CC BY
10Т.Э. Владимирская1, Н.Н. Веялкина1,
И.А. Швед1, А.В. Адамович1,
1 2 С.Г. Криворот , Ф.Н. Капуцкий ,
В.И. Торгашев2
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ САМОК БЕЛЫХ КРЫС РАЗРАБАТЫВАЕМОГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО СРЕДСТВА АНТИТРОМБОЗНОГО ДЕЙСТВИЯ НА ОСНОВЕ ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗ
1 Центральная научно-исследовательская лаборатория ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования», г. Минск
2 НИИ физико-химических проблем БГУ, г. Минск
В статье приведены результаты оценки влияния нового фармакологического средства антитромбозного действия на основе гемицеллюлоз на репродуктивную функцию самок белых крыс. Показано отсутствие негативного влияния исследуемого фармакологического средства на плодовитость и развитие потомства.
Ключевые слова: фармакологическое средство антитромбозного действия, генеративная функция, эмбриотоксичность.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из важнейших проблем современной медицины являются тромбозы как осложнения многих заболеваний и хирургических вмешательств [5]. В настоящее время для предотвращения образования тромбов применяется антикоагулянт прямого действия гепарин. Альтернативу гепарину представляет прямой антикоагулянт последнего поколения на основе пен-тозанполисульфата. Положительной отличительной особенностью этого средства является то, что он изготовляется из растительного сырья и не требует тестирования на наличие вирусов "коровьего бешенства" и иммунодефицита [1].
НИИ физико-химических проблем
Белорусского государственного университета было разработано фармакологическое средство антитромбозного действия на основе сульфатированных полисахаридов (гемицеллюлоз) - пентозанполисульфата натрия.
Целью настоящей работы явилось изучение возможных эмбриотоксических свойств фармакологического средства и его влияния на репродуктивную функцию самок крыс при многоразовом подкожном введении.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах-самках массой 220270 г. До начала эксперимента животные находились под карантинным наблюдением в течение двух недель в виварии ЦНИЛ БелМАПО. Для эксперимента выбирали активных животных с гладким, блестящим шерстным покровом, нормальной окраской видимых слизистых оболочек, охотно поедающих корм.
Все исследования проводились в соответствии с требованиями по доклиническому изучению безопасности лекарственных средств и с соблюдением принципов биоэтики [2-4].
НИИ физико-химических проблем Белорусского государственного университета для исследования был предоставлен 10 % раствор пентозанполисульфата натрия (в дальнейшем - фармакологическое средство (ФС)).
Перед началом эксперимента у всех животных исследовали эстральный цикл на протяжении 2 недель с помощью общепринятого метода ежедневного изучения вагинальных мазков. Влагалищные мазки получали в утренние часы, исследование проводили после окраски по Романовскому и по Леффлеру. О фазе цикла судили по соотношению различных типов клеток в мазке [6]. Животных с нарушенным циклом из опыта исключали. В день начала эксперимента проводили дополнительный осмотр и взвешивание животных. Исследование влияния на репродуктивную функцию Для исследовании влияния ФС на репродуктивную функцию его вводили
самкам подкожно в межлопаточную область в трех дозах - 5, 25 и 50 мг/кг в течение 15 дней. Дозы рассчитывались на основании данных массы тела животных.
В течение всего периода введения ФС у всех самок проводили исследование эстрального цикла.
По окончании периода введения ФС самок подсаживали к интактным самцам в соотношении 2:1 сроком на 2 эстральных цикла. Оплодотворение регистрировали с помощью вагинальных мазков. Для оценки способности к оплодотворению и зачатию вычисляли индекс, характеризующий отношение числа беременных животных к числу ссаженных в процентах.
Половину ссаженных самок каждой группы подвергали эвтаназии на 20-21 день беременности, на вскрытии подсчитывали количество желтых тел в яичниках, мест имплантаций в матке и количество живых и погибших плодов. Далее яичники подвергали морфологическому исследованию. На основании этих данных определяли уровень пред- и постимплантационной смертности зародышей.
Другую половину самок оставляли до родов и наблюдали за физическим развитием потомства до окончания вскармливания.
Исследование эмбриотоксического действия
Исследование возможных эмбрио-токсических свойств ФС проводили на крысах с датированным сроком начала беременности.
