CC BY
28
УДК 615.32
I «ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЙ УСЛОВИЙ ХРАНЕНИЯ НА ЛРС: ТРАВУ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО И ЛИСТЬЕВ ОРТОСИФОНА ТЫЧИНОЧНОГО»
Заболеева-Зотова Д.В., Торшина Ю.В.
Научный руководитель - д.фарм. н., доцент С.О.Лосенкова
Смоленский государственный медицинский университет, Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской 28.
zaboleevazotova@bk.ru - Заболеева-Зотова Дарья Викторовна Резюме. Данная работа посвящена исследованию влияний условий хранения на лекарственное растительное сырьё: траву Зверобоя, продырявленного и листьев Ортосифона тычиночного. Данное сырье было помещено в 4 условия: повышенная температура, пониженная температура, повышенная влажность и действия светом на 1 месяц и 3 месяца. После этого проводилось исследования качественного и количественного состава.
Ключевые слова: лекарственное растительное сырье, хранения, условия хранения, спектрофотометрическое определение, трава Зверобоя продырявленного, листья Ортосифона тычиночного. i "INVESTIGATION OF THE INFLUENCE OF THE CONDITIONS OF STORAGE ON HLS: THE HERBAE HYPERICUM PERFORATUM AND FOLIAGE OF ORTHOSIPHON STAMINEUS"
Zaboleeva-Zotova D. V.
Scientific advisers - professor S. O. Losenkova
Smolensk State Medical University, 28, Krupskoy St., Smolensk, 214019, Russia
Summary. This work is devoted to the study of the effect of storage conditions on the herbaceous medicinal raw materials, Hypericum perforatum and leaves of Ortosiphon staminate. This raw material was placed in 4 conditions: high temperature, low temperature, high humidity and light action for 1 month and 3 months. After that, a study of the qualitative and quantitative composition.
Keywords: medicinal plant materials, storage, storage conditions, spectrophotometric determination, herbae Hypericum perforatum, foliage of Ortosiphon staminate.
Введение. Обеспечения правильного хранения лекарственного растительного сырья играет очень важную роль в снабжении им населения и пациентов. Качественный и количественный состав в ЛРС зависит от протекающих в них физических, химических и биологических процессов. Эти процессы, протекающие при хранении лекарств, могут привести к изменению их химического состава или физических свойств.
Изучения данной проблемы обусловлено тем, что при обеспечении населения лекарственным сырьём, необходимо учитывать все правила по хранению лекарственного растительного сырья. В аптеках сырье должно храниться по правилам, которые регламентирует Государственная Фармакопея XIV издания и Приказа Минзравсоцразвития РФ от 23.08.2010 N 706н (ред. От 28.12.2010) «Об утверждении правил хранения лекарственных средств».
В процессе хранения должны учитываться факторы, влияющие на качество сырья: содержание помещений, наличие вентиляции, отсутствие амбарных вредителей, физических факторов, как - влажность, прямое попадание солнечного света, действие температуры.
Критерием стабильности лекарственного растительного сырья служит сохранение его качества, т.е. внешнего вида, доброкачественности и количественного содержания действующих веществ, обеспечивающихся при правильном хранении ЛРС. Снижение количественного и качественного содержания биологических активных веществ в ЛРС подтверждает его нестабильность [5,11].
Целью нашей работы являлось определение влияний условий хранения: действия света, повышенной температуры, пониженной температуры и повышенной влажности, на содержания БАВ в ЛРС в течение 1 месяца и 3 месяцев.
Методика. Объектами нашего исследования служили трава Зверобоя продырявленного и листья Ортосифона тычиночного, которые были помещены на 1 месяц и 3 месяца в условия хранения: повышенной температуры, пониженной температуры, повышенной влажности и действия светом. Исследование проводилось в несколько этапов. На первом этапе было приобретено сырье Зверобоя продырявленного и Ортосифона тычиночного (Производитель: АО «Красногорсксредства», Россия). После этого сырье поместили в установленные за ранее условия хранения на 1 месяц. На втором этапе исследования по прошествии месяца определяли качественный состав БАВ в траве Зверобоя продырявленного и листьях Ортосифона тычиночного. У травы Зверобоя действующими веществами являются флавоноиды, на которые и проводились реакции. Определение проводили по следующей методике: Отвешивали 3г сырья и помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл. Добавляли 30 мл 70% этанола. Проводи экстракцию на водяной бане с обратным холодильником в течение 10-15 минут [1,5]. Полученное извлечение охлаждали и фильтровали. После этого проводили качественные реакции (таблица 1).
