CC BY
70
изучение репродуктивной токсичности лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина
о.и. коняева1, н.Ю. кульбачевская1, в.А. чалей1, н.П. Ермакова1, A.A. николина1, т.и. малова2, в.м. Бухман1
1ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2ООО «ВЕТА-ГРАНД»; Россия, 123056 Москва, ул. Красина, 27, стр. 2
Контакты: Ольга Ивановна Коняева natkulba@mail.ru
Цель исследования — изучение эмбриотоксичности, тератогенности и репродуктивной токсичности лиофилизированной лекарственной формы борхлорина на крысах.
Материалы и методы. Исследования проводились на 210 неинбредных крысах-самках и 105 неинбредных крысах-самцах с массой тела 250—300 г. В работе использована лиофилизированная лекарственная форма борированного хлорина е6 под названием «Борхлорин липосомальный, лиофилизат для приготовления дисперсии для инъекций 2,5 мг». Препарат вводили ежедневно внутривенно в течение 48 дней (самцам) и в течение 15 дней (самкам) в 2 суммарных дозах, соответствующих терапевтической дозе (ТД) для мышей при пересчете на крыс и 10 ТД. В качестве контроля были использованы интактные крысы, а также крысы-самцы и самки, получавшие внутривенно 0,9 % раствор натрия хлорида в режимах, соответствующих режиму введения препарата, и в объемах, соответствующих максимальному объему вводимого раствора. Результаты исследования. Изучено повреждающее действие лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина на генеративную функцию крыс — выявление возможного отрицательного действия препарата на стадии проге-неза (формирование мужских и женских гамет). Установлено, что лиофилизированная липосомальная лекарственная форма борхлорина обладает повреждающим действием на репродуктивную функцию самцов и самок и внутриутробное развитие плодов (эмбриотоксичность) крыс по индексу способности к оплодотворению и зачатию и по индексу постимплантационной гибели плодов. Постимплантационная гибель плодов в наибольшей степени выражена у самок, получавших препарат в суммарной дозе, соответствующей 10 ТД, и спаренных с интактными самцами. Лиофилизированная липосомальная лекарственная форма борхлорина не вызывает предимплантационную гибель плодов, не оказывает тератогенного действия. Заключение. Лиофилизированная лекарственная форма борхлорина обладает повреждающим действием на репродуктивную функцию самцов и самок и внутриутробное развитие плодов (эмбриотоксичность) неинбредных крыс по индексу способности к оплодотворению и зачатию и по индексу постимплантационной гибели плодов. Лиофилизированная лекарственная форма борхлорина не вызывает предимплантационную гибель плодов, не оказывает тератогенного действия, влияния на физическое развитие потомства и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания потомства.
Ключевые слова: борхлорин, эмбриотоксичность, тератогенность, репродуктивная токсичность, крысы
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-50-59
reproductive toxicity of the lyophilized liposomal dosage form of the borchlorin
O.I. Konyaeva1, N.Yu. Kulbachevskaya1, V.A. Chaley1, N.P. Ermakova1, A.A. Nikolina', T.I. Malova2, V.M. Bukhman1
'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow 115478, Russia; 2LLC «VETA-GRAND»; housing 2, 27Krasin Str., Moscow 123056, Russia
Introduction. The study investigates the embryotoxicity, teratogenicity and reproductive toxicity of lyophilized dosage form borchlorin on rats.
Materials and methods. The research was conducted on 210 outbred female rats and 105 outbred male rats weighing 250—300 g. We used a lyophilized dosage form borated chlorin e6 called «Borchlorin liposomal, lyophilisates for dispersion for injection 2.5 mg». The drug was administered intravenously daily for 48 days (males) and 15 days (females) in 2 corresponding total doses for therapeutic dose in mice and rats based on the 10-therapeutic doses. As a control, intact rats were used, as well as rats — males and females who received intravenous 0.9 % sodium chloride solution into the mode corresponding to the mode of administration, and in the amounts corresponding to the maximum volume of the injected solution.
