CC BY
51
Химия растительного сырья. 2012. №3. С. 167-171.
УДК 57.088:534.838.7(045)
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УЛЬТРАЗВУКА НА ОТДЕЛЬНЫЕ СТАДИИ В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO. IV. БИОСИНТЕЗ ЛИПИДОВ СОИ
© A.C. Буянова', А.А. Ламберова, М.Э. Ламберова
Бийский технологический институт (филиал) Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова, ул. Трофимова, 27, Бийск, Алтайский край, 659305, (Россия), e-mail: alenabuyanova@mail.ru
В работе эффективность биотехнологического метода улучшения сортов сои была увеличена за счет ультразвуковой обработки аппаратом «Волна»-0,4/22-М. Подобраны оптимальные режимы ультразвуковой обработки бобов и каллуса сои сорта «Алтом» при экстракции липидной фракции на стадии образования каллусной биомассы in vitro при определении жирнокислотного состава липидной фракции в экстрактах из бобов сои и активности липазы.
В процессе экстракции из бобов и каллуса сои с помощью ультразвука можно регулировать общее содержание выделенных липидов и жирнокислотный состав липидной фракции. Кроме того, за счет ультразвуковой обработки исходных эксплантов сои при введении в культуру клеток и тканей in vitro и при размножении полученной каллусной биомассы можно регулировать биосинтетическую активность по накоплению липидов, варьировать их количество и качество.
Ключевые слова: липидная фракция, каллусная биомасса сои in vitro, ультразвук, липаза.
В Алтайском крае к районированным сортам сои относится «Алтом», который составляет сырьевую базу маслоэкстракционных заводов края, выпускающих соевое масло. По заказам предприятий ежегодно увеличиваются посевные площади, занятые соей. При улучшении сортов сои биотехнологическими методами актуальным является интенсификация накопления в культуре клеток и тканей in vitro липидной фракции и ее физиологически важных компонентов [1]. Соевое масло обогащено незаменимыми ю-3- и ю-6-жирными кислотами, лецитином и др. [2].
В белковой фракции бобов сои [3] в число ценных ферментов липидного обмена входит липаза, которая гидролизует эфирные связи в триглицеридах липидной фракции, в результате чего освобождаются незаменимые жирные кислоты, важные в пище и кормах [2, 4].
Известно, что ультразвук способствует экстрагированию из сырья биологически активных веществ [2].
При подборе режимов УЗ-обработки необходимо учитывать, что компоненты липидной фракции могут разрушаться или снижать свою активность. Оптимальные режимы УЗ-обработки подбирали при проведении экстракции из соевых бобов сорта «Алтом». Важно было также установить, как эти режимы будут влиять
Введение
Буянова Алена Сергеевна - аспирант,
тел.: (3854) 43-53-01, e-mail: alenabuyanova@mail.ru
Ламберова Анна Александровна - аспирант,
тел.: (3854) 43-53-01, e-mail: ane4ka1567@rambler.ru
Ламберова Марина Эдуардовна - доцент кафедры
биотехнологии, кандидат химических наук,
тел.: (3854) 43-53-01, e-mail: mlamberova@mail.ru
на синтез в каллусной биомассе сои in vitro веществ липидной фракции. Для этого в ходе культивирования клеточную культуру сои in vitro подвергали воздействию ультразвука в различных режимах, затем из полученной биомассы извлекали липидную фракцию. В данных экстрактах определяли те же показатели, что и в соответствующих вытяжках из соевых бобов, которые служили контролем.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Суммарное содержание липидов, выделенных в экстракт, определяли методом длительного настаивания навесок измельченных бобов и каллуса сои в хлороформ-этанольной смеси. По разности масс образца до и после экстракции находили процентное содержание липидов в экстракте [2].
Об активности липазы судили по количеству жирных кислот, образовавшихся за определенный промежуток времени в результате ферментативного гидролиза жира. Количество жирных кислот определяли титрованием 0,1 н раствором щелочи отдельных проб масла, взятых до гидролиза и в процессе гидролиза [4].
Подлинность в препарате определяли методом ГЖХ по ГФ XII, на хроматографе «Хроматек Кристалл 5000.1», ПИД, колонка INNOWAX - 60 м [5].
