CC BY
85
УД»: 616-006.81-033.2:576.367:575.224 0.0. Рябая1'2. Т.А. Сидорова1. А.Н. Иншаков1. Э.Ш. Соломко1. Е.В. Степанова1 МОДУЛЯЦИЯ АУТОФАГИИ ВЛИЯЕТ НА ИИТОТОКСИЧНОСТЬ ПАКЛИТАКСЕЛА НА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
1ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина». Москва
2ГБОУВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Москва Контактная информация:
Оксана Олеговна Рябая. младший научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследовании НИИ ЭДиТО Адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, д. 24; тел. +7(499)612-86-70 e-mail: oxa2601 @vandex.ru
Статья поступила 17.11.2014, принята к печати 24.11.2014.
Резюме
ММ характеризуется низкой чувствительностью к химио- и биотерапии вследствие высокой резистентности к апоптозу. Мы оценили значимость модуляции аутофагии (блокирования или индукции) для изменения цитотоксичности паклитаксела клеточных линиях ММ с разным статусом гена B-RAF in vitro. Мутации в гене B-RAF определяют уровень аутофагии в клетках ММ in vitro. B-RAFVÖ00-линии были резистентны к действию паклитаксела, однако их комбинация с хлорокином синергично увеличивала цитотоксичность препарата. Хотя B-RAF^-KreTKH ММ были более чувствительны к паклитакселу, добавление ингибитора не влияло на гибель клеток. Изучение механизмов феномена показало вовлечение апоптоза.
Ключевые слова: метастатическая меланома, аутофагия, апоптоз, химиорезистентность, генетические мутации.
O.O. Ryabaya1'2, A.N. Inshakov1, T.A. Sidorova1, E.Sh. Solomko1, A.V. Egorova2, E.V. Stepanova1 MODULATION OF AUTOPHAGY AFFECTS CYTOTOXICITY OF PACLITAXEL ON CUTANEOUS MELANOMA CELL LINES OF SKIN IN VITRO
1FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow
2FBSU Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow
Abstract
MM is characterized by low sensitivity to chemotherapy and biotherapy because of its high resistance to apop-tosis. We evaluated the significance of the autophagy modulation (blocking or induction) cytotoxicity change of Pacli-taxel on 11 cell lines of MM with different B-RAF gene status in vitro. Cytotoxicity was determined by MTT assay, cell death by flow cytometry. Detection of mRNA expression Beclin1 performed by RT-PCR. Mutations in the B-RAF gene determine the level of autophagy in MM cells in vitro. B-RAFV600 lines were resistant to Paclitaxel and autophagy inhibition by chloroquine increased cytotoxicity of the taxane up to 40-50%. Although B-RAFWT MM cells were more sensitive to Paclitaxel, the addition of inhibitor had no effect on cell death. Investigation of the mechanisms of the phenomena showed the involvement of apoptosis process.
Key words: metastatic melanoma, autophagy, apoptosis, chemoresistance, genetic mutations.
Введение
Метастатическая меланома кожи является одним из наиболее агрессивных типов злокачественных опухолей с неблагоприятным прогнозом течения болезни. По прогнозу всемирной организации здравоохранения в ближайшее десятилетие заболеваемость меланомой кожи возрастет на 25 % [5; 14]. Смертность от меланомы остается на высоком уровне, что связано с высоким метастатическим потенциалом опухоли, диагностикой заболевания на поздних стадиях и низкой эффективностью противоопухолевой терапии. Лечение метастатических меланом с использованием стандартных режимов химиотерапии и биотерапии остается недостаточно эффективным, несмотря на появление новых таргетных препаратов. Паклитаксел -цитостатический препарат, относящийся к такса-нам, часто используется в комбинациях для лечения метастатической меланомы. Препарат связывается с тубулином, ингибируя деполимеризацию, что приводит к блокированию деления клеток на стадии митоза и интерфазы. Также паклитаксел активирует апоптотическую программу гибели кле-
ток. Однако эффективность современных режимов химиотерапии при метастатической меланоме остается низкой: частота частичных ремиссий составляет всего 15-20 % [17], а медиана общей выживаемости больных - 6 мес [7].
