CC BY
116
Химия растительного сырья. 2010. №2. С. 179-180.
УДК 633.12:577.122 (075.3)
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ УЛЬТРАЗВУКА НА ОТДЕЛЬНЫЕ СТАДИИ В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ IN VITRO. I. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ЭКСПЛАНТОВ
© А.С. Косолапова, М.Э. Ламберова
Бийский технологический институт (филиал) ГОУ ВПО «Алтайский государственный технический университет им. И.И.Ползунова», ул. Трофимова, 27, Бийск, 659305, Алтайский край (Россия) e-mail: [email protected], [email protected]
Метод культуры клеток и тканей in vitro используется для улучшения свойств известных сортов и получения новых, размножения их посадочного материала, освобожденного от всех видов инфекции, устойчивого к неблагоприятным внешним воздействиям, хранению. На первых стадиях метода проблемой является стерилизация выбранных эксплантов без потери их способности к дальнейшему развитию, что наблюдается при использовании традиционных химических стерилизующих агентов.
Фактором, способствующим стерилизации, стала ультразвуковая обработка аппаратом «Волна»-0,4/22-М. Были подобраны оптимальные режимы ультразвуковой обработки на стадии стерилизации эксплантов картофеля, гречихи и сои без нарушения в них ценных свойств исходного растения. Химические стерилизующие агенты при этом были заменены частично или полностью. Оптимальные режимы УЗ-обработки подбирали на экстрактах из тех частей растения, которые затем использовали в качестве эксплантов.
Ключевые слова: экспланты, ультразвук, стерилизация.
Введение
В настоящее время актуальной является интенсификация методов культуры клеток и тканей in vitro, позволяющих улучшить свойства известных сортов, получить новые, размножить их посадочный материал, освобожденный от всех видов инфекции, устойчивый к неблагоприятным внешним воздействиям, повысить его стабильность при хранении [1].
На первых стадиях метода необходима стерилизация выбранных эксплантов без потери их способности к дальнейшему развитию, что наблюдается при использовании традиционных химических стерилизующих агентов. Из литературы известно, что ультразвук способствует стерилизации различных биологических объектов [2].
Цель данной работы - изучить влияние ультразвуковой обработки на эффективность стерилизации выбранных эксплантов in vitro с целью замены химических реагентов.
Для этого нужно было подобрать режимы стерилизации эксплантов вводимых в культуру клеток и тканей in vitro с помощью ультразвука, не нарушив в них ценных свойств исходного растения.
Оптимальные параметры УЗ-обработки устанавливали на экстрактах из тех частей растения, которые затем использовали в качестве эксплантов.
Экспериментальная часть
Обработка ультразвуком осуществлялась ультразвуковым технологическим аппаратом «Волна»-0,4/22-М, который обеспечивает интенсификацию технологических процессов в жидких средах за счет введения в них ультразвуковых колебаний высокой интенсивности и реализации оптимального режима развитой кавитации. Аппарат предназначен для фармацевтических производств и позволяет устанавливать режимы, не приводящие к разрушению извлекаемых биологически активных соединений растительного сырья [2].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Для изучения влияния ультразвуковой обработки на эффективность стерилизации были взяты экспланты из разных частей картофеля сорта «Луговской», сои сорта «Алтом» и гречихи сорта «Наташа», их подвергали предварительной и основной стерилизации химической и ультразвуковой.
Эксплантами картофеля являлись части проростков семян, листьев, пазушные и апикальные меристемы растения и почки клубней, для сои - части зародышевых листьев, а для гречихи - гипокотили корня.
Далее отобранные и стерилизованные экспланты помещали на среду Мурасиге-Скуга (МС), содержащую гормоны роста для каллусогенеза. Пробирки помещали в термостат. Регулярно производился отбор инфицированного материала. Эффективность стерилизации (Э) определяли по количеству выживших неинфици-рованных эксплантов после стерилизации (с), дающих каллус, выражая в процентах от исходного количества стерилизуемых эксплантов (х), по формуле:
с
Э = -х100% . х
В процессе предварительной стерилизации экспланты помещали в 5%-ный раствор КМп04 на 20 мин, затем промывали водопроводной водой.
В ходе основной стерилизации эксплант в одном варианте помещали в 70%-ный водный раствор этанола на 0,5-1,5 мин, промывали стерильной дистиллированной водой в течение 0,5—1,5 мин. Во втором варианте эксплант подвергали только ультразвуковой обработке.
Для опытов с применением ультразвука и контрольного было взято по 30 пробирок с питательной средой Мурасиге-Скуга (МС) и эксплантами. Полученные результаты обрабатывали статистически. Основную стерилизацию эксплантов проводили в стерильных условиях в ламинар-боксе. В качестве стерилизующих факторов использовался 70 %-ный раствор этилового спирта и ультразвук. Оптимальные режимы ультразвуковой обработки были подобраны заранее. После стерилизации экспланты помещали в стерильные пробирки с модифицированной питательной средой МС с добавлением 2,4-Д и кинетина для инициации каллусообразования.
Часть пробирок обрабатывали ультразвуком, варьировали мощность и длительность воздействия. Пробирки со стерилизованными эксплантами, обработанные ультразвуком, и контрольные пробирки инкубировали в термостате при температуре (26±1)°С с относительной влажностью 70%. Эффективность стерилизации определяли по истечении 4 недель.
Действие ультразвука осуществлялось при отсутствии непосредственного контакта экспланта с пузырьками кавитации через агаризованную среду, стеклянные стенки флаконов и водную среду вокруг флаконов.
Обсуждение результатов
Подобранные оптимальные результаты стерилизации эксплантов химическими реагентами и ультразвуковой обработкой приведены на рисунке.
Оптимальный режим обработки эксплантов сои - мощность 20 Вт в течение 1 мин; эксплантов гречихи и картофеля - 200 Вт, 6 мин.
Выводы
Подтвержден стерилизующий эффект ультразвука для эксплантов из гречихи, картофеля и сои: эффективность стерилизации увеличилась с 60 до 90%. Следовательно, на стадии стерилизации химические реагенты могут быть полностью заменены ультразвуковым воздействием в оптимальном режиме.
Список литературы
1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., 1999. 200 с.
2. Хмелев В.Н. и др. Ультразвуковые многофункциональные специализированные аппараты для интенсификации технологических процессов в промышленности, сельском и домашнем хозяйстве. Барнаул, 2007. 400 с.
100 г""
я
я
5
м
К
Ц
К
&
&
О
Химическая
обработка
Обработка
ультразвуком
Влияние способа стерилизации на ее эффективность: 1 - гречиха; 2 - картофель; 3 - соя
1
2
3
Поступило в редакцию 20 марта 2009 г.
