Влияние сквалена на некоторые параметры состояния репродуктивной системы самок крыс в эксперименте Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 149-154

УДК: 612.63 DOI: 10.12737/23864

ВЛИЯНИЕ СКВАЛЕНА НА НЕКОТОРЫЕ ПАРАМЕТРЫ СОСТОЯНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ

СИСТЕМЫ САМОК КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Т.А. БЕРЕЖНОВА, Н.С. ПРЕОБРАЖЕНСКАЯ, А.Д. БРЕЗДЫНЮК, Н.Ю. ФАТЕЕВА

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н.Бурденко, ул. Студенческая, 10, Воронеж, 394035, Россия

Аннотация. Активация свободнорадикальных процессов во время беременности способствует возникновению таких проблем, как риск прерывания беременности, эклампсии, эмбриопатии и смерть плода. Применение антиоксидантов предохраняет плод и материнский организм от повреждений, вызванных оксилительным стрессом. В то же время, известно, что высокие дозы антиоксидан-тов могут оказывать токсическое действие на репродуктивную систему, и обладают проокисдантным эффектом. Сквален, тритерпеновый ненасыщенный углеводород, обладает высокой антиоксидантной активностью. Благодаря способности улавливать свободные радикалы сквален обладает многими положительными эффектами при патологических состояниях. Несмотря на имеющиеся данные о низкой токсичности сквалена, информации о его репродуктивной токсичности нами не обнаружено. Целью данного исследования являлось выявление влияния сквалена и его комбинации с витамином Ена показатели состояния репродуктивной системы и физические параметры развития новорожденных. Было установлено, что применение сквалена и его комбинации с токоферолом не оказывает токсического действия на эстральный цикл, не вызывают негативных изменении в физических параметрах беременных самок, и существенно не влияют на половой состав и физические характеристики новорожденных крысят первого поколения.

Ключевые слова: антиоксидант, альфа токоферол, сквален, репродукция, эстральный цикл, по-стнатальное развитие.

SQUALENE EFFECTS ON SOME PARAMETERS OF FEMALE RATS' REPRODUCTIVE SYSTEM IN

EXPERIMENT

T.A. BEREZHNOVA, N.S. PREOBRAZHENSKAYA, A.D. BREZDYNUK, N.YU. FATEEVA Burdenko Voronezh State Medical University, Studencheskaya str., 10, Voronezh, 394035, Russia

Abstract. Activation of free radical processes during pregnancy is associated with problems like abortion, embryopathy and fetal death. Antioxidant administration prevents fetus and mother from damage caused by oxidative stress. At the same time, it is known that high doses of antioxidants may provide toxic action on reproductive system, and have prooxidant effects. Squalene, i.e. triterpene nonsaturated carbohydrate, has a great antioxidant potency. It provides many positives effects in some pathological states due to free radicals scavenging activity. Despite data on low squalene toxicity, information on its reproductive tox-icity is absent. The purpose of current issue is to evaluate the squalene effects and its combination with toco-pherol on some parameters of female rats' reproductive system and early development of newborn rats. It was estimated that squalene and tocopherol co-administration has no toxic effect on the estrous cycle, it does not cause adverse changes in the physical parameters of pregnant females, and does not significantly affect the sex composition and physical characteristics of newborn rats of the first generation.

Key words: antioxidant, alfa-tocopherol, squalene, reproduction, estral cycle, postnatal development.

Актуальность. Нарушения функциониро- проблем, как риск прерывания беременности, вания женской репродуктивной системы со- эклампсии, эмбриопатии и смерть плода [9,11]. провождаются активацией перекисного окис- Эмбрион и плод особенно чувствительны к ления липидов. Высокий уровень свободных уровню свободных радикалов на ранних этапах радикалов способствует возникновению таких развития и в критические периоды [12]. Ряд ан-