Прорывом в лечении диссеминированной меланомы кожи стало создание препаратов, направленных на инактивацию белка B-RAF, мутации в кодирующем гене которого встречаются у 40-60 % пациентов [11]. Белок B-RAF - се-рин/треониновая протеинкиназа - является одной из важных сигнальных молекул клетки, которая участвует в передаче сигнала от рецепторов фактора роста RAS через MEK- и ERK-киназы, способствуя пролиферации клеток меланомы и их резистентности к апоптозу [13]. Наиболее частой мутацией в гене B-RAF является мутация V600E (80 %), когда происходит замена аминокислот валин на глутамин. Также встречаются мутации V600K (520 % случаев), V600R (1-3 %), V600D (<1 %), V600M (<1 %) и не V600 мутации (2 %) [1].
Аутофагия - эволюционно сложившийся процесс внутрилизосомальной утилизации цито-зольных белков, макромолекул, органелл и белко-
18 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ МОДУЛЯЦИЯ АУТОФАГИИ ВЛИЯЕТ НА...
вых агрегатов. Аутофагия активируется в ответ на Препараты целый ряд стимулов, включая недостаток пита- Хлорокин дифосфат fSigma, США) разводи-тельных веществ, гипоксию и активацию онкоге- ли в дистиллированной воде до 30 mM (стоковый нов. Изменения в сигнальных путях, связанных с раствор). Рамамицин (Sigma, США) разводили в аутофагией, часто встречаются при злокачествен- ДMСO до стоковой концентрации 27,4 mkM. Сто-ных новообразованиях и многих других заболева- ковые растворы хранили при -20 °С. Паклитаксел ниях [2; 21]. (Таксол, Bristol-Myers Squibb, Великобритания) Роль B-RAF в регуляции аутофагии является готовили ex temporo. спорной и зависит от типа злокачественного ново- бразования; сигнализация ERK связана с образова- Культивирование клеточных линий нием аутолизосом [10] и гибелью клеток путем ау- В работе были использованы следующие тофагии [9]. клеточные линии меланомы человека: Mel Cher, Ранее Jane L. Armstrong с соавт. показали, Mel Kor, Mel Mtp, Mel Z, полученные в НИИ ЭДи-что клеточные линии меланомы с мутацией в B- ТО ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина», и линия из RAF (B-RAFV600E) дефектны в отношении аутофа- АТСС каталога Sk-mel-2 [3; 4; 19]. Клеточные ли-гии [8]. Несмотря на то, что клетки с мутирован- нии культивировали на полной питательной среде ным типом гена имеют более высокий уровень ба- RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сы-зальной аутофагии, чем клетки "дикого" типа, воротки теленка (ТЭС, HyClone, США); 2 mM/мл дальнейшая активация аутофагии происходит толь- глутамина, 50 мг/мл пенициллин-стрептомицина ко в клетках B-RAF T [6]. (ПанЭко, Россия) при 37 °С в атмосфере 5 %-ного Роль аутофагии в качестве альтернативного С02. механизма клеточной смерти в последние годы была предметом активных дискуссий. Выявление ау- Цитотоксичность тофагосом с отличными от апоптоза признаками в Клетки (8*104 клеток/мл) вносили в 96-гибнущих клетках заставило ученых предположить, луночный планшет в полной среде. Через 24 часа что она может участвовать в гибели клеток [18]. добавляли паклитаксел в диапазоне концентраций Однако, в большинстве случаев, аутофагия рас- 0,2^25 mkM. Инкубацию проводили 48 ч, затем досматривается как механизм выживания опухолевых бавляли в каждую лунку по 20 мкл раствора MTT клеток, который может откладывать запуск апопто- (3-[4,5-диметилтриазол-2-ил]-2,5 дифенил тетразо-за, поддерживать метаболизм в условиях пищевого лия бромид) в конечной концентрации 0,5 мг/мл. стресса и снижать повреждение клеток путем пре- Клетки инкубировали еще 4 часа, затем среду от-дотвращения накопления поврежденных белков и бирали и добавляли к ним по 200 мкл ДMСO. Оп-органелл. Вовлечение аутофагии в механизмы ги- тическую плотность раствора формазана определя-бели опухолевых клеток при раке молочной железы ли на спектрофотометрическом анализаторе «Уни-было показано также и для паклитаксела. Пакли- план» (Россия) при 540 