CC BY
28
52
Оригинальные статьи
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ мРНК MDM2 И NFKB1 В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ДВУХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ АРАНОЗЫ
А.В. Пономарев, В.А. Мисюрин, А.А. Рудакова, О.С. Бурова, А.В. Мисюрин, М.А. Барышникова
ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Александр Васильевич Пономарев kl8546@yandex.ru
Введение. Проблема резистентности к противоопухолевым препаратам является серьезным препятствием для успешной химиотерапии опухолей. В ряде работ показано, что липосомальные формы противоопухолевых препаратов способны преодолевать множественную лекарственную устойчивость, но механизм, с помощью которого это происходит, до сих пор не известен. Одним из химиопрепаратов, применяемых для лечения меланомы, является араноза из класса нитрозомочевины — метилирующий ДНК агент.
Цель исследования — изучить воздействие лекарственных форм аранозы (липосомальной и «лиофилизата для приготовления раствора для инъекций» (араноза-лио)), а также пустых липосом на экспрессию мРНК р53, MDM2, NFkBl, NFkB2, MyD88 в опухолевых клетках.
Материалы и методы. Исследование проводили на 10 клеточных линиях метастатической меланомы человека, 4 из которых несли мутацию BRAF. Клеточные линии инкубировали 24 ч с лекарственными формами аранозы — аранозой-лио и липосомаль-ной, а также с пустыми липосомами. В количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени исследовали уровень экспрессии геновр53, MDM2, NFkBl, NFkB2, MyD88.
Результаты. Араноза-лио повышает экспрессию мРНКр53 незначительно и только на BRAF-положительных клетках, при этом статистически значимо (p = 0,0013) повышает экспрессию мРНКMDM2 — фактора резистентности опухоли к химиотерапии. Экспрессия мРНК белков NFkB2, MyD88 не отличалась при воздействии разных лекарственных форм аранозы и слабо отличалась от контроля. Липосомальная араноза повышает экспрессию мРНК NFkB1 — фактора гибели клеток в ответ на повреждение ДНК метилированием.
Выводы. Две лекарственные формы аранозы — липосомальная и араноза-лио — оказывают различное воздействие на внутриклеточные сигнальные пути в клетках метастатической меланомы. Араноза-лио запускает механизмы устойчивости к химиотерапии посредством повышения экспрессии мРНКMDM2. Липосомальная араноза, наоборот, запускает механизмы, способствующие чувствительности клеток к терапии, через повышение экспрессии мРНКNFkB1 — фактора гибели клеток в ответ на повреждение ДНК метилированием.
Ключевые слова: араноза, меланома, р53, MDM2, NFkB1
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-3-52-58
THE INFLUENCE OF DRUG FORMULATIONS ON THE EXPRESSION OF MDM2 AND NFKB1 mRNA IN THE MELANOMA CELL LINES
A. V. Ponomarev, V.A. Misyurin, A.A. Rudakova, O.S. Burova, A. V. Misyurin, M.A. Baryshnikova
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Introduction. Chemotherapy is an extremely ineffective and unsatisfactory means of treating malignant melanoma due to drug resistance, which is characteristic of this disease. A number of studies have shown that liposomal forms of anticancer drugs are able to overcome the multidrug resistance, but the mechanism by which this occurs is still remained to be elucidated. Aranoza (DNA-alkylating agent, a derivative of nitrosourea) has been approved for the treatment of patients with metastatic melanoma.
Objective: to examine the influence of liposomal aranoza as well as the empty liposomes and "liophilisate for the preparation of solution for injections" (aranoza-lio) on the expression of mRNA of p53, MDM2, NFkBl, NFkB2, MyD88.
Materials and methods. The study was performed with 10 melanoma cell lines, 4 of which carried the BRAF mutation. The level of p53, MDM2, NFkBl, NFkB2, MyD88 mRNA was investigated by quantitative polymerase chain reaction in real time. Results. Aranoza-lio increased slightly the expression of p53 mRNA in BRAF-mutated cells. We have observed also the increased expression of MDM2 mRNA (p = 0.0013). The expression of NFkB2, MyD88 mRNA did not change significantly as compared to control. Liposomal aranoza increased the expression of NFkB1 mRNA.
Conclusion. Based on the data obtained we conclude that the liposomal aranoza triggers the mechanisms that contribute to sensitivity of cells toward anticancer drugs while aranoza-lio favored the enhancing of the expression of MDM2 mRNA and increase the resistance to chemotherapy.
