CC BY
65
УДК [631.527.8:581.143.6]:633.18+633.853.52 Илюшко М.В., канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
лаборатории с.-х. биотехнологии Приморского НИИСХ Россельхозакадемии ВЫДЕЛЕНИЕ СТЕРИЛЬНЫХ ПЫЛЬНИКОВ ДЛЯ КУЛЬТУРЫ IN VITRO
Предложен способ выделения незрелых пыльников сои и риса для культуры in vitro без использования стерилизующих агентов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: РИС, СОЯ, ПЫЛЬНИКИ, IN VITRO, СТЕРИЛИЗАЦИЯ
UDC [631.527.8:581.143.6]:633.18+633.853.52 Ilyushko M.V., Cand. Biol.Sci.,
Senior Researcher of Laboratory of Agricultural Biotechnology of Primorsky Scientific Research Institute of Agriculture of RAAS ISOLATION OF UNCONTAMINATED IMMATURE ANTHER FOR CULTURE IN VITRO
The article presents an isolation method of uncontaminated immature anther for rice and soybean culture in vitro without using surface sterilization agents.
KEY WORDS: RICE, SOYBEAN, ANTHER, IN VITRO, STERILIZATION
Введение
Ведение гаплоидной селекции методом андроклинной гаплоидии связано с массовым введением в культуру in vitro незрелых пыльников или микроспор. Требуется инокуляция нескольких тысяч пыльников на питательные среды в асептических условиях в каждом эксперименте, при этом выход гаплоидов/дигаплоидов исчисляется в нескольких процентах или долях процента (Круглова и др., 2005; Croser et al., 2006). В прежние десятилетия в качестве стерилизующих агентов для введения в культуру in vitro были распространены ртутьсодержащие диоцид и сулема. Сейчас доступность этих веществ сильно ограничена, так как исследователи стараются избегать их из-за токсичности (Ferrie, Caswell, 2011). Эти препараты применяются только теми лабораториями, в которых остались прежние запасы. В качестве иных стерилизующих агентов для культуры незрелых пыльников рекомендуются гипохлорид натрия или кальция (Kaltchuk-Santos et al., 1997; Калашникова и др., 2006; Гончарова, 2007; Feme, Caswell, 2011), перекись водорода (Гончарова, 2007), хлоргексидиглюконат натрия (Бобков, 2005), которые в условиях фитопатогенной напряженности лета Дальнего
Востока дают неудовлетворительные результаты при введения эксплантов in vitro. Таким образом, поиск надежных стерилизующих агентов и способов выделения пыльников для массовой их посадки на культуральные среды остается актуальной задачей.
Материалы и методы
Растения риса Oryza sativa L. и сои Glycine max (L.) Merril выращивали в зимне-весенний период 2013 года в рассадных ящиках, наполненных автоклавированной почвой в контролируемых условиях культуральной комнаты с низкой влажностью, температурой 22-24° С, 16/8 часов день/ночь. Метелки риса, находящиеся во влагалище флагового листа, проходили предобработку холодом в холодильнике. Стебель срезали, основание обертывали влажной ватой и помещали в пробирку. Перед посадкой метелку извлекали в асептических условиях стерильным пинцетом и помещали веточки метелки в бюксы. Стерилизацию проводили бытовым отбеливателем «Белизна» или 10%-й перекисью водорода в течение жвух минут с трехкратной десятиминутной промывкой автоклавированной водой. Часть веточек оставляли без стерилизации. Вначале выделяли андроцей целиком из цветковых чешуй
15
стерильными пинцетами глазными анатомическими. Затем производили посадку по два пыльника на пробирку диаметром 14 мм ножом-иглой дисцизионным на питательную среду N6 (Chu, 1978). Всего было инокулировано пыльников в 559 пробирок, из них 79 штук - стерилизация «белизной»; 81 штука - стерилизация перекисью водорода; остальные стерилизации не подвергались.