149

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 149-154

тиоксидантов обладают защитным влиянием на различные системы плода и материнского организма, предохраняя их от повреждений, вызванных оксилительным стрессом [1-4,6-8]. В то же время, активность известных антиоксидан-тов зависит от их доз, продолжительности и способов применения. Известно, что высокие дозы витамина Е могут оказывать также токсическое действие на репродуктивную систему, и обладают проокисдантным эффектом. Системы неинфекционной этиологии, приобретенных в результате экстремальных воздействий. Сквален, принадлежащий к тритерпеновым ненасыщенным углеводородам, обладает высокой антиок-сидантной активностью. Благодаря способности улавливать свободные радикалы он обладает многими положительными эффектами при патологических состояниях, обусловленных высокой активностью свободно-радикальных процессов [5,10,13,14]. Несмотря на имеющиеся данные о низкой токсичности сквалена в диапазоне терапевтических доз, в доступной нам отечественной и иностранной литературе прямых упоминаний о репродуктивной токсичности сквалена и его комбинаций с другими антиоксидантами нами не обнаружено.

Цель исследования - изучить влияние сквалена на некоторые показатели состояния репродуктивной системы самок крыс в эксперименте.

Материалы и методы исследования. Работа была проведена на 15 половозрелых самцах и 85 половозрелых самках крыс с регулярным эстральным циклом, массой 170-190 г, прошедших 21-дневный карантин для выявления случайной беременности. Во время проведения эксперимента животные находились на стандартном пищевом рационе (гранулированный корм), без ограничения доступа к воде, в условиях стандартного светового режима дня.

Перед началом экспериментов у всех самок исследовали эстральный цикл на протяжении 2 недель с помощью вагинальных мазков с целью выявления возможных отклонений в характере и продолжительности цикла и исключения из эксперимента. Затем животные были разделены случайным образом на три группы: контрольная группа 1 (n=28), получавшая рафинированное растительное масло в объеме 0,5 мл; группа сравнения 3 (n=29), получавшая 6% сквален (Sigma-AldrichCo, St. Louis, MO, USA) 0,5 мл с до-

бавлением токоферола ацетата в дозе 225 ЕД/кг; группа сквалена 2 (n=28), получавшая 6% сквален 0,5 мл (Sigma-AldrichCo, St. Louis, MO, USA).

Изучаемые соединения вводились перо-рально только самкам с помощью специального зонда в одинаковом конечном объеме (1 мл) в одно и то же время, в перерывах между кормлениями. Влияние испытуемых веществ на репродуктивную систему экспериментальных животных изучали в несколько этапов. Продолжительность введения испытуемых веществ составляла 21 день на первом этапе, 10 дней на втором этапе, и 15 дней на третьем этапе, от момента обнаружения сперматозоидов во влагалищном мазке.

На первом этапе проводилось цитологическое исследование вагинальных мазков самок крыс, регистрировались продолжительность полового цикла и его отдельных фаз.

На втором этапе самок подсаживали к ин-тактным самцам в соотношении 2:1, на 2 эст-ральных цикла, во время которых производили ежедневное изучение влагалищного содержимого всех подсаженных самок. Первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках самок. Беременными считались те животные, у которых происходило родоразрешение.

Для оценки способности к оплодотворению и зачатию вычисляли индексы плодовитости и беременности. Индекс плодовитости характеризует отношение, выраженное в процентах, числа самок, у которых определялись в вагинальных мазках сперматозоиды к числу подсаженных к самцам. Индекс беременности характеризует отношение, выраженное в процентах, доносивших беременность животных к числу самок, у которых определялись в вагинальных мазках сперматозоиды. Регистрировали прирост массы тела за время беременности, количество плодов в помете и их распределение по полу, общий вес новорожденных.

На следующем этапе проводилось изучение физического развития полученного потомства. Наблюдения проводились за детенышами в период грудного вскармливания (с 1-й по 30-й день после рождения), оценивали и регистрировали параметры развития потомства в постнатальном периоде жизни, такие как отлипание ушных раковин, появление шерстного покрова, появление сосков, прорезывание резцов, открытие глаз. На

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 149-154

Таблица 1

7 сутки регистрировали показатель выживаемости крысят в каждой группе.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 8,0 (StatSoftInc., USA). При выборе метода сравнения данных учитывалась нормальность распределения признака. Для проверки гипотезы о равенстве средних для двух групп использовали t-критерий Стьюдента или непараметрический критерий Ман-на-Уитни. Значимыми признавались различия при p<0,05.