Results of the study. To study the damaging effect of lyophilized liposomal formulation borchlorin on the generative function in rats — the identification of the possible negative effect of the drug on the progenesis stage (formation of male andfemale gametes). It was found that lyophilized liposomal formulation borchlorin has a damaging effect on the reproductive function of male and female and fetal deve-
Оригинальные статьи 51
lopment (embryotoxicity) rats on the index's ability to fertilization and conception and the index ofpostimplantation fetal loss. Postimplant death of the fetuses in most pronounced in females treated with a total dose of the drug, therapeutic doses corresponding to 10, coupled with intact males. The lyophilized liposomal formulation borchlorin pre-implantation does not cause the death of the fetus, has no teratogenic effects. Conclusion. The lyophilized dosage form borchlorin has a damaging effect on the reproductive function of male and female and fetal development (embryotoxicity) neinbrednyh rats on the index's ability to fertilization and conception and the index of postimplantation fetal loss. The lyophilized dosage form borchlorin pre-implantation does not cause the death of the fetus, has no teratogenic effects, effects on the physical development of the offspring, and the rate of maturation of the sensory-motor reflexes during the feeding of offspring. Key words: borchlorin, embryotoxicity, teratogenicity, reproductive toxicity, rats Введение изучению репродуктивной токсичности фармаколо-Борированный хлорин е6 разработан и синтези- гических средств, руководством по доклиническому рован в институте элементоорганических соедине- изучению новых фармакологических веществ и ру-ний им. А.Н. Несмеянова РАН (патент № 2 406 726 ководством по проведению доклинических исследо-от 20 декабря 2010 г.). В фотосенсибилизатор (хлорин ваний лекарственных средств [1—3]. е6) был введен бор, обладающий нейтронозахватны- Характеристика тест-системы ми свойствами. Борхлорин позволяет проводить Исследования проводились на 210 неинбредных фотодинамическую терапию и, при необходимости, крысах-самках и 105 неинбредных крысах-самцах дополнить ее бор-нейтрон-захватной терапией. Раз- с массой тела 250—300 г, полученных из аккредито-работанный препарат является оригинальным и об- ванного питомника лабораторных животных ООО ладает уникальными свойствами. В ФГБУ «Россий- «Кролинфо». Все животные были здоровы, имели ский онкологический научный центр им. ветеринарный сертификат качества и состояния здо-Н.Н. Блохина» (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) Мин- ровья. Для кормления животных использовали стан-здрава России разработана лиофилизированная ли- дартный промышленный сертифицированный бри-посомальная лекарственная форма (ЛЛЛФ) — препа- кетированный корм для грызунов с установленным рат Борхлорин. В лаборатории фармакологии сроком годности. Кормление проводили в одно и токсикологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» и то же время. Минздрава России проведено доклиническое токси- исследуемый препарат кологическое изучение ЛЛЛФ борхлорина с целью В исследованиях использована созданная в лабо-оценки ее безопасности и прогноза побочных и ток- ратории разработки лекарственных форм ФГБУ сических эффектов при клиническом применении «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России ЛЛЛФ больным. борированного хлорина е6 под названием «Борхло-Цель исследования — изучение эмбриотоксичности, рин липосомальный, лиофилизат для приготовления тератогенности и репродуктивной токсичности ЛЛЛФ дисперсии для инъекций 2,5 мг». В качестве раство-борхлорина на лабораторных животных (крысы). рителя служила вода для инъекций. Для клиническо-Задачи исследования: го использования ЛЛЛФ борхлорина рекомендована ♦ изучение повреждающего действия ЛЛЛФ при однократном внутривенном (в/в) применении. борхлорина на генеративную функцию Процедура введения крыс — выявление возможного отрицатель- Для изучения репродуктивной активности ного действия препарата на стадии прогенеза крыс-самцов ЛЛЛФ борхлорина вводили ежедневно (формирование мужских и женских гамет); в/в в течение 48 дней в фиксированной концентра- ♦ исследование потомства в конце антенаталь- ции 0,25 мг/мл (2,5 мг во флаконе растворяли ного периода развития; в 9,2 мл воды для инъекций) в 2 дозах: суммарная ♦ исследование потомства в постнатальный доза 2,5 мг/кг (разовая доза 0,05 мг/кг) доза, соответ-период развития; ствующая терапевтической дозе (ТД) для мышей ♦ оценка эмбриотропного действия ЛЛЛФ при пересчете на крыс (ТД для мышей — 5 мг/кг), борхлорина, регистрируемого в постнаталь- и суммарная доза 25 мг/кг (разовая доза 0,5 мг/кг), ном периоде развития. соответствующая 10 ТД. Для изучения репродуктивной активности ЛЛЛФ Материалы и методы борхлорина на крысах-самках препарат вводили Исследования проводили в соответствии c мето- ежедневно в/в 15-кратно в фиксированной концен-дическими рекомендациями по доклиническому трации 0,25 мг/мл в тех же суммарных дозах
2'2017 том 16 | vol. 16 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
52 Оригинальные статьи
(соответствующих ТД и 10 ТД для мышей), что и сам- Для исследования внутренних органов и костной цам (разовые дозы 0,17 и 1,7 мг/кг соответственно). системы с целью выявления аномалий развития плоВ качестве контроля были использованы интактные ды делили на 2 части. Одну часть фиксировали крысы, а также крысы-самцы и самки, получавшие в жидкости Боуэна и после фиксации подвергали в/в 0,9 % раствор натрия хлорида в режимах, соот- внешнему осмотру и исследованию внутренних ор-ветствующих режиму введения ЛЛЛФ борхлорина, ганов (в том числе головного мозга) по методике и в объемах, соответствующих максимальному объ- Вильсона в модификации отдела эмбриологии НИИ ему вводимого препарата. экспериментальной медицины РАМН с использова-Время проведения экспериментов нием толстых бритвенных срезов на разных уровнях Эксперимент проводился в период май — сен- головы и туловища плода. Другую часть плодов фик-тябрь 2016 г. сировали в 96 % этиловом спирте и после 10-дневной Критерии оценки репродуктивной токсичности фиксации исследовали состояние внутренних орга-В каждой группе использовали 30 крыс-самок нов по методу Стейплса, которые в дальнейшем и 15 крыс-самцов. По окончании введения пре- удаляли из тел зародышей. Затем плоды для выявле-парата крыс-самок подсаживали к самцам в со- ния аномалий развития скелета подвергали обработ-отношении 2 : 1 сроком на 2 эстральных цикла ке по методу Доусона, модифицированному отделом (10 дней). Оплодотворение регистрировали с по- эмбриологии НИИ экспериментальной медицины мощью вагинальных мазков. Во время экспери- РАМН, с окраской ализарином красным [1—3]. мента наблюдали за состоянием и поведением Плоды, внутренние органы и скелет исследовали беременных самок. с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9. Беременных самок контрольных и опытных Оставшихся беременных самок (по 10 крыс групп (по 20 крыс из каждой группы) выводили из каждой группы) оставляли до родов и наблюдали из эксперимента методом дислокации шейных по- за физическим развитием потомства до окончания звонков на 20-21-й день беременности (оставших- вскармливания (35 дней). ся беременных самок — по 10 крыс из каждой груп- Проводили ежедневное наблюдение за развитием пы — оставляли до родов). После вскрытия потомства, регистрировали общее физическое состо-брюшной полости удаляли матку и переносили ее яние и поведение, динамику массы тела и гибель в чашку Петри. После вскрытия матки подсчиты- крысят. Оценка включала следующие регистрируе-вали количество живых, мертвых, резорбцирован- мые показатели развития потомства: размер помета, ных плодов и количество мест имплантации. число живых и мертвых новорожденных, гибель Под бинокуляром проводили наружный осмотр новорожденных, масса тела (7, 14, 21, 30-й день), плодов с целью выявления внешних аномалий. отлипание ушной раковины (со 2-го дня), появление Плоды взвешивали и определяли краниокаудаль- первичного волосяного покрова (с 4-го дня), проре-ный размер (мм). В яичниках подсчитывали коли- зывание резцов (с 6-го дня), открытие глаз (с 12-го чество желтых тел. На основании этих данных дня), опускание семенников (с 23-го дня), открытие определяли уровень пред- и постимплантационной влагалища (с 28-го дня), переворачивание на плоско-смертности зародышей. сти (со 2-го дня), отрицательный геотаксис (с 5-го Предимплантационную смертность (%) опреде- дня), избегание обрыва (с 9-го дня), переворачива-ляли по разности между количеством желтых тел ние в свободном падении (с 20-го дня), тест «открыв яичниках и количеством мест имплантаций в мат- тое поле» (35-й день). ке; постимплантационную