ФС вводили самкам подкожно с первого по девятнадцатый день беременности (ежедневно) в эффективной дозе -25 мг/кг. В качестве контроля использовали интактных животных, находящихся на обычном водном режиме и пищевом рационе.
Во время эксперимента контролировались следующие показатели: пред- и
постимплантационная эмбриональная смертность, анатомические пороки развития, задержка развития плодов, развитие потомства до окончания периода вскармливания (физическое развитие, скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов).
Результаты исследований обрабатывали методами параметрического и непараметрического анализа при помощи пакета программ 81ай81;юа 6.0.
Данные в таблицах представлены в виде средней арифметической и ошибки средней арифметической.
Определение соответствия распределения количественных данных закону нормального распределения проводили с использованием теста Колмогорова-Смирнова и Лиллифорса. В соответствии с установленным типом распределения, для определения статистической значимости различий между группами использованы параметрические (критерий Стьюдента для
2 групп, однофакторный дисперсионный анализ (ЛКОУЛ) для 4 групп) и непараметрические методы (критерии Манна-Уитни и Крускала-Уоллеса, соответственно). В качестве апостерионных методов анализа использован критерий Тьюки. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты воздействия ФС на продолжительность эстрального цикла самок, приведенные в таблице 1, свидетельствуют, что 15-дневное введение ФС во всех дозах не нарушало ритма эстрального цикла и его средней продолжительности. Стадии течки и периода между течками достоверно не отличались от таковых в контроле.
Таблица 1 - Влияние фармакологического средства на эстральный цикл крыс при много____________________кратном (15 дней) подкожном введении (Х±т)_____________________
^--^^ Группа Параметры контроль 5 мг/кг 25 мг/кг 50 мг/кг
Продолжительность эстраль-ного цикла, дни 4,85±0,032 4,75±0,028 4,73±0,035 4,79±0,037
Продолжительность течки, дни 1,41±0,016 1,36±0,027 1,42±0,054 1,34±0,043
Продолжительность периода между течками, дни 3,44±0,016 3,39±0,011 3,31±0,035 3,45±0,019
Яичники опытных, также как и контрольных крыс имели овальную или округлую форму и сложный рельеф, что обусловлено наличием желтых тел, растущих и зрелых фолликулов, и были полностью сформированы.
При изучении гистологических срезов (через весь орган) яичников крыс было установлено, что яичники опытных животных имели такой же набор специфических структур, как и яичники контрольных самок: полиморфные фолликулы, атрети-ческие и желтые тела.
На центральных срезах яичника у животных всех серий на желтые тела приходилась значительная часть площади среза. На препаратах выявлялись желтые тела последней генерации в стадии расцвета, а также 2-3 предшествовавших генераций в стадии обратного развития вплоть до финальной стадии - белого тела. Средний
диаметр желтых тел во всех группах, включая контрольную, составил 1,3 мм.
При подсчете числа желтых тел в яичниках экспериментальных крыс статистически значимого изменения данного показателя во всех группах по сравнению с контролем не выявлено. У самок, получавших исследуемый ФС в дозе 50 мг/кг, отмечена задержка созревания фолликулов по сравнению с контролем.
Основные показатели плодовитости крыс первой подгруппы, подвергшихся эвтаназии на 20-21 сутки беременности, представлены в таблице 2.
По результатам исследования установлено, что исследуемое ФС не оказывало негативного влияния на эмбрионы крыс: внешний осмотр плодов не выявил аномалий развития; пред- и постимпланта-ционная гибель зародышей не отличалась от контрольных значений. Видимых врож-
денных пороков у плодов не обнаружено. Таблица 2 - Показатели действия ФС на плодовитость при многократном
" Группа Параметры контроль 5 мг/кг 25 мг/кг 50 мг/кг
Количество ссаженных самок 10 10 10 10
Количество оплодотворенных самок 10 10 10 9
Количество беременных самок 9 9 8 9
Продолжительность беременности (сутки) 23,1±0,4 22,8±0,4 22,7±0,3 23,1±0,3
Количество эмбрионов на 1 крысу 9,2±3,1 10,4±4,2 8,9±3,1 9,8±4,5
Количество мест имплантации на 1 крысу 9,8±3,1 10,8±3,9 9,4±2,8 10,1±3,7
Количество желтых тел на крысу 10,9±2,7 11,1±3,5 10,5±3,0 10,8±3,4
Индекс, характеризующий способность к оплодотворению и зачатию, составил для контрольной и опытных групп 5 и 50 мг/кг - 90%, для опытной группы 25 мг/кг - 80%.