Key words: aranoza, melanoma, p53, MDM2, NFkB1
Оригинальные статьи
53
Введение
Химиотерапия — признанный метод лечения онкологических заболеваний, однако к противоопухолевым препаратам часто развивается лекарственная устойчивость, которая приводит к снижению терапевтического эффекта. Поиск способов преодоления лекарственной резистентности является актуальной задачей.
Известно, что липосомальные формы противоопухолевых препаратов способны преодолевать множественную лекарственную устойчивость [1, 2]. Однако механизм, с помощью которого это происходит, до сих пор не изучен. Возможно, липосомы вызывают гибель опухолевых клеток за счет воздействия на сигнальные пути, обеспечивающие защиту этих клеток, в частности на те, в которые вовлечены сигнальные белки р53 и NF-kB (nuclear factor-kappa B).
NF-kB является индуцибельным транскрипционным фактором, который регулирует экспрессию многих генов, участвующих в регуляции иммунного ответа, апоптоза, ангиогенеза и инвазии опухолевых клеток. Все эти функции указывают на важную роль NF-kB в развитии опухоли.
Механистически NF-kB способствует онкогене-зу, вызывая экспрессию различных генов, ответственных за выживание клеток, пролиферацию, миграцию, инвазию. Однако в ряде исследований показано, что высокая экспрессия субъединицы NFkBl, наоборот, может быть связана с противоопухолевыми эффектами [3]. Экспрессия мРНК NFkBl при многих гематологических заболеваниях примерно в 2 раза ниже по сравнению с образцами здоровых доноров. Клетки, в которых экспрессия NFkBl низкая, накапливают больше мутаций, индуцированных алкилированием, а у мышей с мутацией гена NFkBl лимфомы развиваются чаще, чем у животных с диким типом [4]. Кроме того, у мышей с мутацией гена NFkBl наблюдали склонность к хроническим воспалительным заболеваниям и повышенную восприимчивость к бактериальным инфекциям [5].
В исследовании [6] показано, что NFkBl является эффекторным белком цитотоксического ответа на повреждения ДНК через метилирование. Таким образом, высокая экспрессия NFkBl необходима для осуществления гибели клеток при повреждениях ДНК.
MyD88 (myeloid differentiation primary response gene (88)) — цитозольный адаптерный белок, участвующий в передаче сигнала от толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor, TLR) [7]. TLR2, TLR3 и TLR4 присутствуют на клетках меланомы человека и могут активировать белок MyD88 в ответ на воспалительные стимулы. Активация TLR на клетках ме-ланомы человека индуцируется воспалительными факторами. Экспрессия мРНК MyD88 при этом повышается примерно в 8 раз [8].
P53, «страж генома», является фактором транскрипции, который может связываться с промотор-ными участками сотен генов, где он либо активирует, либо подавляет экспрессию генов [9]. Таким образом, р53 служит опухолевым супрессором, вызывая остановку клеточного цикла, апоптоз, старение и репарацию ДНК [10]. В нормальных клетках p53 часто не обнаруживается из-за быстрого убиквити-нирования MDM2 и последующей протеасомной деградации [11]. Однако при повреждении ДНК и некоторых других стрессах, включая онкогенный стресс, количество р53 увеличивается из-за нарушения его деградации [12]. Примечательно, что инактивация р53 является одной из характеристик рака. Действительно, р53 обладает широким спектром типов мутаций, и примерно в половине всех опухолей р53 обнаруживается мутированным [13]. Еще одним механизмом ухудшения реакции р53 на онко-генный стресс может быть сверхэкспрессия MDM2 [14, 15]. Хотя мутация гена-супрессора опухоли p53 является общей чертой многих типов рака [16], мутационная инактивация p53 при меланоме встречается редко, а p53 дикого типа часто показывает высокие уровни экспрессии [17—19]. Кроме того, увеличение экспрессии p53 не является достаточным фактором для хорошего ответа на лечение меланомы [20]. Таким образом, можно предположить, что p53 дикого типа в меланоме не функционирует в качестве опухолевого супрессора [21].