смертность (%) — по раз- методы статистической обработки данных ности между количеством мест имплантаций и коли- Статистическую обработку полученных данных чеством живых плодов. Для оценки способности проводили с помощью компьютерной программы к оплодотворению и зачатию вычисляли индекс, Microsoft Office Excel. Рассчитывали параметры, характеризующий отношение числа беременных обычно используемые в токсикологии. За достовер-животных к числу ссаженных, выраженный в % ные принимали различия прир <0,05. (индекс плодовитости). Предимплантационная _ Количество желтых тел - количество мест имплантации v ^о % смер™°сть, % Количество желтых тел Постимплантационная _ Количество мест имплантации - количество живых плодов v ^ % смертность % Количество мест имплантации Число оплодотворенных самок 1то/ - V 100 % Индекс плодовитости _ Число ссаженных самок
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 2'2017 том 16 | vol. 16
Результаты
В результате проведенных исследований по репродуктивной активности крыс-самцов, получавших ЛЛЛФ борхлорина в 2 изученных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, в течение 48 дней введения препарата не выявлено каких-либо клинических проявлений токсичности и изменений в поведенческих реакциях. При спаривании с интактными крысами-самками изменений сексуального поведения у крыс-самцов, получавших ЛЛЛФ борхлорина, не наблюдалось по сравнению с контрольными животными; эмоциональное состояние и поведенческие реакции крыс-самцов не отличались от поведения контрольных животных.
При изучении репродуктивной активности крыс-самцов после применения ЛЛЛФ борхлорина в 2 изученных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, при спаривании с интактными самками выявлено отрицательное действие на генеративную функцию самцов. Индекс способности к оплодотворению и зачатию отличался от значений контрольных групп на » 25 % (крысы-самцы, получавшие ЛЛЛФ борхлорина в ТД) и на » 35 % (крысы-самцы, получавшие ЛЛЛФ борхлорина в 10 ТД). Установлено отсутствие предимплантационной гибели зародышей. Процент предимплантационной гибели зародышей у интакт-ных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в обеих изученных дозах, составлял 0 % и не отличался от значений контрольных
животных. В то же время установлена постимпланта-ционная гибель плодов у интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими ЛЛЛФ борхло-рина. Процент постимплантационной гибели плодов у интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, был практически одинаковым и составлял 11,2 и 8,0 % соответственно, что более чем в 2—2,5 раза превышало процент постимпланта-ционной гибели плодов контрольных животных. При наружном осмотре живых плодов внешних видимых аномалий развития плодов отмечено не было. Масса тела плодов и краниокаудальный размер не отличались от значений контрольных групп (табл. 1).
При изучении репродуктивной активности крыс-самок во время и после введения ЛЛЛФ борхлорина в 2 изученных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, не выявлено каких-либо клинических проявлений токсичности и изменений в поведенческих реакциях. Сексуальное поведение крыс-самок после применения ЛЛЛФ борхлорина не отличалось от поведения контрольных животных.
При изучении репродуктивной активности крыс-самок после применения ЛЛЛФ борхлорина в 2 изученных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, при спаривании с интактными самцами выявлено отрицательное не зависимое от дозы действие на генеративную функцию самок. Индекс способности к оплодотворению и зачатию отличался от значений
Показатель Самцы
2 доза тд 2 доза 10 ТД NaCl Интактный контроль
Общее количество вскрытых самок 20 20 20 20
Количество беременных самок 15 13 20 19
Индекс способности к оплодотворению и зачатию (%) 75 65 100 95
Количество живых плодов* 7,9 9,2 10,7 11,9
Количество резорбций 5 1 0 1
Количество желтых тел в яичниках* 7,9 7,2 8,6 12,3
Количество мест имплантации* 8,9 10,0 11,0 12,5
Количество мертвых плодов 15 1 0 0
Предимплантационная гибель (%) 0 0 0 0
Постимплантационная гибель (%) 11,2 8,0 2,7 4,8
Средняя масса тела плодов при вскрытии (г) 6,1 ± 1,9 6,5 ± 1,9 6,8 ± 1,3 7,1 ± 1,2
Краниокаудальный размер (мм) 37,0 ± 8,9 39,0 ± 7,1 39,0 ± 6,9 40,0 ± 5,9
Примечание. — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД — терапевтическая доза.*Среднее количество на 1 беременную самку.