нм, используя ДMСO как таксел ингибирует аутофагию путем блокирования нулевой контроль. Для препарата строили график активации PI3K 3 класса и Vps34 - основного уча- зависимости «доза-эффект» и определяли IC50. стника образования аутофагосом [20]. Модуляция цитотоксичности Аутофагию можно рассматривать как новую Инкубацию с веществами рапамицин (100 мишень для терапии меланомы. Сигнальные моле- hM) и хлорокин (30 mkM) или ДMСO в соответст-кулы, вовлеченные в процесс аутофагии, могут вующей концентрации как отрицательным контро-быть использованы в качестве потенциальных био- лем проводили в течение 1 ч, затем добавляли Пак-маркеров для определения прогноза течения опухо- литаксел (10 mkM) и инкубировали в течение 48 ч. левого заболевания, предсказания эффективности противоопухолевой терапии и выбора рациональ- Проточная цитофлуориметрия ного лечения для каждого конкретного больного. Клеточные линии сажали по 2*105 в дупле-Активно ведется поиск новых противоопухолевых тах на 6-луночные планшеты в полной среде. Через препаратов, модулирующих аутофагию, для повы- 24 ч к клеткам добавляли рапамицин (100 hM), шения эффективности химиотерапевтического ле- хлорокин (20 mkM) или контрольный раствор, ин-чения онкологических больных. кубировали в течение 60 мин при 37 °С, затем вно-В ходе данной работы нами проведено ис- сили препарат паклитаксел (10 mM) и оставляли следование механизмов гибели клеток метастати- клетки на 24 ч. ческой меланомы с разным статусом гена B-RAF Для окрашивания клеток на ранний и позд-под действием паклитаксела, в том числе - при ний апоптоз использовали коммерческий набор комбинации его модуляторами аутофагии. Annexin-V FITC Apoptosis Kit (Invitrogen, США). К клеткам (1 х 106/100 мкл) добавляли раствор, содер-Материалы и методы жащий пропидий йодид и аннексии V. Клетки инкубировали при комнатной температуре в темноте Реактивы в течение 15 мин, далее к клеткам добавляли 350-TRIzol-реагент («Sigma», США), агароза ква- 400 мкл связывающего буфера для остановки реак-лификации «Biothech grade» (Хеликон, Россия); ции. Анализ данных (10 000 событий) проводили на бромистый этидиум (Serva, Германия); изопропи- проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II. ловый спирт, MTT («ICN Biomedicals, США), ДMСO («Sigma», США). M-MuLV обратная транс- ОТ-ПЦР криптаза RevertAid, Taq-полимераза, реакционные Детекцию экспрессии мРНК Beclin1 опреде-буферы, маркеры молекулярной массы ДНК c дли- ляли с помощью ПЦР с обратной транскрипцией ной фрагментов 100 п.н. (все - Fermentas, Литва); (ОТ-ПЦР). Через 24 ч после культивирования с хи-смесь дезоксинуклеотидов (Хеликон, Россия); гек- миопрепаратми клетки лизировали, используя реа-самеры, праймеры для генов бета-актин (ß-Actin, гент TRIzol. Из лизата опухолевых клеток выделя-ACT) и Beclin 1 синтезированы в фирме Литех ли тотальную РНК в системе хлороформ-Россия). изопропиловый спирт. Обратную транскрипцию
№ 4/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
проводили в соответствии со стандартным протоколом [12]. Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) по программе: 24 ° С - 10 мин, 42°С - 50 мин и 70°С - 15 мин. Использовали следующие праймеры для гена Beclinl F: 54 -AAGAC AGAGCGATGGTAG-34 и R: 5' -CTGGGCTGTGGTAAGTAA-3' (продукт 282 н.п.); для beta-Actin F:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' и R:5 '-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (продукт 460 н.п.). Условия амплификации: предварительная обработка - 94°С - 2 мин; денатурация ДНК - 94 °С - 30 с; отжиг праймеров - 62 °С - 30 с; элонгация - 72 °С - 1 мин (для Beclinl, 26 циклов), а также 94 °С - 2 мин; 94 °С - 20 сек; 60 °С - 20 с; 72 °С - 45 с (для beta-Actin, 24 цикла).
Продукты амплификации анализировали после электрофореза в 1,5 %-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий в стандартной концентрации.