Таблица 1. Качественные реакции на флавоноиды
Название реакции Описание методики
Цианидиновая реакция (проба по Брианту) В 2 пробирки (одна контрольная) наливают в 1 мл фильтрата. В одну из пробирок добавляют щепотку порошка магния. В каждую из пробирок затем добавляют несколько капель концентрированной соляной кислоты (при малом количестве флавоноидов необходимо нагревание на водяной бане в течение 10 минут).
Реакция с хлоридом алюминия К 1 мл фильтрата добавляют 2-3 капли 5% спиртового раствора хлорида алюминия.
Реакция с хлоридом железа (III) К 1 мл фильтрата добавляют 2-3 капли 1% раствора хлорида железа (III).
Реакция с ацетатом свинца средним: К 1 мл фильтрата добавляют 3-5 капель раствора ацетата свинца среднего.
Реакция с раствором аммиака К 1 мл фильтрата добавляют 3-5 капель раствора аммиака.
Реакция с раствором едкой щелочи К 1 мл извлечения добавить 2-3 капли 5% спиртового раствора NaOH.
У листьев Ортосифона действующим веществом являются сапонины, на которые и проводились качественные реакции. Определение проводилось по следующей методике: Экстракция из растительного сырья: Отвешиваем 2 г сырья и нагреваем с 10 мл воды в течение 3-5 мин. Извлечение охлаждаем и фильтруем [1,5]. После этого проводились качественные реакции (таблица 2).
Таблица 2. Качественные реакции на сапонины
Название реакции Описание методики
Реакция пенообразования (метод Фонтан-Канделя) В 5 пробирок помешали по 5 капель 0,1 Н раствора кислоты хлористоводородной, затем во все пробирки прибавляли по 3 мл водного извлечения из травы Ортосифона тычиночного и сильно встряхивали.
Реакция Санье В 5 пробирок добавляли по 1 мл водного извлечение и прибавляли конц. кислоту серную и уксусный ангидрид.
Реакция с раствором нитрата натрия Добавляли к 2 мл водного извлечения 1 мл 10% раствора натрия нитрата и 1 капли кислоты серной концентрированной.
Реакция осаждения средним ацетатом свинца К 2 мл водного извлечения прибавляли несколько капель среднего ацетата свинца.
На третьем этапе производили обнаружения флавоноидов (рутина) в сырье травы Зверобоя продырявленного и Ортосифона тычиночного методом ТСХ по следующей методике: 3 г сырья и помещаем в колбу со шлифом вместимостью 100 мл. Добавляют 30 мл 70% этанола. Проводили экстракцию на водяной бане с обратным холодильником в течение 10-15 минут. Полученное извлечение охлаждали и фильтровали.
Хроматографирование проводили 20 мин (проб растворителя 13 см), затем хроматограмму высушить на воздухе под тягой. Отмечали окраску пятен в видимом и УФ-свете. Далее обрабатывали хроматограмму 2% спиртовым раствором хлорида алюминия и высушивали в сушильном шкафу при температуре 90-100 °С. Наблюдали окраску пятен в видимом и УФ-свете. После этого для каждого пятна было рассчитано Rf для подтверждения наличия рутина (Ж рутина - 0,3-0,6) [5]. Расчеты осуществлялись по формуле:
' в
где:
А - расстояние, пройденное веществом;
В - расстояние, пройденное растворителем.
На четвертом этапе проводили количественное определение содержания флавоноидов в сырье, которое проводили в соответствии с ОФС.2.5.0015.15 «Зверобоя трава» [5]. После получения извлечений проводили определение спектрофотометрическим методом и рассчитывали содержания флавоноидов (X) по формуле:
X = -
A0*Ccr*W1*W2 Acv*l*a*Va
где:
Ао - оптическая плотность раствора Б СО рутины; Сст - содержания основного вещества в СО рутина, %; Wl - объём раствора первый;
- объём раствора второй; Аст - оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора; 1 - толщина кюветы, см; а - навеска сырья, г; VI - объём аликвоты.
На последующих этапах проводились те же анализы в образцах трехмесячного хранения. Все эксперименты проводились на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии с курсом фармации ДПО Смоленского государственного медицинского университета.