Бутоны сои для получения гаплоидов рекомендуется использовать размером 3,03,5 мм (Kaltchuk-Santos et al., 1997; Zhao et al., 1998; Lauxen et al., 2003; Cardoso et al., 2007), их помещали в бюксах на влажной фильтровальной бумаге в холодильник на неделю. Затем, так же, как на рисе, проводили стерилизацию, выделение андроцея и посадку на питательные среды N6 (Chu, 1978) и MS (Murashige, Skoog, 1962). Содержание органических веществ в среде MS соответствовало работе А.П. Ващенко с соавт. (2010) для среды 7к, сахарозы -12% (Zhao et al., 1998). В одну пробирку диаметром 14 мм помещали по 7-9 пыльников одного бутона. Всего высажено более 3000 пыльников. Из них в 111 пробирках пыльники стерилизованы «белизной», в 56 - перекисью водорода, остальные не стерилизовались.
Наблюдения за пыльниками проводили минимум в течение восьми недель. В работе использовано по одному сорту риса и сои.
Результаты
При введении пыльников риса in vitro с использованием стерилизующих агентов и без их использования инфицированных пробирок не оказалось. Небольшая часть пыльников в дальнейшем образовали каллус, среди них были простерилизованные двумя способами и нестерилизованные.
Похожая ситуация была с пыльниками сои. На среде N6 инфекции не обнаружено вовсе. На среде MS с повышенным содержанием сахарозы загрязнению подверглось 5 пробирок с нестерилизованными пыльниками. Пыльники сои каллуса не образовали.
Из этого следует, что возможно чистое выделение пыльников риса и сои в асептических условиях без использования стерилизующих агентов для введения in vitro. При этом растения, используемые для
культуры пыльников, следует выращивать в контролируемых условиях (температура, влажность).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бобков, С.В. Использование
улучшенных вариантов среды N6 в культуре пыльников гороха // Аграрная наука. 2005. № 8. С.23-25.
2. Ващенко, А.П. Соя на Дальнем Востоке / А.П. Ващенко [и др.]. Владивосток: Даль-наука, 2010. С. 137-145.
3. Гончарова, Ю.К. Использование культуры пыльников в селекции риса. Краснодар, 2007. С. 43-44.
4. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии / Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева, О.Ю. Миронова. М.: Колосс, 2006. С.53-57.
5. Круглова, Н.Н. Эмбриологические основы андроклинии пшеницы / Н.Н. Круглова [и др.]. М.: Наука, 2005. 99 с.
6. Cardoso, M.B. Evaluation of gellings agents on anter culture: response of two soybean cultivars / M.B. Cardoso [et al] // Brazilian Archives of Biology and Technology. 2007. V. 50. № 6. P. 933-939.
7. ttu, C.C. The N6 medium and its applications to anther culture of cereal crops // Proc. of Symposium on Plant Tissue Culture. Beijing, China, 1978. P. 43-50.
8. Croser, J.S. Toward doubled haploid production in the Fabaceae: progress, constraints, and opportunities / J.S. Croser [at al.]// Critical Reviews in Plants Sciences. 2006. V. 25. P. 139-157.
9. Feme, A.M.R. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production / A.M.R. Feme, K.L. Caswell // Plant Cell Tiss Organ Cult. 2011. V. 104. P. 301-309.
10. Kaltchuk-Santos, E. Cytological analysis of early microspore divisions and embryo formation in cultured soybean anthers / E. Kaltchuk-Santos [at al.] // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. V. 49. P. 107-115.
11. Lauxen, M.S. Association between floral bud size and developmental stage in soybean microspores / M.S. Lauxen [at al.] // Brazilian Archives of Biology and Technology. 2003. V. 46. №
4. P. 515-520.
12. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures T. Murashige, F. Skoog// Physiologia Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.
13. Zhao, G. Germination of embryo in soybean anther culture / G. Zhao, Y. Liu, A. Yin, J. Li // Chinese Science Bulletin. 1998. V. 43. № 23. P.1991-1995.
16