Уровень экспрессии Beclin1 оценивали в относительных единицах оптической плотности (o.e.) с помощью программы «ImageJ» по отношению к уровню ß-Actin.
Статистический анализ проводили с использованием программы GraphPad Prizm v. 5.0. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента или критерию %2 Различия считали статистически достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Цитотоксичность паклитаксела и его комбинаций с модуляторами аутофагии на клеточных линиях меланомы человека in vitro Исследование было проведено на 5 клеточных линиях метастатической меланомы человека, 2 из которых (Mel Cher, Mel Z) имели мутантный статус B-RAF6001, а 3 (Mel Kor, Mel Mtp, Sk-mel-2) - "дикий" тип B-RAF^ .
Цитотоксичность паклитаксела была изучена in vitro при инкубации клеток с препаратом в диапазоне концентраций 0,2 мкМ-^2,5 мкМ в течение 48 часов с помощью МТТ-теста. Противоопухолевая активность препарата оценивалась по IC50 по результатам трех независимых экспериментов (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика клеточных линий меланомы кожи человека и цитотоксичнсть паклитаксела_
Клеточная линия Статус B-RAF Базальный уровень аутофагии Степень индукции аутофагии IC50, дМ
Mel Kor WT низкий 1,6 3,6 ± 1,1
Mel Mtp WT высокий 0,2 3,3 ± 0,6
Sk-mel-2 WT низкий 5,7 ,7 1—' чо
Mel Cher V600E высокий 0,9 14,7 ± 0,47
Mel Z V600E низкий 2,7 6,5±2,6
Показано, что клеточные линии с диким типом гена оказались более чувствительными к действию препарата, чем с мутациями В-ЯЛЕ 00Е. Среднее значение 1С50 для паклитаксела для В-ЯЛЕ-мутированных линий составило 10,6±5,8 мкМ, и для немутированных - 4,23±1,36 мкМ (р=0,142).
Анализ аутофагии проводили по оценке экспрессии мРНК гена Bec lin 1, который участвует в инициации образования аутофагосом (табл. 1). Уровень базальной аутофагии клеток этих линий и ее индукция в условиях недостатка питательных веществ и факторов роста были описаны нами ранее [6]. В зависимости от базального уровня клеточные линии были разделены на линии с низким базальным уровнем аутофагии (Mel Z, Mel Kor, Sk-mel-2) и с высоким (Mel Mtp, Mel Cher). Способность клеточных линий к индукции аутофагии оценивалась по соотношению уровня мРНК Beclin 1 в условиях 24-часового голодания к базальному уровню. При соотношении >1,1, клеточная линия оценивалась как способная к индукции аутофагии.
В качестве модуляторов аутофагии использовали рапамицин (индуктор) и хлорокин (ингибитор). Рапамицин является ингибитором mTOR-сигнального пути, который участвует в регуляции аутофагии при различных клеточных стрессах (например, голодании) [15]. Хлорокин блокирует ау-тофагию на этапе образования аутолизосомы [16].
Влияние модуляторов аутофагии на цитотоксичность паклитаксела (10 мкМ) оценивалась при преинкубации клеток с рапамицином (100 нМ) либо с хлорокином (30 мкМ) в течение 1 часа. Выживаемость клеток оценивали через 48 ч с помощью МТТ-теста (см. рисунок). Было показано, что клеточные линии mel Kor и Mel Z были чувствительны к ингибитору (выживаемость составила 12 и 8 % соответственно). Выживаемость других клеточных линий при инкубации с модуляторами аутофагии в течение 48 ч была выше 70 % относительно контроля.
Анализ результатов показал, что хлорокин потенцирует цитотоксичность паклитаксела на клеточных линиях метастатической меланомы человека с мутациями в гене B-RAF. Так, выживаемость клеток линии Mel Cher при инкубации с паклитак-селом (10 мкМ) составила 56±11 %, в комбинации с хлорокином - только 6±2 %. При этом индуктор аутофагии статистически значимо не влиял на выживаемость меланомных клеток. Незначительное увеличение цитотоксичности паклитаксела при комбинации с рапамицином или хлорокином на клетках меланомы кожи человека с B-RAFWT статусом может быть объяснено цитотоксичностью самих модуляторов.
Таким образом, хотя клеточные линии с B-RAFV600E были резистентны к паклитакселу, их комбинация с хлорокином синергично увеличивала цитотоксичность препарата.