таблица 1. Результаты изучения репродуктивной токсичности неинбредных крыс-самцов, после применения лиофилизированной липосо-мальной лекарственной формы борхлорина спаренных с интактными самками
Таблица 2. Результаты изучения репродуктивной токсичности неинбредных крыс-самок, после применения лиофилизированнойлипосо-мальной лекарственной формы борхлорина спаренных с интактными самцами
Показатель Самки
2 доза ТД 2 доза 10 ТД NaCl Интактный контроль
Общее количество вскрытых самок 20 20 20 20
Количество беременных самок 15 17 20 19
Индекс способности к оплодотворению и зачатию (%) 75 85 100 95
Количество живых плодов* 11,0 7,2 10,6 11,9
Количество резорбций 4 2 1 1
Количество желтых тел в яичниках* 10,8 12,1 10,3 12,3
Количество мест имплантации* 11,5 12,1 11,1 12,5
Количество мертвых плодов* 2,0 3,8 3,0 0
Предимплантационная гибель (%) 0 0 0 0
Постимплантационная гибель (%) 0 40,0 4,5 4,8
Средняя масса тела плодов при вскрытии (г) 5,3 ± 1,7 5,6 ± 1,8 6,6 ± 1,3 7,1 ± 1,2
Краниокаудальный размер (мм) 38,0 ± 8,9 39,0 ± 10,0 40,0 ± 9,7 40,0 ± 5,9
терапевтическая доза. *Среднее количество на 1 беременную самку.
Примечание. NaCl — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД —
контрольных групп на » 25 % (крысы-самки, получавшие ЛЛЛФ борхлорина в ТД) и на » 15 % (крысы-самки, получавшие ЛЛЛФ борхлорина в 10 ТД). Установлено отсутствие предимплантационной гибели зародышей. Процент предимплантационной гибели зародышей у крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в обеих дозах и спаренных с интактны-ми самцами, составлял 0 % и не отличался от контрольных животных. Установлена высокая постим-плантационная гибель плодов у крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в 10 ТД и спаренных с интактными самцами. Процент постимплантаци-онной гибели плодов у животных в этой группе составлял 40 %. Постимплантационная гибель плодов у крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в ТД, отсутствовала. Процент постимплантационной гибели плодов у крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в ТД, не отличался от контрольных значений. При наружном осмотре живых плодов внешних видимых аномалий развития плодов отмечено не было. Масса тела плодов и краниокаудаль-ный размер не отличались от значений контрольных групп (табл. 2).
При исследовании физического развития потомства, рожденного от крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, и спаренных с интактными самцами, и от интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в тех же дозах,
обнаружено статистически недостоверное отставание в физиологическом приросте массы тела потомства по сравнению с контрольными животными (табл. 3). В период вскармливания этого потомства сенсорно-двигательные рефлексы были без особенностей и не отличались от рефлексов потомства контрольных животных (табл. 4, 5).
При патологоанатомическом исследовании не родившихся плодов в конце антенатального периода развития установлено отсутствие плодов с аномалиями внешнего развития, аномалиями развития костной системы, головного мозга и внутренних органов (табл. 6, 7).