Результаты и их обсуждение. Клеточный состав влагалищного отделяемого крыс, которые в течение 21 дня получали внутрь изучаемые вещества, в фазе покоя (dioestrus) представлен нейтрофильными лейкоцитами, эпителиальными клетками и слизью; в фазе предтечки (prooestrus) во влагалищных мазках содержались пласты эпителиальных клеток; в фазе течки (oestrus) все поля зрения были покрыты чешуйками (безъядерные эпителиальные клетки); в фазе послетечки (metaoestrus) в цитологических мазках быстро исчезали чашуйки, появлялись лейкоциты и эпителиальные клетки. Таким образом, цитологическая картина по клеточному составу не отличалась от таковой у животных контрольной группы. Фазы полового цикла последовательно сменяли друг друга. Гистологическая картина влагалищного эпителия на разных стадиях полового цикла у самок, получавших комбинацию витамина Е и сквалена, и в группе, получавшей сквален внутрь в течение 21 дня, не отличалась от самок контрольной группы. В фазе покоя в мазках содержались нейтрофильные лейкоциты, эпителиальные клетки и слизь; в фазе предтечки - пласты эпителиальных клеток; в фазе течки - чешуйки (безъядерные эпителиальные клетки); в фазе послетечки - единичные чешуйки и появлялись лейкоциты и эпителиальные клетки. Продолжительность полового цикла и его отдельных фаз представлены в табл. 1.

Представленные данные свидетельствуют об отсутствии патологических изменений влагалищного эпителия на фоне ежедневного приема самками крыс композиции и Витамина Е в течение 21 дня. Ритм эстрального цикла и его средняя продолжительность, стадии течки и межтечкового периода достоверно не отличались от таковых в контроле.

Изменение продолжительности полового цикла

самок крыс при многократном (21 дней) Введении сквалена и витамина Е (М±т) дни, (п=30)

Продолжительность Группы

Контроль (n=28) Витамин Е+сквален (n=28) Сквален (n=29)

Эстральный цикл, дней 4,43±1,00 4,82±1,80 5,29±1,70

Течки, дней 1,19±0,18 1,19±0,24 1,19±0,20

Межтечковый период, дней 3,26±1,37 3,59±1,08 3,85±1,94

При исследовании репродуктивной способности самок крыс, получавших внутрь композицию не отмечалось существенного изменения числа беременных крыс в группах 2 и 3 по сравнению с животными из группы контроля. Снижение индекса плодовитости в группе «Сквален + витамин Е» было на 3,5% меньше контроля.

Таблица 2

Репродуктивная способность крыс при ежедневном введении внутрь сквалена и витамина Е самкам, (количество животных)

Показатели Группы

Контроль Витамин Е + сквален Витамин Е

Всего самок, N 28 28 29

Обсемененных, N 23 22 24

Беременных, N 12 13 13

Индекс плодовитости, % 82,1 78,6 82,7

Индекс беременности, % 52,2 59,1 54,2

Изучение способности того или иного вещества оказывать токсическое действие на развивающиеся зародыши, плоды и новорожденных приведены в табл. 3.

При ежедневном введении внутрь композицию у самок 2-й группы, сроки родов регистрировали на 0,67 дня раньше, чем в контрольной группе. Животные 3-й группы, принимавшие витамин Е, по срокам родов не отличались от животных контрольной группы. Масса тела беременных самок из 2 и 3 групп за сутки до родоразрешения и в первые сутки после ро-доразрешения достоверно не отличалась по сравнению с самками из контрольной группы (изменения массы тела составляли не более 6,7%). Суммарная масса крысят, родившихся у

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ - 2016 - Т. 23, № 4 - С. 149-154 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 149-154

самок из 2-й группы на 7,9 г больше, а из 3-й группы на 3,2 г меньше, по сравнению с суммарной массой крысят, родившихся у самок в группе контроля. Среднее количество крысят в помете во 2-й группе было недостоверно больше, чем в 1-й группе (группа контроля), а в 3-й группе среднее количество крысят не отличалось от контрольной группы.