К числу химиопрепаратов, применяемых для лечения метастатической меланомы, относятся и производные нитрозомочевины, в том числе араноза. Для лечения меланомы кожи зарегистрирована лекарственная форма аранозы «лиофилизат для приготовления раствора для инъекций» (араноза-лио). В лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина создана новая лекарственная форма аранозы — ли-посомальная [22, 23]. В исследованиях было показано, что липосомальная араноза in vitro оказывает воздействие на клеточные линии, устойчивые к ара-нозе-лио [24]. Было обнаружено, что лекарственные формы аранозы по-разному воздействуют на клетки меланомы [25, 26].
Целью исследования было изучение воздействия лекарственных форм (липосомальной и арано-зы-лио) препарата из класса нитрозомочевины ара-нозы на изменение экспрессии мРНК ключевых сигнальных белков опухолевых клеток.
Материалы и методы
Клеточные линии. Исследования проводили на 10 клеточных линиях метастатической меланомы кожи человека из банка клеточных культур лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии
54 Оригинальные статьи
опухолей НИИ ЭДиТО НМИЦ онкологии им. хлороформа. Полученную смесь встряхивали до мо-Н.Н. Блохина [27]. Клеточные линии различались лочно-белого цвета и центрифугировали в течение по степени дифференцировки и наличию или отсут- 10 мин при 12 000 об/мин и охлаждении до 4 °C. По-ствию мутаций BRAF [28—30]. Клеточные линии mel сле центрифугирования отбирали 0,65 мл верхней Hn, mel Ibr, mel Il, mel Is несут мутацию BRAF; mel водной фазы, содержащей клеточную РНК, и сме-Cher, mel H, mel Gus, mel Bgf, mel Me, mel Mtp — име- шивали с 0,65 мл изопропанола. Инкубирование ют BRAF дикого типа. Клеточные линии культиви- РНК в изопропаноле проводили в течение 20 ч при ровали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % телячь- температуре —20 °C. После инкубирования РНК ей эмбриональной сыворотки, 10 мМ HEPES, 2 мМ осаждали центрифугированием в течение 10 мин при L-глутамина, пенициллин (25 000 Ед) — стрептомицин 12 000 об/мин, удаляли супернатант и 2 раза промы-(25 000 мкг), пируват натрия, 0,1 % раствор амино- вали в 80 % этаноле. После промывок осадок РНК кислот и 0,1 % раствор витаминов, при 37 °C в атмос- высушивали в термостате в течение 20 мин при 37 °С, фере 5 % СО2 (полная среда). Клетки поддерживали растворяли в 20 мкл деионизованной воды и измеряв логарифмической фазе роста постоянным пересе- ли концентрацию раствора. вом культуры через 3—4 дня. Для синтеза кДНК с использованием ревертазы Противоопухолевые препараты. В исследовании брали 2 мкг матричной РНК, выделенной на преды-использованы две лекарственные формы аранозы: дущем этапе. Реакцию обратной транскрипции про- ♦ «лиофилизат для приготовления раствора для водили с использованием фермента RevertAid Reverse инъекций 500 мг» (араноза-лио) производства и коммерческого набора реактивов (Fermentas, США) филиала «Наукопрофи» НМИЦ онкологии им. в условиях, предложенных фирмой-производителем. Н. Н. Блохина; Для отжига применяли смесь случайных гексамеров ♦ липосомальная араноза, предоставленная лабо- («Синтол», Россия). В качестве отрицательного конт-раторией разработки лекарственных форм НИИ роля использовали рабочую смесь без добавления ЭДиТО НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. РНК. Пробу доводили до конечного объема 165 мкл Кроме того, исследовали воздействие на клетки деионизованной водой. пустых липосом тех же состава и концентрации, ко- количественная полимеразная цепная реакция торые использовались для липосомальной аранозы. (ПЦр) в реальном времени. Количественную ПЦР Клетки инкубировали с лекарственными форма- в реальном времени проводили с использованием ми аранозы в концентрации полумаксимального 2-кратной реакционной смеси (40 мМ трис-HCl, 100 мМ ингибирования (ИК50) и пустыми липосомами в те- KCl, 4 мМ MgCl2, 1 мМ каждого из 4 дезоксирибо-чение 24 ч. нуклеотидов и 0,2 мМ ß-меркаптоэтанола) и Taq Подготовка клеточного материала и выделение ДНК-полимеразы (Fermentas, США). В