При изучении эмбриотоксического и тератогенного действия ЛЛЛФ борхлорина у крыс-самок, получавших препарат в ТД и 10 ТД и спаренных с интактными самцами, и у интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими препарат в ТД и 10 ТД, уменьшения количества живых плодов не обнаружено. Количество живых плодов при изученных дозах не отличалось от показателей контрольных животных. Отмечено увеличение количества резорбций плодов в 4—5 раз у крыс-самок, получавших препарат в ТД и спаренных с интактны-ми самцами, и у интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими препарат в ТД, по сравнению с интактными животными. При применении ЛЛЛФ борхлорина у крыс-самок, получавших препарат в ТД и 10 ТД и спаренных с интактными
таблица 3. Изменение массы тела потомства, рожденного от неинбредных крыс после применения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина
Пол Е доза Сутки опыта
7 14 21 28 35
ТД 13,5 ± 1,5 23,5 ± 2,3 36,3 ± 3,8 61,4 ± 5,3 108,7 ± 7,4
Самки 10 ТД 11,2 ± 2,0 20,9 ± 3,4 31,5 ± 4,2 64,0 ± 6,0 116,5 ± 8,7
№С1 16,0 ± 3,2 31,1 ± 3,1 42,7 ± 3,5 72,1 ± 5,8 129,5 ± 8,2
ТД 12,5 ± 2,5 23,3 ± 2,9 31,0 ± 5,0 52,9 ± 4,7 103,2 ± 18,9
Самцы 10 ТД 14,0 ± 1,9 24,1 ± 4,2 40,6 ± 4,7 61,2 ± 5,1 102,7 ± 12,3
N0 15,3 ± 2,1 27,3 ± 3,5 39,9 ± 3,9 65,9 ± 4,8 118,2 ± 9,1
Интактный контроль 15,8 ± 3,1 26,8 ± 4,0 35,7 ± 4,2 67,3 ± 5,2 124,8 ± 8,9
Примечание. — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД — терапевтическая доза.
таблица 4. Результаты наблюдения за физическим развитием потомства, рожденного от неинбредных крыс-самок после применения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина
Показатель Самки интактный контроль
Е доза тд Е доза 10 тд ша
Общее число новорожденных 100 115 100 114
Число мертвых плодов 0 55 30 0
Индекс гибели (%) 0 48 30 0
Число погибших новорожденных 0 10 25 26
Дни гибели новорожденных (сут) - 1-2 1-2 2-3
Число особей разного самцы 50 30 20 42
пола самки 50 20 25 46
Отлипание ушной раковины (сут) 2-4 2-4 2-4 2-4
Появление первичного волосяного покрова (сут) 4-5 4-5 4-5 4-5
Прорезывание резцов (сут) 6-8 6-9 6-8 6-9
Открытие глаз (сут) 13-14 13-14 13-14 13-14
Опускание семенников (сут) 23-25 24-25 24-25 23-25
Открытие влагалища (сут) 27-29 28-30 27-29 28-30
Средняя масса тела крысят на 35-е сутки (г) 108,7 ± 7,4 116,5 ± 8,7 129,5 ± 8,2 124,8 ± 8,9
терапевтическая доза.
Примечание. — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД —
самцами, зарегистрировано 30 и 27 мертвых плодов соответственно, в отличие от контрольных животных. У интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими препарат в ТД, зарегистрировано 15 мертвых плодов в отличие от контрольных животных. У интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими препарат в 10 ТД, мертвых плодов не зарегистрировано, что не отличалось от показателей контрольных животных (табл. 8, 9).
Отмечено увеличение количества резорбций плодов в 5 раз у интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими препарат в ТД, по сравнению с контрольными животными. У интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими препарат в 10 ТД, количество резорбций плодов не отличалось от значений контрольных животных. Отмечено не зависимое от дозы увеличение количества резорбций плодов у крыс-самок, получавших
Таблица 5. Результаты наблюдения за физическим развитием потомства, рожденного от неинбредных крыс-самцов после применения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина
Показатель Самцы Интактный контроль
2 доза ТД 2 доза 10 ТД №С1
Общее число новорожденных 115 95 110 114
Число мертвых плодов 0 0 18 0
Индекс гибели (%) 0 0 16 0
Число погибших новорожденных 5 20 10 26
Дни гибели новорожденных (сут) 1-2 1-2 2-3 2-3
Число особей разного самцы 60 35 45 42
пола самки 50 40 37 46
Отлипание ушной раковины (сут) 2-4 2-4 2-4 2-4
Появление первичного волосяного покрова (сут) 4-5 4-5 4-5 4-5
Прорезывание резцов (сут) 6-9 6-8 6-9 6-9
Открытие глаз (сут) 13-14 13-14 13-14 13-14
Опускание семенников (сут) 23-25 23-25 24-25 23-25
Открытие влагалища (сут) 28-30 27-29 28-30 28-30
Средняя масса тела крысят на 35-е сутки (г) 103,2 ± 18,9 102,7 ± 12,3 118,2 ± 9,1 124,8 ± 8,9
Примечание. — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД — терапевтическая доза.