В ходе наблюдения за второй подгруппой опытных самок, у которых беременность окончилась родами, не выявлено негативного влияния ФС на плодовитость и беременность.
Морофметрические данные и вы- жизни представлены в таблице 3.
живаемость детенышей в первые 2 недели
Таблица 3 - Морофметрические данные и выживаемость детенышей опытных ________________________ и контрольной групп__________________________
—-——^-^Группа Параметры ——— контроль 5 мг/кг 25 мг/кг 50 мг/кг
Кранио-каудальный размер детеныша, мм (Х±т) 31,5±0,7 34,2±0,6 30,7±0,8 31,4±0,8
Масса детеныша на 4-е сутки после рождения, г (Х±т) 7,9±0,4 7,5±0,3 6,6±0,2 7,2±0,2
Гибель за 1-ю неделю, % (95% ДИ) 8,3 (1,0-30,1) 5,1 (0,6-18,1) 2,7 (0,1-15,1) 3,4 (0,1-19,9)
Гибель за 2-ю неделю, % (95% ДИ) 12,5 (2,6-36,5) 10,3 (2,7-25,6) 5,4 (0,7-9,5) 6,9 (0,9-25,8)
Средний размер и вес крысенка во всех группах колебались в пределах физиологической нормы. Уровень гибели крысят (%) в первые две недели постна-тального развития в опытных и контрольной группах достоверно не отличался.
Начиная с 8-дневного возраста, еженедельно наблюдали изменение массы тела детенышей контрольных и опытных самок. Данные прироста крысят представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Контроль массы тела крысят в течение первых 2-х месяцев постнатального
"~^^^^^^^^Группа Параметры контроль 5 мг/кг 25 мг/кг 50 мг/кг
8 суток 10,7±0,9 10,5±0,3 8,8±0,2 9,8±0,5
2 недели 16,9±1,0 16,0±1,1 15,0±2,8 13,4±0,7
4 недели 45,4±2,1 41,4±1,5 28,4±0,8 27,8±1,7
6 недель 71,5±2,6 66,0±2,2 49,6±1,5 57,2±10,6
8 недель 103,2±4,6 91,6±2,0 73,4±2,5* 77,8±4,7*
* - данные статистически достоверны (Р < 0,05)
Как видно из таблицы, на протяжении всего срока наблюдения детеныши самок, получавших высокие дозы ФС, несколько отставали в массе от контрольной группы и группы опытных самок, получавших наименьшую дозу ФС на основе пентозанполисульфата натрия. К концу 2месячного срока эта разница была достоверной. Физическое развитие потомства в постнатальном периоде жизни по всем критериям соответствовало контролю.
Гибели беременных самок, получавших подкожно исследуемое ФС в дозе 25 мг/кг (опытная группа) или физиологический раствор (контрольная группа) в со-
ответствующих объемах в течение с 1 по 19 день беременности, не отмечено.
Полученные данные показали, что у животных, получавших ФС в дозе 25 мг/кг, сроки беременности и плодовитость не отличались от контрольных показателей. У всех использованных в эксперименте самок беременность заканчивалась родами. Численность потомства, средний вес крысенка колебались в пределах физиологической нормы. Уровень гибели крысят на протяжении первых двух недель постна-тального развития не отличался от контрольных показателей (таблица 5).
Таблица 5 - Показатели эмбриотоксического действия ФС при многократном подкожном _____________введении самкам во время беременности в дозе 25 мг/кг (Х±т)_____________
Исследуемые показатели Контроль 25 мг/кг
Продолжительность беременности (сутки) 22,6±0,4 22,4±0,4
Среднее количество плодов на 1 крысу (Х±т) 9,2±1,1 10,8±0,8
Масса плода на 4-е сутки после рождения, г (Х±т) 7,89±0,4 8,12±0,2
Гибель за 1-ю неделю, % (95% ДИ) 8,3 (1,0-30,1) 9,1 (2,5-23,3)
Гибель за 2-ю неделю, % (95% ДИ) 12,5 (2,6-36,5) 13,6 (5,0-29,7)
Видимых врожденных пороков у новорожденных детенышей не обнаружено. Физическое развитие потомства в по-стнатальном периоде жизни по всем критериям соответствовало контролю.
