CC BY
272
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 193-198.
УДК 543.544:615.322
ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ФЛАВОНОИДОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЯХ В ПРОЦЕССЕ ИХ ХРАНЕНИЯ
© З.А. Темердашев , Н.А. Фролова, Т.Г. Цюпко, Д.А. Чупрынина
Кубанский государственный университет, ул. Ставропольская, 149,
Краснодар, 350040 (Россия), e-mail: [email protected]
Изучена возможность оценки стабильности лекарственных растений в процессе их хранения по содержанию фенольных соединений и флавоноидов. Установлено, что содержание индивидуальных фенольных соединений и флаво-ноидов в Calendula officinalis, Hypericum perforatum, Achillea millefolium в течение года после заготовки сырья остается стабильным. Определена удовлетворительная корреляция между величинами АОА и содержаниями рутина (грасч. =
0,822), суммой индивидуальных фенольных веществ, обнаруженных в зверобое про дыряв ленном (грасч. = 0,837), а также обобщенными показателями АОА и суммой дубильных веществ (грасч. = 0,963).
Ключевые слова: флавоноиды, антиоксидантная активность, ВЭЖХ, хранение, стабильность.
Введение
Фенольные соединения и флавоноиды содержатся во многих лекарственных растениях (табл. 1) и обуславливают их фитотерапевтические свойства. Например, по данным авторов [1-3], они отвечают за вяжущее, противовоспалительное, противоопухолевое, крове останавливающее, антисептическое действия отваров и настоек из Hypericum perforatum L. (Hypericaceae), Calendula officinalis L. (Asteraceae), Achillea millefolium L. (Asteraceae).
Содержание фенольных соединений в лекарственном сырье определяется видом растения, условиями произрастания, но кроме того, качеством заготовительных операций, начиная со сбора и заканчивая процессом хранения [1]. Изменения, происходящие в процессе хранения фитоматериалов, специфичны для конкретного вида растения, поэтому химический состав некоторых лекарственных растений может измениться уже через три-четыре месяца хранения [4], а у других он постоянен в течение десяти лет [5]. Для оценки стабильности и определения сроков хранения фитоматериалов в последнее время часто применяют методы «ускоренного» хранения/старения [6, 7]. Для увеличения скорости химических превращений фенольных соединений эксперименты проводят, варьируя различные факторы: температуру, влажность, освещенность и др. В таких условиях, однако, может происходить деградация и изменение состава веществ, не характерные для обычных условий хранения. Например, при влажности воздуха и температурах выше нормы в образце протекают гидролиз, конденсация, ферментативное окисление биологически активных веществ, под действием света - изомеризация. В конечном счете, такая модель не в полной мере отражает естественный механизм физико-химических превращений фенольных веществ при хранении лекарственных растений, а сроки хранения, установленные с помощью метода ускоренного старения, могут быть недостоверны.
Традиционно стабильность лекарственного растительного сырья оценивают исходя из суммарного содержаниия дубильных веществ методом титриметрии, флавоноидов - спектрофотометрически [8-9]. Однако стабильность химического состава растительных сборов в период хранения определять этими методами затруднительно, данный параметр лимитируется содержанием индивидуальных фенольных компонентов и механизмами их превращения. Известно также, что фенольные соединения и флавоноиды явля-
* Автор, с которым следует вести переписку.
ются природными антиоксидантами. Благодаря антиоксидантным свойствам они нейтрализуют свободные радикалы, замедляют и предотвращают оксиление липидов. При исследовании стабильности фитоматериалов по сумме дубильных веществ следует проводить оценку их терапевтических свойств по величине ан-тиоксидантной активности (АОА) лекарственных растений.
Следует также отметить, что для определения природных фенольных соединений в растительных материалах все большее распространение получает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ в сочетании УФ-детектированием на диодной матрице позволяет не только разделить смесь по компонентам, но и идентифицировать продукты разложения фенольных соединений и флавоноидов.
