ.)].
39. Rowinsky E.K., Donehower R.C. Paclita xel(taxol). N Engl J Med 1995;332:1004-14.
PMID: 7885406.
DOI: 10.1056/NEJM199504133321507.
40. Cortes J.E., Pazdur R. Docetaxel. J Clin Oncol 1995;13(10):2643-55.
PMID: 7595719.
DOI: 10.1200/Jœ.1995.13.10.2643.
41. Gelmon K. The taxoids: paclitaxel and docetaxel. Lancet 1994;344:1267-72. PMID: 7967989. DOI:10.1016/s0140-6736(94)90754-4.
42. Von Hoff D.D., Ervin T., Arena F.P. et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.
N Engl J Med 2013;369:1691-703.
PMID: 24131140.
DOI: 10.1056/NEJMoa1304369.
43. Gogas H., Bafaloukos D., Bedikian A.Y. The role of taxanes in the treatment
of metastatic melanoma. Melanoma Res 2004;14:415-20. PMID: 15457099. DOI: 10.1097/00008390-200410000-00013.
44. Шпрах З.С., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В. Валидация методики количественного определения аранозы в лекарственной форме. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(спецвыпуск):84.
[Shprakh Z.S., Ignateva E.V., Yartceva I.V. Validation of the method of quantitative determination of Aranose in a dosage form. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(Special Issue): 84. (In Russ.)].
45. Шпрах З.С., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В. Разработка и валидация методики количественного определения аранозы в лекарственной форме. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(2):57-62.
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-2-5 7-62. [Shprakh Z.S., Ignateva E.V., Yartseva I.V. Development and validation of aranosa assay in the dosage form. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(2):57-62. (In Russ.)].
46. Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Бурова О.С. и др. Активация инициа-торных каспаз-8 и -9 под влиянием лекарственных форм аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(1):7. [Afanasieva D.A., Baryshnikova M.A., Burova O.S. et al. Activation of initiator caspase-8 and -9 by aranose drug formulations. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2016;15(1):7.
(In Russ.)].
47. Полозкова С.А., Горбунова В.А., Орел Н.Ф. Эффективность и токсичность комбинации аранозы и доксо-рубицином при метастатических ней-роэндокринных неоплазиях. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(1):88. [Polozkova S.A., Gorbunova V.A., Orel N.F. Effect and toxicity of Aranose and Doxorubicin combination on metastatic neuroendocrine tumors. Rossiysky
Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2016;15(1):88. (In Russ.)].
48. Полозкова С.А., Горбунова В.А., Делекторская В.В. и др. Факторы прогноза эффективности терапии нейроэндокринных новообразований режимами на основе Аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2017;16(1):38—46.
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-1-3 8-46. [Polozkova S.A., Gorbunova V.A., Delektorskaya V.V. et al. Prognostic factors of the efficacy of aranoza-bazed therapy in neuroendocrine neoplasms. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(1):38—46 (In Russ.)].
49. Пономарев А.В., Мисюрин В.А., Рудакова А.А. и др. Изменение экспрессии мРНК MDM2 и NFkB1
в клеточных линиях меланомы человека при воздействии 2 лекарственных форм аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2017;16(3):52—8. DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-3-5 2-58. [Ponomarev A.V., Misyurin V.A., Rudakova A.A. et al. The influence of drug formulations on the expression of MDM2 and NFkB1 mRNA in the melanoma cell lines Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2017;16(3):52—8. (In Russ.)].
50. Харкевич Г.Ю., Егоров Г.Н., Манзюк Л.В. и др. Отечественные нитрозопроизводные в лечении мела-номы кожи. Российский биотерапевтический журнал 2003;2(1):49—53. [Kharlevich G. Yu, Egorov G.N., Manzyuk L.V. et al. Russian nitrosoureas in skin melanoma therapy. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2003;2(1):49—53. (In Russ.)].
51. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы — основа для создания противоопухолевых вакцин. Вестник РАМН 2005;76:37—40. [Mikhailova I.N., Lukashina M.I., Baryshnikov A.Yu., et al. Melanoma cell lines as the basis for antitumor vaccine preparation. Bulletin of RAMS = Annals of the Russian academy of medical sciences 2005;7:37—40.(In Russ.).].
52. Михайлова И.Н., Ковалевский Д. А., Бурова О.С. и др. Экспрессия рако-во-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. Сибирский онкологический журнал 2010;37(1):29—39. [Mikhaylova I.N., Kovalevsky D.A.,
Burova O.S. Expression of Cancer Testis Antigens in Human Melanoma. Sibirskiy
oncologicheskii journal = Siberian journal of Oncology 2010;37(1):29-39. (In Russ.)].
2013;(3):68-72. (In Russ.)].
Soft Tissues and Skin Tumors
Journal of Biotherapy 2018;17(1):64-9. (In Russ.)].
53. Рябая О.О., Цыганова И.В.,
Сидорова Т.И. и др. Влияние активирующих мутаций V600 гена B-RAF на способность клеток меланомы к аутофагии. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи 2013;3:68-72. [Ryabaya O.O., Tsyganova I.V., Sidorova Т.А. et al. Effect of Activating V600 mutations of the B-RAF gene on the ability of melanoma cells to autophagy. Sarkomy kostey, myagkikh tkaney i opukholi kozhi = Sarkomas of Bones,
54. Пономарев А.В., Солодовник А.А., Мкртчян А.С. и др. Связь делеций и точечных мутаций гена р53 с резистентностью клеточных линий метастатической меланомы кожи к арано-зе. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(1):64-9. DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-164-69. [Ponomarev A.V., Solodovnik A.A., Mkrtchyan A.S. et al. Relationship between deletion and point mutations of p53 and drug resistance to aranoza in human melanoma cell lines. Rossiysky Bioterapevtichesky Zhurnal = Russian
55. Chomczynski P., Sacchi N. The singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;1(2):581-5. PMID: 2440339. DOI: 10.1006/abio.1987.9999.
56. Moore F.R., Rempfer C.B.,
Press R.D. Quantitative BCR-ABL1 RQ-PCR fusion transcript monitoring in chronic myelogenous leukemia. Methods Mol Biol 2013;999:1-23. PMID: 23666687.
DOI: 10.1007/978-1-62703-357-2_1.
ORCID авторов/ ORCID of authors
A.А. Рудакова/ A.A. Rudakova: https://orcid.org/0000-0001-7266-7689
B.А. Мисюрин/V.A. Misyurin: https://orcid.org/0000-0002-0762-5631 А.В. Пономарев/A.V. Ponomarev: https://orcid.org/0000-0001-9517-8183 О.С. Бурова/O.S. Burova: https://orcid.org/0000-0001-8897-0172
А.В. Мисюрин/A.V. Misyurin: https://orcid.org/0000-0003-1349-2879
М.А. Барышникова/M.A. Baryshnikova: https://orcid.org/0000-0002-6688-8423
конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