Таблица 3

Влияние сквалена и витамина Е на течение и результаты беременности, (М±т)

Таким образом, было выявлено, что у самок белых крыс всех групп беременность протекала благополучно, заканчивалась родами в срок. У самок, получавших композицию, отмечалась невыраженная тенденция к укорочению сроков беременности (на 3,1%) по сравнению с самками из группы контроля, но сроки родов не выходили за пределы нормы. Численность потомства, его количество и масса тела находились в пределах физиологической нормы.

Таблица 4

Результаты родов при введении сквалена и витамина Е самкам белых крыс

У самок, получавших композицию (2-я группа), крысят женского пола родилось на 9% меньше, чем мужского пола. У самок, прини-

мавших витамин Е (3-я группа), крысят женского пола было на 7,6% больше, чем мужского пола. В группе контроля (1-я группа) крысят женского пола было на 3,4% больше, чем мужского пола. В группах крысят, родившихся у самок, принимавших сквален или витамин Е, количество мертворожденных существенно не отличалось от группы контроля. На распределение крысят по половой принадлежности при введение композиций самкам до зачатия в первую неделю беременности значительно не повлияло.

Наблюдения за физическим развитием детенышей проводились в период грудного вскармливания (с 1-й по 30-й день после рождения), оценивали и регистрировали параметры развития потомства в постнатальном периоде жизни, такие как отлипание ушных раковин, появление шерстного покрова, появление сосков, прорезывание резцов, открытие глаз. На 7 сутки регистрировали показатель выживаемости крысят в каждой группе. Полученные результаты приведены в табл. 5.

Таблица 5

Физическое развитие крысят в период грудного вскармливания, (М±т), дней

У крысят отлипание ушных раковин в обеих опытных группах регистрировали на 15,4% позже сроков у крысят контрольной группы. У крысят из 2 и 3 групп появление шерстного покрова и сосков по срокам не отличалось от этих же показателей у крысят контрольной группы. У крысят из группы самок, получавших композицию, на 1,5 суток позже открывались глаза (р<0,05) и на 0,4 дня позже прорезывались зубы, чем у крысят из 1 группы (группа контроля). Открытие глаз и прорезывание резцов у крысят из группы самок, принимавших витамин Е, по срокам достоверно не отличались от этих же показателей у крысят контрольной группы.

Показатели Группы

Контроль ("=12) Витамин Е + сквален (n=13) Витамин Е (n=13)

Срок беременности, дни 21,67±0,57 21,00±0,25 21,67±0,47

Масса перед родами, г 289,8±17,50 283,4±7,20 271,3±25,40

Масса после родов, г 235,4±12,00 218,6±11,00 232,7±36,00

Суммарная массакрысят, г 46,4±12,70 54,3±3,10 43,2±17,50

Количество крысят в помете, п 7,3±1,70 9,0±0,80 7,3±3,10

Показатели Группы

Контроль ("=12) Витамин Е + сквален (n=13) Витамин Е (n=13)

Новорожденные, п (%) 87 116 91

Мертворожденные, п (%) 2 (2,3 %) 3 (2,6%) 2 (2,2)

Живорожденные, п (%) 85 113 89

Женского пола, п (%) 45 (51,7%) 53 (45,7%) 49 (53,8%)

Мужского пола, п (%) 42 (48,3%) 63 (54,3%) 42 (46,2%)

Показатели Группы

Контроль (n=85) Витамин Е + сквален (n=113) Витамин Е (n=89)

Отлипание ушной раковины 2,6±0,5 3,0±0,0 3,0±0,0

Появление шерстного покрова 8,0±0,0 8,0±0,0 8,0±0,0

Появление сосков 8,0±0,0 8,0±0,0 8,0±0,0

Прорезывание резцов 11,3±1,0 11,7±0,5 11,3±0,8

Открытие глаз 15,4±0,8 16,9±0,5 15,0±0,0

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 149-154

Выводы. Введение сквалена в пищевой рацион самок крыс за 1 месяц до зачатия и в течение первой недели беременности не приводит к отрицательному воздействию на течение бере-

Литература

1. Бровкина И.К., Конопля А. А., Утешаев Б.С. Имму-нометаболические эффекты взаимодействия жирорастворимых и водорастворимых витаминов при токсических формах анемии // Экспер. и клин. фар-макол. 2004. №3. С. 51-55.