Для этого 0,03-0,04 мл препарата смешивали с 1 мл метанола, 1 мл ацетилхлорида и нагревали с обратным холодильником на водяной бане в течение 1,5 ч. Избыток спирта отгоняли. В реакционную смесь прибавляли 1 мл гексана и перемешивали. Отбирали по 10 мкл смеси, вводили попеременно с модельной смесью в испаритель газового хроматографа и снимали не менее трех хроматограмм. Спиртовохлороформные фракции, полученные в опыте 2, выпаривали на водяной бане для удаления растворителя [5].
Исследование влияния экстрагента и ультразвуковой обработки на выделение лецитина из соевых бобов и каллуса сои. Реактивы: соевая мука, полученная из измельченных бобов; хлороформ - этанольная жировая вытяжка, полученная в опыте; этиловый спирт; ацетон; хлористый кадмий, насыщенный спиртовой раствор; КОН 10%-ный раствор; кислый сернокислый калий или натрий (КЖ04 или NaHSO4); кристаллическая борная кислота (Н3В03).
В сосуд вносили 4 г соевой муки и, помешивая, добавляли 10 мл горячего спирта. После остывания содержимое сосуда отфильтровывали. Со спиртовым раствором лецитинов проводили ряд реакций: осаждение ацетоном, получение эмульсии лецитинов, осаждение хлористым кадмием, гидролиз лецитинов и исследование их состава, проба на жирные кислоты, проба на глицерин [4].
Обсуждениерезультатов
Исследование зависимости содержания суммарных липидов в экстрактах из бобов и каллуса сои от мощности и длителъностиулътразвукового воздействия.
Результаты извлечения липидов из бобов и каллуса сои контрольные и с применением УЗ представ -лены в диаграмме на рисунке 1.
Из диаграммы видно, что оптимальным можно считать 40 Вт, принятое для дальнейших опытов. Увеличение длительности УЗ-воздействия от 1 до 10 мин снижает суммарное содержание липидов в экстрактах. Минимальным (22,9%) было значение при длительности УЗ-обработки 6 мин, поэтому оптимальной была принята длительность УЗ-обработки 1 мин.
Результаты по экстрактам из соевых бобов описаны в нашей статье ранее [2].
Рис. 1. Зависимость содержания суммарных липидов в экстрактах из каллуса сои от мощности и длительности УЗ-воздействия: опыты 1-5 - длительность УЗ-воздействия 1 мин; опыты 7-11 - мощность УЗ-воздействия 40 Вт; температура -20±2°С
Исследование влияния ультразвука на активность липазы в водных экстрактах из бобов и каллуса сои в процессе гидролизарастителъных жиров.
Для корректной оценки накопления липидов в каллусной биомассе бобов in vitro необходимо было оценить активность липазы в водной вытяжке из бобов и каллуса сои после УЗ-обработки в разных режимах. На данном этапе определяли зависимость активности липазы в водных экстрактах из каллуса сои от длительности термостатирования и воздействия ультразвука. Полученные результаты представлены в сравнительной диаграмме на рисунке 2. По оси ординат - объем в мл 0,1 н раствора NaOH, пошедший на титрование свободных жирных кислот, образовавшихся под действием липазы из каллуса сои за данный промежуток времени при термостатировании.
Из диаграммы видно, что в образце без ультразвукового воздействия и без термостатирования актив -ность липазы была выше. При длительности термостатирования от 15 до 30 мин активность липазы изменялась незначительно. Увеличение длительности термостатирования до 60 мин заметно повысило активность липазы в образце без ультразвука, а в контрольном растворе и образце, обработанном ультразвуком, активность липазы снизилась. При длительности термостатирования 90 мин происходило резкое снижение активности липазы в образце без ультразвука, а в двух других растворах активность ее повышалась незначительно.
Результаты по экстрактам из соевых бобов описаны ранее [2].
Изучение методом ГЖХ зависимости жирнокислотного состава липидной фракции в экстрактах из соевых бобов от мощности и длительности обработкиультразвуком.
Спиртово-хлороформные фракции, полученные в опыте 4, выпаривали на водяной бане для удаления растворителя. Подготовку пробы к хроматографированию проводили по методике, описанной ранее. Результаты, полученные методом ГЖХ, обработанные с помощью компьютерной программы, приведены в таблице.