каждую пробу общей рнк. Клетки снимали с культуральных фла- было добавлено 5 мкл кДНК, 250 нМ прямого, 250 нМ конов 0,02 % раствором Версена объемом 2 мл, со- обратного праймера и 140 нМ флуоресцентного зонда. держащим 0,25 % трипсина. Клетки находились Подбор праймеров и флуоресцентных зондов провов трипсине 2 мин при постоянном наблюдении за их дили с использованием программы Vector NTI 10 на состоянием с помощью микроскопа. Добавляли 10 мл основе данных нуклеотидных последовательностей буфера STE (0,1 М NaCl, 1 М трис-HCl pH 8,0, 1 мМ геновр53, MDM2, NFkBl, NFkB2, MyD88, доступных этилендиаминтетраацетата) и центрифугировали на интернет-ресурсе http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ в течение 5 мин при 800 об/мин. Удаляли суперна- pubmed. тант, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл В каждом образце был исследован уровень экс-физиологического раствора и центрифугировали прессии анализируемых генов. Уровень экспрессии в течение 5 мин при 1200 об/мин. Из полученного рассчитывали количественно относительно уровня осадка клеток далее выделяли РНК. экспрессии гена ABL. Выделение РНК из предварительно обработан- Данный эксперимент проводили на приборе DTlite ных образцов проводили по протоколу, предложен- («ДНК-технология», Россия). Программа проведения ному P. Chomczynski и N. Sacchi [31]. Подготовленный реакций была следующей: предварительная обработ-клеточный материал лизировали в 0,5 мл гуани- ка в течение 5 мин при 94 °C и 45 циклов денатурации дин-тиоцианатного буфера (4 М тиоцианата гуани- в течение 10 с при 94 °C с последующим отжигом дина, 25 мМ цитрата натрия, 0,5 % N-лаурилсар- праймеров и синтезом в течение 12 с при 60 °C. козината натрия и 0,1 М меркаптоэтанола). Во время Для детекции флуоресценции был выбран канал лизиса материал пропускали через иглу 19G не менее Hex. Измерения велись по общепризнанной методи-20 раз. Далее в пробирку добавляли 0,5 мл водонасы- ке относительно гена ABL, уровень экспрессии кото-щенного фенола (pH 5,2) и 0,125 мл раствора ацетата рого был принят за 100 % [32]. Измерения уровня натрия (pH 4,2), встряхивали и добавляли 0,25 мл экспрессии проводили в 3 независимых повторах,
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 3'2017 том 16 |vol. 16
Оригинальные статьи 55
после чего для анализа было рассчитано среднее значение. В качестве положительного контроля использовали векторы pET-15b, экспрессирующие клонированные геномные последовательности. Правильность синтезированных олигонуклеотидных последовательностей подтверждена секвенированием по Сэн-геру на анализаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).
Статистический анализ данных. Для сравнения базового уровня экспрессии p53, MDM2, MyD88, NFkBl, NFkB2 между разными группами клеток линий мела-номы, различающихся по наличию мутаций гена BRAF, применяли однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Для сравнения эффектов, оказываемых различными формами аранозы на уровень экспрессии p53, MDM2, MyD88, NFkBl, NFkB2, был использован критерий Уилкоксона для связных выборок. Анализ был проведен в программе Statistica v. 7. Различия считали достоверными при уровне значимостиp <0,05.
Результаты
Изменение уровня экспрессии мРНК р53 и MDM2.
Перед изучением уровня экспрессии мРНК клеточные линии метастатической меланомы инкубировали 24 ч с исследуемыми препаратами: аранозой-лио (ИК50), липосомальной аранозой (ИК50), пустыми липосомами (<ИК10), в качестве контроля использовали необработанные клетки.
Араноза-лио вызвала 2-кратное повышение экспрессии мРНК р53 по сравнению с необработанными клетками (рис. 1). Липосомальная араноза и пустые липосомы в данной точке измерения не оказали влияния на экспрессию мРНК р53. Однако когда клетки разделили по наличию или отсутствию мутации BRAF, оказалось, что данная тенденция свойственна для BRAF-положительных клеток (рис. 2, а). В клеточных линиях с BRAF дикого типа экспрессия р53 при воздействии аранозы практически не менялась (рис. 2, б).