Индукция
апоптотической гибели клеток меланомы человека под действием паклитаксела и его комбинаций
с модуляторами аутофагии in vitro Было изучено влияние паклитаксела и его комбинаций с модуляторами на индукцию апоптоза на клеточных линиях меланомы человека после 24-часовой инкубации с препаратами (табл. 2). Для этого клетки окрашивали набором Annexin-V FlTC Apoptosis Kit и анализировали методом проточной цитофлуориметрии.
Несмотря на то, что цитотоксичность палки-таксела была выше для клеток с диким типом B-RAF, цитостатик активировал апоптоз в среднем у 19,8±13 % клеток B-RAF7, и 27,5±0,3 % клетках B-rAFV60oe (р=0,015).
Таблица 2
Апоптотическая активность паклитаксела и его комбинация с модуляторами аутофагии на клеточных линиях меланомы
Клеточная линия Статус B-RAF Уровень апоптоза при 24-часовой инкубации с химиопрепаратами, m±SD(%)
Паклитаксел Паклитаксел + хлорокин Хлорокин Паклитаксел + рапамицин Рапамицин
Mel Mtp wt 20,7 ± 3,4 18,3 ± 1,3 7,3 ± 1,3 18,4 ± 2,3 11,7 ± 4,5
Sk-mel-2 18,8 ± 3,4 24,8 ± 6,5 6,4 ± 0,3 14,3 ± 3,7 1,8 ± 0,7
Mel Cher mt 27,3 ± 2,2 43,0 ± 1,9 2,3 ± 0,3 18,3 ± 0,7 3,5 ± 1,6
Mel Z 27,7 ± 2,6 52,5 ± 1, 8 4,35±2,8 30,2 ± 7,8 2,6 ± 1,5
t-о
100
0 ь
01
с: сс х Ч
л й I- а
о о
S *
tu
га
m
S
ï
Б
to
80
60 -
40 -
20 -
Mel Cher {V600)
Sk-mel-2 {wt)
MelMtp(wt)
ВХлорокин ВРапамицин ШПаклитаксел Паклитаксел + Хлорокин ИПаклитаксел + Рапамицин Рис. Влияние модуляторов аутофагии на цитотоксичность паклитаксела.
Анализ индукции апоптоза под действием комбинаций паклитаксела с модуляторами аутофагии показал, что увеличение индукции апоптоза происходит только в клетках с мутацией в гене B-RAF при ингибировании запуска аутофагии (р=0,05). В остальных случаях значимой индукции апоптоза не наблюдалось.
Таким образом, синергизм паклитаксела и хлорокина может быть связан с повышением апоп-тотической активности в клетках B-RAFV600E.
Выводы
Проведенное нами исследование показало, что мутации в гене B-RAF ассоциированы с изменением уровня аутофагии в клетках метастатической меланомы. Клеточные линии ММ с B-RAFV600E оказались более резистентны к паклитакселу в сравнении с клеточными линиями, не несущими мутаций. При исследовании апоптотической активности паклитаксела и его комбинаций с модуляторами аутофагии увеличение апоптоза наблюдалось только у клеточных линий с мутантным типом гена. При этом синергизм цитотоксической активности отмечали только при комбинации паклитаксела с хлорокином. Хотя B-RAFWT клетки ММ были более чувствительны к паклитакселу, добавление ингибитора не влияло на гибель клеток
В настоящее время существует два противоположных подхода к использованию модуляторов аутофагии в онкологии.
Одни авторы считают, что необходимо ин-гибировать процесс для блокирования цитопротек-торной функции аутофагии. Другие говорят о ее активации, чтобы запустить клеточную гибель путем аутофагии опухолевых клеток, высоко резистентных к запуску апоптоза. Чаще всего выбор тактики зависит от этиологии злокачественного новообразования.
Нами было показано, что ингибирование аутофагии хлорокином при применении паклитаксела - цитостатического агента, увеличивает гибель опухолевых клеток в случае B-RAF-мутирoванныx опухолей, но не влияет на клетки "дикиго" типа.