Данные таблицы подтверждают вывод о том, что с помощью ультразвука можно регулировать жирнокислотный состав выделенной фракции. Результаты по незаменимым жирным кислотам показали, что максимальное содержание пальмитиновой кислоты (21,6%) наблюдается при обработке ультразвуком мощностью 80 Вт, длительность - 10 мин, а без обработки ее нет. Большее содержание стеариновой кислоты (6,65%) - при УЗ-обработке мощностью 80 Вт, длительность - 2 мин, меньшее (3,34%) - при мощности 100 Вт, длительность - 1 мин.
Олеиновой кислоты больше (23,53%) при УЗ-обработке мощностью 80 Вт в течение 6 мин, а наименьшее количество (16,37%) - при мощности 80 Вт, длительность - 8 мин. Максимальное содержание линолевой кислоты (53,21%) наблюдается при обработке ультразвуком мощностью 40 Вт, длительность -1 мин, минимальное (34,06%) - при обработке ультразвуком мощностью 80 Вт, длительность - 10 мин.
Рис. 2. Зависимость активности липазы в водных экстрактах из каллуса сои от длительности термостатирования и воздействия ультразвука: температура - 37±1 °С; длительность УЗ-воздействия - 1 мин; мощность УЗ-воздействия -40 Вт
Зависимость жирнокислотного состава липидной фракции в экстрактах из соевых бобов от мощности и длительности обработки ультразвуком
№
Концентрация жирных кислот, %
фрак- ции миристи- новая пальмити- новая пальмито- леиновая стеариновая олеиновая линолевая линоленовая
0 0,09 — 13,3 4,33 20,31 51,83 9,15
1 0,06 12,65 0,05 3,41 19,33 52,68 10,82
2 0,06 12,4 0,2 3,59 19,8 53,21 9,74
3 0,1 13,15 0,04 3,87 19,79 51,70 10,34
4 0,07 13,22 — 4,30 20,3 51,87 9,24
5 0,05 12,28 0,04 3,34 19,69 52,35 11,25
6 0,32 0,42 19,92 6,65 18,71 44,46 8,53
7 2,0 15,78 0,37 5,78 17,21 40,12 7,83
8 0,23 14,77 0,08 4,34 23,53 49,18 6,87
9 0,19 15,57 0,02 4,07 16,37 44,77 14,29
10 9,11 21,59 0,45 6,06 18,56 34,06 9,17
Максимум линоленовой кислоты (14,3%) был получен при обработке ультразвуком мощностью 80 Вт, длительность - 8 мин, а минимум (6,87%) - при обработке ультразвуком мощностью 80 Вт, длительность - 6 мин.
Исследование влияния экстрагента и УЗ-обработки на выделение лецитина в экстракты из бобов и каллуса сои.
Проведенные исследования показали, что в качестве единственного эффективного экстрагента для извлечения лецитина из бобов и каллуса сои можно считать кипящий этиловый спирт. При этом ультразвук в опытах с 1-го по 10-й в различных режимах разрушал выделенный лецитин.
Выводы
1. Исследована зависимость содержания суммарных липидов в экстрактах из соевых бобов и каллуса сои от мощности и длительности УЗ-воздействия. Оптимальными режимами УЗ-обработки при экстрагировании из бобов сои можно считать 80 Вт в течение 10 мин: содержание липидов увеличилось на 4,6%, а для каллуса сои - 40 Вт в течение 1 мин: содержание липидов увеличилось незначительно (на 0,6%).
2. Установлена зависимость степени гидролиза растительного масла от наличия липазы из соевых бобов, от длительности термостатирования и воздействия ультразвука. Предварительная УЗ-обработка ускоряет разложение масла на 30 мин и стабилизирует процесс на более высоком уровне. Активность липазы в экстрактах из каллуса сои без УЗ-воздействия и без термостатирования была выше.
3. Изучено влияние экстрагента и УЗ-обработки на выделение лецитина из соевых бобов и каллуса сои. Наиболее эффективным экстрагентом является кипящий этиловый спирт, предварительная УЗ-обработка разрушает выделенный лецитин.
4. Исследована зависимость жирнокислотного состава липидной фракции в экстрактах из соевых бобов от мощности и длительности обработки ультразвуком.