%
CQ О
%
1000
ш 200
m
О
Ü
>
Без Аранюза-ш0 Липосомальная Пустые обработки араноза липосомы
CQ
о
0%0
100
су Без Араноза-лио Липосомальная Пустые
обработки араноза липосомы
Рис. 1. Изменение уровня экспрессии мРНКр53 после воздействия исследуемыми препаратами
о р
>
Без обработки Араноза-лио Липосомаль- Пустые
ная араноза липосомы
Рис. 2. Изменения уровня экспрессии мРНК р53 после инкубации с исследуем ыми препаратами в зависимости от наличия мутации BRAF: а — клеточные линии с мутацией BRAF; б — клеточные линии с ВЯАЕ дикого типа
И зучили изменение уровня экспрессии мРНК МБМ2, который обычно повышается вслед за р53. Мы увидели, что уровень экспрессии МБМ2 повысился после инкубации со всеми исследуемыми лекар-ственн ыми формами, а также с пустыми липосомами, но статистически значимо было только повышение после воздействия аранозы-лио (р = 0,0013) (рис. 3). Возможно, это говорит о том, что р53 уже повышался в клетках, обработанных липосомальной аранозой или пустыми липосомами, а к моменту, когда были сняты данные результаты, снизился.
При разделении клеток в зависимости от наличия мутации BRAF оказалось, что, в отличие от результатов по р53, в группе клеток с BRAF дикого типа уровень экспрессии мРНК МБМ2 статистически значимо (р = 0,0304) повышался так же, как и в группе с BRAF-мутациями (рис. 4).
Существует много мнений по поводу причин повышенной экспрессии МБМ2 в опухолевых
а
400
б
56 Оригинальные статьи
Без обработки Араноза-лио Липосомаль- Пустые
ная араноза липосомы
Рис. 3. Изменение уровня экспрессии мРНКMDM2 после воздействия исследуемыми препаратами
Без обработки Араноза-лио Липосомаль-
ная араноза
%
%
220 200 180 1(50 140 120 Ю0
о
О.
>
Без обработки Араноза-лио Липосомаль- Пустые
ная араноза липосомы
Рис. 5. Изменение уровня экспрессии мРНКMyD88 после воздействия исследуемыми препаратами
CQ
о
140 120 100 80 60 40 20
о р
>
Без обработки Араноза-лио Липосомаль- Пустые
ная араноза липосомы
Без обработки Араноза-лио Липосомаль- Пустые
ная араноза липосомы
Рис. 4. Изменения уровня экспрессии мРНК MDM2 после инкубации с исследуемыми препаратами в зависимости от наличия мутации BRAF: а — клеточные линии с мутацией BRAF; б — клеточные линии с BRAF дикого типа
клетках. Но в данном случае можно предположить, что р53 позитивно регулирует экспрессию MDM2.
Рис. 6. Изменение уровня экспрессии мРНКNFkB2 после воздействия исследуемыми препаратами
Стоит отметить, что повышение MDM2 может способствовать резистентности к химиотерапии [33, 34].
Изменение уровня экспрессии мРНК MyD88, NFkB2 и NFkBl. На рис. 5 показано, что после воздействия лекарственных форм аранозы происходит небольшое повышение уровня экспрессии мРНК MyD88, которое говорит о том, что TLR задействованы слабо. Возможно, на них влияют компоненты умерших клеток.
Уровень экспрессии мРНК NFkB2 не сильно изменялся: снижался на 20 % после инкубации с ли-посомальной аранозой и повышался при воздействии пустых липосом (рис. 6).
Интересные данные получены при изучении изменения экспрессии мРНК NFkB1. Из рис. 7 видно, что липосомальная араноза вызывала многократное повышение уровня экспрессии NFkB1. В ряде исследований показано, что опухолевые клетки отличаются от нормальных пониженной экспрессией NFkB1, что помогает им в выживании [4]. В исследовании [6] было показано, что NFkB1 является эффек-торным белком цитотоксического ответа на повреждения ДНК через метилирование. Известно, что действие аранозы как производного нитрозомочевины
а
б
Оригинальные статьи
57
% 700
600
500
400
О >
Без обработки Араноза-лио Липосомаль-
ная араноза
Рис. 7. Изменение уровня экспрессии мРНК NFkB1 после воздействия исследуемыми препаратами
реализуется через метилирование ДНК. В ответ на метилирование ДНК NFkB1 вызывает ингибиро-вание экспрессии антиапоптотических генов, находящихся под контролем NFkB. Интересно, что мы наблюдаем эффект повышения экспрессии NFkB1 от липосомальной формы аранозы, а не от свободной
аранозы-лио. Возможно, этот аспект следует оценить в динамике. Можно предположить, что липосомаль-ная форма позволяет доставить большее количество аранозы непосредственно в ядро клетки, где реализуется наблюдаемый нами эффект, тогда как араноза в сво бодной форме частично взаимодействует с белками цитоплазмы и в меньшем количестве доходит до ядра.