Таблица 6. Результаты патологоанатомического исследования плодов на тератогенное действие, полученных от неинбредных крыс-самцов после введения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина
Показатель Самцы Интактный
2 доза ТД 2 доза 10 ТД №С1 контроль
Внешний осмотр плодов
Число обследованных плодов 119 120 214 238
Число плодов с анома- абс. 0 0 0 0
лиями развития % 0 0 0 0
Состояние костной системы
Число обследованных плодов 59 60 107 119
Число плодов с анома- абс. 0 0 0 0
лиями развития % 0 0 0 0
Состояние внутренних органов
Число обследованных плодов 60 60 107 119
Число плодов с анома- абс. 0 0 0 0
лиями развития % 0 0 0 0
Примечание. NaCl — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД — терапевтическая доза.
ЛЛЛФ борхлорина: в 4 раза у крыс-самок, получав- самцами, по сравнению с контрольными животны-ших препарат в ТД и спаренных с интактными ми; у крыс-самок, получавших препарат в 10 ТД
таблица 7. Результаты патологоанатомического исследования плодов на тератогенное действие, полученных от неинбредных крыс-самок после введения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина
Показатель Самки Интактный контроль
2 доза ТД 2 доза 10 ТД NaCl
Внешний осмотр плодов
Число обследованных плодов 165 122 212 238
Число плодов с анома- абс. 0 0 0 0
лиями развития % 0 0 0 0
Состояние костной системы
Число обследованных плодов 82 61 106 119
Число плодов с анома- абс. 0 0 0 0
лиями развития % 0 0 0 0
Состояние внутренних органов
Число обследованных плодов 83 61 106 119
Число плодов с анома- абс. 0 0 0 0
лиями развития % 0 0 0 0
Примечание. NaCl — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД — терапевтическая доза.
таблица 8. Результаты изучения эмбриотоксического действия лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина на неинбредных крысах-самках
Показатель Самки Интактный контроль
2 доза ТД 2 доза 10 ТД NaCl
Количество беременных самок 15 17 20 19
Количество желтых тел* 10,8 12,1 10,3 12,3
Количество мест имплантации* 11,5 12,1 11,1 12,5
Количество живых плодов* 11,0 7,2 10,6 11,9
Количество резорбций 4 2 1 1
Количество мертвых плодов 30 27 3 0
Предимплантационная гибель (%) 0 0 0 0
Постимплантационная гибель (%) 0 40,0 4,5 4,8
Средняя масса тела плодов при вскрытии (г) 5,3 ± 1,7 5,6 ± 1,8 6,6 ± 1,3 7,1 ± 1,2
Краниокаудальный размер (мм) 38,0 ± 8,9 39,0 ± 10,0 40,0 ± 9,7 40,0 ± 5,9
терапевтическая доза. *Среднее количество на 1 беременную самку.
Примечание. NaCl — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД —
и спаренных с интактными самцами, количество резорбций плодов практически не отличалось от значений контрольных животных (табл. 8, 9).