2. Дармограй В.Н., Карасева Ю.В., Морозов В.Н., Морозова В.И., Наумова Э.М., Хадарцев А.А. Фитоэк-дистероиды и фертильные факторы как активаторы синтоксических программ адаптации // Вестник новых медицнских технологий. 2005. № 2. С. 82-84.

3. Иванова А.С., Попова И.Г., Назаров С.Б. Активность свободнорадикальных процессов и состояние эри-трона у плодов крыс при хронической нитритной интоксикации и введении альфа-токоферола // Экс-пер. и клин. фармакол. 2011. №2. С. 23-25.

4. Иванова А.С., Назаров С.Б. Характеристика защитного действия а-токоферола по показателям эрит-роцитарной системы при длительной нитритной интоксикации у крыс // Экспер. и клин. фармакол. 2004. №4. С. 38-40.

5. Сквален: физиологические и фармакологические свойства / Музалевская Е.Н., Мирошниченко Л.А., Николаевский В.А. [и др.] // Экспер. и клин. фармакол. 2015. №6. С. 30-36.

6. Хадарцев А.А., Морозов В.Н., Карасева Ю.В., Хадар-цева К.А., Гордеева А.Ю. Психонейроиммунологи-ческие программы адаптации, как модели дизадап-тации у женщин с нарушенным репродуктивным циклом // Фундаментальные исследования. 2012. № 5 (часть 2). С. 359-365.

7. Хадарцев А.А., Морозов В.Н., Карасева Ю.В., Хадар-цева К. А., Фудин Н.А. Патофизиология стресса, как баланс стрессогенных и антистрессовых механизмов // Вестник неврологии, психиатрии и нейрохирургии. 2012. № 7. С. 16-21.

8. Acuff R.V., Dunworth R.G., Webb L.W. Transport of deuterium-labeled tocopherols during pregnancy // Am. J. Clin. Nutr. 1998. Vol. 67. C. 459-464.

менности, количество плодов, и показатели физического развития потомства первого поколения.

References

Brovkina IK, Konoplya AA, Uteshaev BS. Immunome-tabolicheskie effekty vzaimodeystviya zhirorastvori-mykh i vodorastvorimykh vitaminov pri toksicheskikh formakh anemii [Immunometabolic effects of interaction of the fat-soluble and water-soluble vitamins with the toxic forms of the anemia]. Eksper. i klin. farmakol. 2004;3:51-5. Russian.

Darmogray VN, Karaseva YuV, Morozov VN, Morozo-va VI, Naumova EM, Khadartsev AA. Fitoekdisteroidy i fertil'nye faktory kak aktivatory sintoksicheskikh programm adaptatsii [Fitoekdisteroidy and fertile factors as the activators of the sintoksicheskikh programs of the adaptation]. Vestnik novykh meditsnskikh tekhno-logiy. 2005;2:82-4. Russian.

Ivanova AC, Popova IG, Nazarov SB. Aktivnost' svo-bodnoradikal'nykh protsessov i sostoyanie eritrona u plodov krys pri khronicheskoy nitritnoy intoksikatsii i vvedenii al'fa-tokoferola [Activity of free-radical processes and the state of erythron in the fetuses of rats during the chronic nitrite intoxication and the introduction of the alpha- tocopherol]. Eksper. i klin. farmakol. 2011;2:23-5. Russian.

Ivanova AS, Nazarov SB. Kharakteristika zashchitnogo deystviya a-tokoferola po pokazatelyam eritrotsitarnoy sistemy pri dlitel'noy nitritnoy intoksikatsii u krys [Characteristic of the protective action of a- tocopherol according to the indices of erythrocytic system with the prolonged nitrite intoxication in the rats]. Eksper. i klin. farmakol. 2004;4:38-40. Russian.