3 аключение
Таким образ ом, из полученных резул ьтатов можно видеть, что 2 лекарственные формы аранозы — липо-сомальная и араноза-лио — оказывают различное воздействие на внутриклеточные сигнальные пути в клетках метастатической меланомы. Араноза-лио запускает механизмы устойчивости к химиотерапии через повышение экспрессии мРНК MDM2. Липо-сомальная араноза, наоборот, запускает механизмы, способствующие чувствительности клеток к терапии, через повышение экспрессии мРНК NFkB1 — фактора гибели клеток в ответ на повреждение ДНК.
и 300
1= 200
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Грищенко Н.В., Альбассит Б., Барышникова М.А. и др. Сравнение цитотоксического действия лекарственных форм противоопухолевых препаратов из класса нитрозомочевины. Российский биотерапевтический журнал 2014;13(1):41-53.
2. Шоуа И.Б., Полозкова А.П., Оборотова Н.А. и др. Действие липо-сомального доксорубицина на клетки линии, экспрессирующие активный Pgp170. Российский биотерапевтический журнал 2004;3(1):20-3.
3. Cartwright T., Perkins N.D.,
L Wilson C. NFKB1: a suppressor of inflammation, ageing and cancer. FE BS J 2016;283(10):1812-22. DO I: 10.1111/febs.13627. PMID: 26663363.
4. Voce D.J., Schmitt A.M., Uppal A. et al. Nfkbl is a haploinsufficient DNA damage-specific tumor suppressor. Oncogene 2015;34(21):2807-13.
DOI: 10.1038/onc.2014.211. PMID: 25043302.
5. Ishikawa H., Claudio E., Dambach D. et al. Chronic inflammation and susceptibility to bacterial infections
in mice lacking the polypeptide (p) 105 pre cursor (NF-kappaBl) but expressing p50. J Exp Med 1998;187(7):985-96. PM ID: 9529315.
6. Schmitt A.M., Crawley C.D., Kang S.
et al. p50 (NF-kB1) is an effector protein in the cytotoxic response to DNA methylation damage. Mol C ell 2011;44(5):785-96. DOI: 10.1016/j.molcel.2011.09.026. PMID: 22152481.
7. Lu Y.C., Yeh W.C., Ohashi P.S. LPS/ TLR4 signal transduction pathway. Cytokine 2008;42(2):145-51.
DOI: 10.1016/j.cyto.2008.01.006. PMID: 18304834.
8. Goto Y., Arigami T., Kitago M. et al. Activation of Toll-like receptors 2, 3, and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors.
Mol Cancer Ther 2008;7(11):3642-53. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-08-0582. PMID: 19001446.
9. Копнин Б.П., Копнин П.Б., Хромова Н.В. и др. Многоликий р53: разнообразие форм, функций, опу-хольсупрессирующих и онкогенных активностей. Клиническая онкогема-тология 2008;1(1):2-9.
10. Green D.R., Chipuk J.E. p53 and metabolism: Inside the TIGAR. Cell 2006;126(1):30-2.
DOI: 10.1016/j.cell.2006.06.032. PMID: 16839873.
11. Blagosklonny M.V. Loss of function and p53 protein stabilization. О ncogene 1997;15(16):1889-93.
DOI: 10.1038/sj.onc.1201374. PMID: 9365234.
12. Lavin M.F., Gueven N. The complexity of p53 stabilization and activation. Cell Death Differ 2006;13(6):941-50. DOI: 10.1038/sj.cdd.4401925. PMID: 16601750.
13. Roemer K. Mutant p53: gain-of-func-tion oncoproteins and wild-type p53 inactivators. Biol Chem 1999;380(7-8): 879-87. DOI: 10.1515/BC.1999.108. PMID: 10494837.
14. Houben R., Hesbacher S., Schmid C.P. et al. High-level expression of wild-type p53 in melanoma cells is frequently associated with inactivity in p53 reporter gene assays. PLoS One 2011;6(7):e22096. DOI: 10.1371/journal.pone.0022096. PMID: 21760960.