Таким образом, мутации в гене B-RAF могут определять чувствительность клеточных линий меланом к запуску в них аутофагии и резистентность меланомы к паклитакселу. Комбинация препарата с ингибиторами аутофагии может усилить его противоопухолевую активность за счет активации апоптоза. Ингибирование аутофагии может рассматриваться как перспективный подход к комбинированной терапии ММ кожи как у пациентов с мутированным статусом гена B-RAF, так и с геном "дикого" типа. Эффективные комбинации требуют дополнительного изучения.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 12-04-33257мол а вед.
Литература
1. Имянитов E.H.. Эпидемиология и биология опухолей кожи // Практическая онкология. - 2012. - Т. 13, № 2 - С. 61-8.
2. Ковалева О.В., Шитова М.С., Зборовская И.Б. Аутофагия: клеточная гибель или способ выживания? // Онкогематология. - 2014. - Т. 7, № 2. - С. 103-13.
3. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. - 2005. - № 7. - С. 37-40.
4. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С. и др. Сравнение уровня HSP70 на клеточных линиях меланомы // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, №1. - С. 43-8.
5. Официальные периодические издания: электронный путеводитель/ Всемирная организация здравоохранения: опухоли кожи URL: www.who.int (дата обращения: 18.08.2014)
6. Рябая О.О., Цыганова И.В., Сидорова Т.А. и др. Влияние активирующих мутаций V600 гена B-RAF на способность клеток меланомы к аутофагии // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. -2013. - № 3. - С. 68-72.
7. Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В. Современный взгляд на лекарственное лечение диссеминированной меланомы кожи. (Практ. рекомендации общества онкологов-химиотерапевтов по диагностике, лечению и наблюдению больных меланомой кожи) // Практическая онкология. - 2012. - Т. 13 - № 2. - С. 143-9.
8. Armstrong J.L., Corazzari M., Martin S et al. Oncogenic B-RAF signaling in melanoma impairs the therapeutic advantage of autophagy inhibition // Clin Cancer Res. - 2011. - 17(8). - P. 2216-26.
9. Cagnol S., Chambard J.C. ERK and cell death: mechanisms of ERKinduced cell death—apoptosis, autophagy and senescence // FEBS J. - 2010. - 277. - P. 2-21.
10. Corcelle E., Nebout M., Bekri S. et al. Disruption of autophagy at the maturation step by the carcinogen lindane is associated with the sustained mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase activity // Cancer Res. - 2006. - 66. - P. 6861-70.
11. Davies H., Bignell G.R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature. - 2002. -417. - C. 949-54.
12. Deng R., Li W., Guan Z. et al. Acetylcholinesterase expression mediated by c-Jun-NH2-terminal kinase pathway during anticancer drug-induced apoptosis // Oncogene. - 2006. - 25. - P. 7070-7.
13. Dhomen N., Marais R. BRAF signaling and targeted therapies in melanoma // Hematol Oncol Clin North Am. - 2009. - 23. - P. 529-45.
14. Ferlay J., Shin H.R., Bray F. et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 // Int J Cancer. - 2010. - 127(12). - P. 2893-917.
15. Jung C.H., Ro S.H., Cao J. et al. mTOR regulation of autophagy // FEBS Lett. - 2010. - 584. - P. 1287-95.
16. Kimura T., Takabatake Y., Takahashi A., Isaka Y. Chloroquine in cancer therapy: a double-edged sword of autophagy // Cancer Res. - 2013. - 73(1). - P. 3-7.
17. Legha S.S., Ring S., Papadopoulos M. et al. A phase II trial of taxol in metastatic melanoma // Cancer. -1990. - 65. - P. 2478-81.
18. Levine B, Yuan J. Autophagy in cell death: an innocent convict? // J Clin Invest. - 2005. - 115(10). - P. 2679-88.
19. Michailova I.N., Morozova L.Ph., Golubeva V.A. et al. Cancer/testis genes expression in human melanoma cell lines // Melanoma Research. - 2008. - 5. - P. 303-13.
20. Veldhoen R.A., Banman S.L., Hemmerling D.R. et al. The chemotherapeutic agent paclitaxel inhibits autophagy through two distinct mechanisms that regulate apoptosis // Oncogene. - 2013. - 32(6). - P. 736-46.
21. Yang Z., Klionsky D.J. Eaten alive: a history of macroautophagy // Nat Cell Biol. - 2010. - 12. - P. 814-22.
СПИСКО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ММ - метастатическая меланома (metastatic melanoma)