Представленные экспериментальные данные проводились в 6-кратной биологической повторности. Достоверность результатов оценивали по стандартным методикам с использованием программ Excel 2016. Результаты статистической обработки свидетельствуют о том, что ошибка методик с доверительной вероятностью 95% не превышает 3 % (таблица 3, 4, 5, 6).
Таблица 3. Метрологические характеристики определения содержания флавоноидов (рутина) в траве Зверобоя
продырявленного месячного хранения
Метод определения концентрации Среднее значение (X) Дисперсия (S2) Стандартное отклонение (Sx) Доверительная вероятность (P) Критерий Стьюдента (ty(95,6) Полуширина доверительного интервала (Ax) Относительная ошибка (в, %)
Контрольный образец 2,46 ± 1,666 ± 0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Повышенная влажность 0,67 ± 1,666 ± 0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Пониженная температура 1,50 ±0,001 ±0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Повышенная температура 2,06 ±1,666 ±0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Действие светом 1,35 ±1,666 ±0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Таблица 4. Метрологические характеристики определения содержания флавоноидов (рутина) в траве Зверобоя продырявленного трехмесячного хранения
Метод определения концентрации Среднее значение (X) Дисперсия (S2) Стандартное отклонение (Sx) Доверительная вероятность (P) Критерий Стьюдента (ty(95,6) Полуширина доверительного интервала (Ax) Относительная ошибка (в, %)
Контрольный образец 2,46 ± 1,666 ± 0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Повышенная влажность 0,22 ± 1,666 ± 0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Пониженная температура 1,50 ±0,001 ±0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Повышенная температура 1,40 ±1,666 ±0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Действие светом 0,94 ±1,666 ±0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Таблица 5. Метрологические характеристики определения содержания флавоноидов (рутина) в листья Ортосифона тычиночного месячного хранения
Метод определения концентрации Среднее значение (X) Дисперсия (S2) Стандартное отклонение (Sx) Доверительная вероятность (P) Критерий Стьюдента (ty(95,6) Полуширина доверительного интервала (Ax) Относительная ошибка (в, %)
Контрольный образец 1,162 ± 1,666 ± 0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Повышенная влажность 0,390 ± 1,666 ± 0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Пониженная температура 0,685 ±0,001 ±0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Повышенная температура 0,721 ±1,666 ±0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Действие светом 0,655 ±1,666 ±0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Таблица 6. Метрологические характеристики определения содержания флавоноидов (рутина) в листья Ортосифона тычиночного трехмесячного хранения
Метод определения концентрации Среднее значение (X) Дисперсия (S2) Стандартное отклонение (Sx) Доверительная вероятность (P) Критерий Стьюдента (ty(95,6) Полуширина доверительного интервала (Ax) Относительная ошибка (в, %)
Контрольный образец 1,162 ± 1,666 ± 0,04 0,95 2,571 0,1 0,02
Повышенная влажность 0,267 ± 1,666 ± 0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Пониженная температура 0,633 ±0,001 ±0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Повышенная температура 0,670 ±1,666 ±0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Действие светом 0,604 ±1,666 ±0,004 0,95 2,571 0,01 0,002
Результаты исследования и их обсуждение. Результаты качественного анализа представлены в таблицах 7 и 8.
Таблица 7. Результаты качественного анализа травы Зверобоя на флавоноиды
Название реакции Аналитический эффект Соответствия результатов
Цианидиновая реакция (проба по Брианту) розовое окрашивание, обусловлено образованием антоциановых пигментов Соответствует
Реакция с хлоридом алюминия появляется желто-зеленая флюоресценция свидетельствует о наличии двух оксигрупп Соответствует
Реакция с хлоридом железа (III) образование черно-синего окрашивания, свидетельствует о наличии веществ с рядовой триоксигруппировкой в кольце Соответствует
Реакция с ацетатом свинца средним: появляется синее окрашивание, которое свидетельствует о наличии антоцианов Соответствует
Реакция с раствором аммиака образование желтого окрашивания, при нагревании переходящее в красное свидетельствует о наличии флавонов, флаваноидов, флавононов Соответствует
Реакция с раствором едкой щелочи образование синего окрашивание свидетельствует о наличии антоцианов Соответствует
Таблица 8. Результаты качественного анализа листьев Ортосифона на сапонины
Название реакции Аналитический эффект Соответствия результатов
Реакция пенообразования (метод Фонтан-Канделя) образование обильной стойкой пены свидетельствует о наличии сапонинов Соответствует
Реакция Санье наблюдается желтое окрашивание, что свидетельствует о наличии сапонинов Соответствует
Реакция с раствором нитрата натрия образование кроваво-красного окрашивания, что свидетельствует о наличии сапонинов Соответствует
Реакция осаждения средним ацетатом свинца образование осадка с ацетатом свинца средним, что свидетельствует о наличии сапонинов Соответствует
После храмотографирования и обработкой 2% спиртовым раствором хлорида алюминия наблюдали свечения ярко-желтым светом в УФ-области. Результаты расчета Rf для травы Зверобоя продырявленного и листьев Ортосифона тычиночного ставило 0,3 и 0,5.