Muzalevskaya EN, Miroshnichenko LA, Nikolaevskiy VA, et al. Skvalen: fiziologicheskie i farmakologi-cheskie svoystva [Squalene: the physiological and pharmacological properties]. Eksper. i klin. farmakol. 2015;6:30-6. Russian.

Khadartsev AA, Morozov VN, Karaseva YuV, Khadart-seva KA, Gordeeva AYu. Psikhoneyroimmunologi-cheskie programmy adaptatsii, kak modeli dizadaptat-sii u zhenshchin s narushennym reproduktivnym tsik-lom [Psycho-neuroimmunological programs of adaptation as the models of disadaptation in women with the disrupted reproductive cycle]. Fundamental'nye issle-dovaniya. 2012;5(chast' 2):359-65. Russian. Khadartsev AA, Morozov VN, Karaseva YuV, Khadart-seva KA, Fudin NA. Patofiziologiya stressa, kak balans stressogennykh i antistressovykh mekhanizmov [Pa-thophysiology of stress as the balance of the stressogen-ic and anti-stress mechanisms]. Vestnik nevrologii, psikhiatrii i neyrokhirurgii. 2012;7:16-21. Russian. Acuff RV, Dunworth RG, Webb LW. Transport of deuterium-labeled tocopherols during pregnancy. Am. J. Clin. Nutr. 1998;67:459-64.

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 4 - P. 149-154

9. The role and modulation of the oxidative balance in pregnancy / Biondi C., Pavan B., Lunghi l. [et al.] // Curr. Pharm. Des. 2005. №11. P. 2075-2089.

10. Farvin K.H.S., Surendra R.A., Anandan R. Protective Effect of Squalene on Endogenous Antioxidant Vitamins in Experimentally Induced Myocardial Infarction in Rats // Asian journal of biochemistry. 2009. № 4. C. 133-139.

11. Fujii J., Iuchi Y., Okada F. Fundamental roles of reactive oxygen species and protective mechanisms in the female reproductive system // Reprod. Biol. Endocrinol. 2005. №3. C. 43-56.

12. Kobayashi M., Nakamura H., Yodoi J., Shiota K. Immu-nohistochemical localization of thioredoxin and gluta-redoxin in mouse embryos and fetuses // Antioxid. Re-dox signal. 2000. P. 653-663.

13. Pallavi S., Ganesan B., Anandan R. Beneficial effect of dietary squalene supplementation on experimentally induced cardiomyopathy in rats // International journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences international journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences. 2012. № 2.

14. Preobrazhenskaya N.S., Pokrovskij M.V., Berezhno-va T.A., Levchenko Yu.A. Hypolipidemic effects of amaranth oil in experimental doxorubicine cardiomyo-pathy // International journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences. 2016. № 3. P. 10171021.

Biondi C, Pavan B, Lunghi l, et al. The role and modulation of the oxidative balance in pregnancy. Curr. Pharm. Des. 2005;11:2075-89.

Farvin KHS, Surendra RA, Anandan R. Protective Effect of Squalene on Endogenous Antioxidant Vitamins in Experimentally Induced Myocardial Infarction in Rats. Asian journal of biochemistry. 2009;4:133-9.

Fujii J, Iuchi Y, Okada F. Fundamental roles of reactive oxygen species and protective mechanisms in the female reproductive system. Reprod. Biol. Endocrinol. 2005;3:43-56.

Kobayashi M, Nakamura H, Yodoi J, Shiota K. Immu-nohistochemical localization of thioredoxin and gluta-redoxin in mouse embryos and fetuses. Antioxid. Re-dox signal; 2000:653-63.

Pallavi S, Ganesan B, Anandan R. Beneficial effect of dietary squalene supplementation on experimentally induced cardiomyopathy in rats. International journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences international journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences. 2012;2.

Preobrazhenskaya NS, Pokrovskij MV, Berezhnova TA, Levchenko YuA. Hypolipidemic effects of amaranth oil in experimental doxorubicine cardiomyopathy. International journal of research in pharmaceutical and biomedical sciences. 2016;3:1017-21.