Сроки отлипания ушных раковин, появления первичного шерстяного покро-
ва, прорезывания резцов, открытия глаз, открытия влагалища были такими же, как у детенышей интактных крыс. Достоверных отличий в динамике массы тела детенышей опытных и интактных самок не выявлено (таблица 6).
Таблица 6 - Контроль прироста массы тела крысят в течение первых 2-х месяцев постна_______________________________тального развития (Х±т)________________________________
Срок наблюдения Масса плода, г
Контроль 25 мг/кг
8 суток 10,7±0,86 12,0±0,42
2 недели 16,9±1,02 21,3±0,62
4 недели 45,4±2,10 40,2±1,60
6 недель 71,5±2,62 60,3±3,10
8 недель 103,2±4,57 90,2±4,68
Изучение эмоционально-
двигательного поведения показало, что введение исследуемого ФС белым крысам во время беременности не влияет на психофизиологическое развитие крысят в пост-натальном периоде. Результаты исследования эмоционального и психо-
опытных и контрольных самок в тесте «открытое поле» представлены в табл. 7.
Достоверных отличий в двигательной активности, исследовательском поведении и уровне стрессованности детенышей опытной и контрольной группы не выявлено.
физиологического развития детенышей
Таблица 7 - Показатели эмоционально-двигательного поведения и способности к тонкой
Исследуемые показатели Контроль 25 мг/кг
Латентный период выхода из центрального квадрата 12,6±4,73 7,5±1,34
Число умываний (груминг) 2,2±0,30 2,1±0,21
Число стоек без опоры 1,3±0,55 2,1±0,79
Число стоек с опорой 4,0±0,93 8,3±0,96*
Число стоек с заглядыванием 0,8±0,46 0,1±0,06
Исследование норок 0,8±0,32 0,7±0,24
Число актов дефекации 0,2±0,15 0,5±0,22
Число актов уринации 0±0 0±0
Период подхода к муляжу 26,7±6,16 41,6±11,47
Неактивное время 39,6±7,88 25,4±5,96
* - данные статистически достоверны (Р < 0,05)
ВЫВОДЫ
Таким образом, фармакологическое средство антитромбозного действия на основе пентозанполисульфата натрия в изученных дозах не обладает эмбриотоксиче-ским действием и не нарушает репродуктивной способности самок белых крыс.
SUMMARY
T.E. Vladimirskaya, N.N. Veyalkina, I.A. Shved, A.V. Adamovich, S.G. Krivorot, F.N. Kaputski, V.I.Torgashev RESEARCH OF THE INFLUENCE OF A DEVELOPED ANTITHROMBOTIC ACTION MEDICINE ON BASIS OF HEMICELLULOSES ON THE FEMALE WRITE RAT REPRODUCTIVE FUNCTION In this article, the results of assessment of the influence of a developed antithrombotic action medicine on basis of hemicelluloses on the female white rat reproductive function are adduced. Absence of negative influence of the investigated medicine on prolificacy and posterity development is shown.
Keywords: the antithrombotic action medicine, generative function, embryotoxic-
ity.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антикоагулянтная активность сульфа-тированных полисахаридов / Дрозд Н.К [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2006. - Т.69, № 6. - С. 5162.
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хаб-риева. - М., 2005. - С.87-99.
3. Руководящий нормативный документ РД-126-91. «Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)» - М.,1992.
4. ТКП 125-2008 «Надлежащая лабораторная практика», утвержденный постановлением Министерства здравоохранения Республики Беларусь № 56 от 28 марта 2008г.
5. Tendera, M. Epidemiology, treatment and guidelines for the treatment of heart failure in
Europe / M.Tendera // Eur. Heart J. - 2005. -V.7. - J5-J10.
6. Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: A practical histological guide to staging / F. R. Westwood // Toxicological Pathology. - 2008. - Vol. 36. - P. 375-384.
Адрес для корреспонденции:
223040, Республика Беларусь,
Минский район, пос. Лесной, д.31,
ЦНИЛ БелМАПО тел. раб. 375 1 7 265 33 64 email: tan [email protected]
Владимирская Т.Э.
Поступила 16.04.2010 г.