Процент постимплантационной гибели плодов у интактных крыс-самок, спаренных с самцами, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, был практически одинаков и составлял 11,2 и 8 % соответственно, что более
чем в 2-2,5 раза превышало процент постимпланта-ционной гибели плодов контрольных животных. Установлена высокая постимплантационная гибель плодов у крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в дозе, соответствующей 10 ТД, и спаренных с интактными самцами. Процент постимплантационной гибели плодов у животных в этой группе составлял 40 %. Постимплантационная гибель плодов
Таблица 9. Результаты изучения эмбриотоксического действия лиофилизированной липосомальной лекарственной формы борхлорина на неинбредных крысах-самцах
Показатель Самцы Интактный контроль
2 доза ТД 2 доза 10 ТД №С1
Количество беременных самок 15 13 20 19
Количество желтых тел* 7,9 7,2 8,6 12,3
Количество мест имплантации* 8,9 10,0 11,0 12,5
Количество живых плодов* 7,9 9,2 10,7 11,9
Количество резорбций 5 1 0 1
Количество мертвых плодов 15 1 0 0
Предимплантационная гибель (%) 0 0 0 0
Постимплантационная гибель (%) 11,2 8,0 2,7 4,8
Средняя масса тела плодов при вскрытии (г) 6,1 ± 1,9 6,5 ± 1,9 6,8 ± 1,3 7,1 ± 1,2
Краниокаудальный размер (мм) 37,0 ± 8,9 39,0 ± 7,1 39,0 ± 6,9 40,0 ± 5,9
терапевтическая доза. *Среднее количество на 1 беременную самку.
Примечание. — 0,9 % раствор хлорида натрия; ТД —
у крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в дозе, соответствующей ТД, отсутствовала. Процент по-стимплантационной гибели плодов у крыс-самок, получавших ЛЛЛФ борхлорина в дозе, соответствующей ТД, не отличался от контрольных значений (табл. 8, 9).
Установлено отсутствие предимплантационной гибели плодов у животных во всех изученных группах (см. табл. 8, 9).
Заключение
ЛЛЛФ борхлорина при ежедневном в/в введении крысам-самцам в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, влияет на репродуктивную функцию самцов по критериям оценки мужской фертильно-сти, вызывая снижение способности к оплодотворению и зачатию и постимплантационную гибель плодов (индексы способности к оплодотворению и зачатию 75 и 65 %, постимплантационная гибель плодов 11,2 и 8 % соответственно).
ЛЛЛФ борхлорина при ежедневном в/в введении крысам-самкам в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, влияет на репродуктивную функцию самок по критериям оценки женской фертильности, вызывая снижение способности к оплодотворению и зачатию и дозозависимую постимплантационную гибель плодов (индексы способности к оплодотворению и зачатию 75 и 85 % соответственно). Препарат вызывает постимплантационную гибель плодов только у крыс-самок, получавших препарат в суммарной дозе 10 ТД (40 %).
ЛЛЛФ борхлорина при ежедневном в/в введении крысам-самцам и крысам-самкам в суммарных
дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, не вызывает предимплантационную гибель плодов.
Физическое развитие потомства, родившегося от интактных самок, оплодотворенных крысами-самцами, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, и от ин-тактных самцов, спаренных с крысами-самками, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, практически не отличалось от физического развития потомства контрольных животных.
Скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания у потомства, родившегося от интактных самок, оплодотворенных крысами-самцами, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, и от интактных самцов, спаренных с крысами-самками, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, не отличалась от скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов потомства контрольных животных.
Наружный осмотр плодов, исследование головного мозга, скелета и внутренних органов плодов не выявил тератогенного действия ЛЛЛФ борхлори-на во всех изученных дозах.
ЛЛЛФ борхлорина обладает эмбриотоксическим действием, вызывая постимплантационную гибель плодов у интактных самок, оплодотворенных крысами-самцами, получавшими ЛЛЛФ борхлорина в суммарных дозах, соответствующих ТД и 10 ТД, и у крыс-самок, получавших препарат только в суммарной дозе, соответствующей 10 ТД, и спаренных с интактными самцами.
Таким образом, по результатам проведенных исследований установлено, что ЛЛЛФ борхлорина обладает повреждающим действием на репродуктивную функцию самцов и самок и внутриутробное развитие плодов (эмбриотоксичность) неинбредных крыс по индексу способности к оплодотворению и зачатию и по индексу постимплантационной гибели плодов. Постимплантационная гибель плодов
в наибольшей степени (40 %) выражена у самок, получавших препарат в суммарной дозе, соответствующей 10 ТД, и спаренных с интактными самцами. ЛЛЛФ борхлорина не вызывает предимплантацион-ную гибель плодов, не оказывает тератогенного действия, влияния на физическое развитие потомства и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания потомства.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Методические рекомендации по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств. Ведомости Фармакологического Комитета 1998;1:13-20.
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 87-100.
3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. С. 80-93.