Таким образом, в процессе экстракции из бобов и каллуса сои с помощью ультразвука можно регулировать общее содержание выделенных липидов и жирнокислотный состав липидной фракции. Кроме того, за счет УЗ-обработки исходных эксплантов сои при введении в культуру клеток и тканей in vitro и при размножении полученной каллусной биомассы можно регулировать биосинтетическую активность по накоплению липидов, варьировать их количество и качество.
Список литературы
1. Косолапова A.C., Ламберова М.Э. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. I. Стерилизация эксплантов // Химия растительного сырья. 2010. №2. С. 179-180.
2. Косолапова A.C., Ламберова М.Э. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. II. Образование каллуса и его размножение // Химия растительного сырья. 2010. №3. С. 189-190.
3. Косолапова А.С., Ламберова М.Э. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. III. Биосинтез белков сои // Химия растительного сырья. 2012. №3. С.163-166.
4. Koshelev Y.A., Lamberova M.E., Lamberova A.A. Researching of Ultrasonic Influence on Callus Formation, Contents of Lipid Fraction, Lecithin, on Activity of Lipaza in Extracts from the Native Soybean of the Grade «Altom» and in Culture of Cells and Tissues In Vitro // International Workshops and Tutorials on Electron Devices and Materials EDM’2008: Workshop Proceedings. Novosibirsk, 2008. Pp. 261-266.
5. Государственная фармакопея. XII изд. М., 2007. Вып. 1, 2.
Поступило в редакцию 29 апреля 2011 г.
После переработки 12 августа 2012 г.
Buyanova A.S. , Lamberova A.A., Lamberova M.E. RESEARCH OF ULTRASOUND INFLUENCE ON SEPARATE STAGES IN TECHNOLOGY OF CELL AND TISSUE CULTURE IN VITRO. IV. LIPIDS BIOSYNTHESIS OF THE SOYA
Biysk institute of technology (branch) of The Altay state technical university of 1.1. Polzunova, st. Trofimova, 27, Byisk,
659305, Altay (Russia), e-mail: alenabuyanova@mail.ru, mlamberova@yandex.ru
At improvement of soya grades by biotechnological methods the accumulation intensification in cell and tissue culture in vitro lipid fraction and its physiologically important components is actual. Soya oil is enriched irreplaceable ro-3 and ro-6-fat acids, lecithin, etc.
In albuminous fraction of soybeans the number of valuable enzymes a lipid exchange includes a lipase which hydrolyzes radio communications in triglycerides lipid fractions therefore irreplaceable fat acids, important in food and forages are released.
In the given work efficiency of a method has been increased at the expense of ultrasonic processing by device «Wave»-0,4/22-M. Optimum modes of ultrasonic processing of beans and callus a soya of a grade «Altom» have been picked up at extraction lipid fractions, at a formation stage of a callus biomass in vitro, at definition fat acids structure lipid fractions in extracts from soybeans and activity of a lipase.
In process extraction from beans and callus a soya by means of ultrasonic it is possible to regulate the general maintenance of the allocated lipids and fat acids structure lipid fractions. Besides, at the expense of ultrasonic processing initial explants a soya at introduction in culture of cages and fabrics in vitro and at reproduction received a callus biomass may regulate of their biosynthetic activity on accumulation of lipids, their quantity and quality.
Keywords: lipid fraction, a soya callus biomass in vitro, ultrasonic, a lipase.
References
1. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Khimiia rastitel’nogo syr’ia, 2010, no. 2, pp. 179-180. (in Russ.).
2. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Khimiia rastitel’nogo syr’ia, 2010, no. 3, pp. 189-190. (in Russ.).
3. Kosolapova A.S., Lamberova M.E. Khimiia rastitel’nogo syr’ia, 2012, no. 3, pp. 163-166. (in Russ.).
4. Koshelev Y.A., Lamberova M.E., Lamberova A.A. International Workshops and Tutorials on Electron Devices and Materials EDM’2008: Workshop Proceedings. Novosibirsk, 2008, pp. 261-266.
5. Gosudarstvennaia farmakopeia. X11 ed.. [State Pharmacopoeia. XII ed.]. Moscow, 2007, no. 1, 2. (in Russ.).
Received April 29, 2011 Revised August 12, 2012
* Corresponding autor.