Результаты количественного определения флавоноидов (рутина), % в образцах, которые хранились в различных условиях травы Зверобоя и листьев Ортосифона представлены в таблицах 9 и 10.
Таблица 9. Результаты количественного определения рутина, % в траве Зверобоя продырявленного месячного и трехмесячного хранения
Контрольный образец Повышенная Пониженная Повышенная Действия
влажность температура температура светом
1 месяц
2,46 ± 0,1 0,67 ± 0,01 1,50 ± 0,1 2,06 ± 0,1 1,35 ± 0,1
3 месяца
2,46 ± 0,1 0,22 ± 0,01 1,50 ± 0,1 1,40 ± 0,1 0,94 ± 0,01
Таблица 10. Результаты количественного определения рутина, % в листьях Ортосифона тычиночного
месячного и трехмесячного хранения
Контрольный образец Повышенная Пониженная Повышенная Действия
влажность температура температура светом
1 месяц
1,162 ± 0,1 0,390 ± 0,01 0,685 ± 0,01 0,721 ± 0,01 0,655 ± 0,01
3 месяца
1,162 ± 0,1 0,267 ± 0,01 0,633 ± 0,01 0,670 ± 0,01 0,604 ± 0,01
Заключение. В зависимости от условий хранения сырья его качественный и количественный состав может изменяться. В своей работе мы поместили два вида различных групп сырья (Трава Зверобоя продырявленного и листья Ортосифона тычиночного) в различные условия хранения: повышенной температуры, пониженной температуры, повышенной влажности и действия светом. Исходя из проделанной работы, можно сделать вывод, что при хранении сырья в исследуемых условиях их количественный состав с каждым месяцем уменьшался по сравнению с контрольным образцом, который хранился в условиях, соответствующих требованиям нормативной документации. Поэтому нужно правильно обеспечивать хранение ЛРС, чтобы оно не теряло своих биологических свойств и могло обеспечивать в полной мере свое фармакотерапевтическое действие.
Литература.
1. Аналитическая химия. Количественный анализ. Физико-химические методы анализа: учебное пособие / Ю. Я. Харитонов, Д. Н. Джабаров, В. Ю. Григорьева. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 368 с.:
2. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия / В.Г. Беликов - М.: Высшая школа, 2007. - С. 77-82.
3. Бионеорганическая и аналитическая химия / А.И. Сичко, Т.А Кобелева., Н.В Ионидис., Г.Д Кадочникова -Тюмень: Изд. центр «Академия», 2003. - 360 с.
4. Волоха Д.С. Справочник провизора-аналитика / Под ред. Д.С. Волоха и Н.П. Максютиной - Киев: Здоровье, 2001
- С. 48-51.
5. Государственная фармакопея РФ. - XIII изд. - М [Электронный ресурс] / Медицина. - 2016. - Режимдоступа: http://pharmacopoeia.ru/gosudarstvennava-farmakopeYa-xiii-online-gf-l3-online/
6. Государственный реестр лекарственных средств. Т.1, 2. — М.: «Информационно-издательское агентство «Ремедиум», 2008. — 176 усл. печ. ед.
7. Драго Р. Физические методы анализа в химии / Р. Драго - М.: Медицина, 2009. - С.24-29.
8. Краснов Е.А., Блинникова А.А. Физико-химические методы в анализе лекарственных средств / Е.А. Краснов, А.А. Блинникова - Томск: СибГМУ 2011. - 163 с.
9. Лекарственные растения Государственной фармакопеи / под ред. И.А. Самылиной, В.А. Северцева. — М.: АНМИ, 2003. — 534 с.
10. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. /М.Д.
11. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г. П. Фармакогнозия: Учебник. — 5-е изд. — М.: Медицина, 2007.
— 656 с.