15. Michael D., Oren M. The p53 and Mdm2 families in cancer. Curr Opin Genet Dev 2002;12(7):53-9. PMID: 11790555.
16. Soussi T., Beroud C. Assessing TP53 status in human tumours to evaluate clinical outcome. Nat Rev Cancer 2001;1(3):233-40.
DOI: 10.1038/35106009. PMID: 11902578.
17. Gwosdz C., Scheckenbach K., Lieven O. et al. Comprehensive analysis of the p53 status in mucosal and cutaneous melanomas. Int J Cancer
58
Оригинальные статьи
2006;118(3):577—82. DOI: 10.1002/ijc.21366. PMID: 16094622.
18. Sparrow L.E., Soong R., Dawkins H.J. et al. p53 gene mutation and expression in naevi and melanomas. Melanoma Res 1995;5(2):93-100. PMID: 7620345.
19. Soto J.L., Cabrera C.M., Serrano S., Lopez-Nevot M.A. Mutation analysis of genes that control the G1/S cell cycle in melanoma: TP53, CDKN1A, CDKN2A, and CDKN2B.
BMC Cancer 2005;5:36. DOI: 10.1186/1471-2407-5-36. PMID: 15819981.
20. Li W., Sanki A., Karim R.Z. et al.
The role of cell cycle regulatory proteins in the pathogenesis of melanoma. Pathology 2006;38(4):287-301. DOI: 10.1080/00313020600817951. PMID: 16916716.
21. Avery-Kiejda K.A., Bowden N.A., Croft A.J. et al. P53 in human melanoma fails to regulate target genes associated with apoptosis and the cell cycle and may contribute to proliferation.
BMC Cancer 2011;11:203. DOI: 10.1186/1471-2407-11-203. PMID: 21615965.
22. Козеев Г. С. Разработка липосомаль-ной лекарственной формы противоопухолевого препарата араноза. Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. М., 2013.
23. Козеев С.Г., Барышникова М.А., Полозкова С.А., Оборотова Н.А. Разработка наноструктурированной
липосомальной формы аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2012;11(2):24.
24. Козеев С.Г., Барышникова М.А., Афанасьева Д.А. и др. Сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2012;11(2):24.
25. Афанасьева Д.А., Мисюрин В. А., Пономарев А.В. и др. Изменение уровня экспрессии гена CD95/FAS в клетках линий меланомы под воздействием липосомальной аранозы. Российский биотерапевтический журнал 2016;15(3):34-9.
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-3-34-39.
26. Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Хоченкова Ю.А. и др. Липосомальная араноза не индуцирует аутофагию. Российский биотерапевтический журнал 2015;14(1):15—8.
27. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы — основа для создания противоопухолевых вакцин. Вестник РАМН 2005;7:37-40.
28. Рябая О.О., Цыганова И.В., Сидорова Т.И. и др. Влияние активирующих мутаций V600 гена B-RAF на способность клеток меланомы
к аутофагии. Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи 2013;3:68-72.
29. Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. et al. Detection of BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11 and MAP2K1/2 mutations in Russian
melanoma patients using LNA PCR clamp and biochip analysis. Oncotarget 2017;8:52304-20. DOI: 10.18632/oncotarget.17014. PMID: 28455977.
30. Михайлова И.Н., Ковалевский Д.А., Бурова О.С. и др. Экспрессия рако-во-тестикулярных антигенов в клетках меланомы человека. Сибирский онкологический журнал 2010;37(1):29-39.
31. Chomczynski P., Sacchi N.
The singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: Twenty something years on. Nat Protoc 2006;1(2):581-5. PMID: 17406285.
32. Moore F.R., Rempfer C.B.,
Press R.D. Quantitative BCR-ABL1 RQ-PCR fusion transcript monitoring in chronic myelogenous leukemia. Press Methods Mol Biol 2013;999:1-23. DOI: 10.1007/978-1-62703-357-2_1. PMID: 23666687.
33. Hientz K., Mohr A., Bhakta-Guha D. et al. The role of p53 in cancer drug resistance and targeted chemotherapy. Oncotarget 2017;8(5):8921-46. DOI: 10.18632/oncotarget.13475. PMID: 27888811.
34. Buolamwini J.K., Addo J., Kamath S. et al. Small molecule antagonists
of the MDM2 oncoprotein as anticancer agents. Curr Cancer Drug Targets 2005;5(1):57-68. DOI: 10.2174/1568009053332672. PMID: 15720190.