Цель данной работы - определение стабильности лекарственных растений в процессе их хранения по содержанию индивидуальных фенольных соединений, сумме дубильных веществ и величине антиокси-дантной активности на примере отваров зверобоя продырявленного, календулы аптечной и тысячелистника обыкновенного, а также изучение корреляционных зависимостей между этими параметрами.
Таблица 1. Основные фенольные соединения зверобоя продырявленного, календулы аптечной, тысячелистника обыкновенного
Класс соединений Вещество Содержание, %
Тысячелистник обыкновенный [10-12]
Флавоноиды Космозиин, лютєолин-7-глюкозид, рутин, апигенин Н.О.*
Календула аптечная [13-18]
Флавоноиды Рутин 1,8-3,1
Дигликозид изорамнетина 0,б
Календен А б'-О-и-метилэфир, календен А б'-О-и-бутилэфир, ка-ленден В, календен В б'-О-и-бутилэфир, календен С, календен С б'-О-и-метилэфир, календен С б'-О-и-бутилэфир, календен Е б'-О-и-бутилэфир, календулазид б'-О-и-бутилэфир, календулазид О б'-О-метилэфир, изорамнетин 3-О-неогеспериозид, изорамнетин-3-О-2О-рамнозилрутинозид, изорамнетин-3-О-рутинозид, кверцетин-3-О-глюкозид, кверцетин-3-О-рутинозид н.о.
Дубильные вещества Суммарно 4,2-б,8
Фенолкарбоновые кислоты Хлорогеновая кислота Пирогалловая кислота Протокатеховая кислота о-Гидроксибензойная кислота и-Кумаровая кислота Феруловая кислота Салициловая кислота о-Кумаровая кислота Коричная кислота 0,5-0,7 0,1 0,01 0,05 0,1 0,1 1,8 0,4 0,02
Зверобой продырявленный [19-23]
Фенолкарбоновые кислоты Кофейная кислота Хлорогеновая кислота Розмариновая кислота 0,1 н.о. 0,1
Катехины (+}-катехин, (-)-катехин н.о.
Дубильные вещества Суммарно 2,8-12,4
Флавоноиды Суммарно 2-5
Рутин 0,5-0,7
Кверцитрин 0,4-0,5
Изокверцитрин 1,2
Гиперин 0,б-1,8
Лютеолин 0,03
Гиперфорин, 3,8-бисапигенин, кверцетин, б,8-дикверцетин, гиперо-зид, авикуларин, микулианин н.о.
Антрахиноны Гиперицин 0,1-0,4
Псевдогиперицин, протопсевдогиперицин, гиперикодегидродиан- трон н.о.
*н.о. - не определено
Экспериментальная часть
Исходные растворы рутина, (-)-эпикатехина, да/>анс-кофейной и протокатеховой кислот («Сигма-биосинтез», Россия) готовили растворением точных навесок этих веществ в ацетонитриле.
Для получения экстрактов использовали аптечные образцы лекарственных растений различных производителей: ООО «Алтай-Фарм» (Барнаул Алтайскго края), ЗАО «Иван-Чай» (пос. Горки-Ленинские Московской области), ЗАО «Ст-Медифарм» (Москва), ООО ПКФ «Фитофарм» (Анапа Краснодарского края), ЗАО «Здоровье» (Нахабино Московской области), «Зеленая Аптека» (Горячий Ключ Краснодарского края), ЗАО АПФ «Фито-ЭМ» (пос. Мамонтовка Московской области), ООО «Компания «Хорст»» (Барнаул Алтайского края). Все образцы были произведены в период с июля по сентябрь 2009 г.
Аптечные образцы лекарственных растений хранили в защищенном от света и влаги месте при комнатной температуре в соответствии с ГФ XI и ГОСТ 24027.2-80 [8, 9]. Анализ проводили каждые 3 месяца в течение одного года после производства сборов лекарственных растений. Для исключения неопределенностей, обусловленных различными условиями произрастания, технологией обработки сборов, изучали лекарственное растения одного вида, но различных производителей.
Для проведения испытаний лекарственное растительное сырье предварительно измельчали в мель -нице и просеивали через сито диаметром 2,0 мм, далее готовили водные экстракты по ГОСТ 24027.2-80 [8]. Для этого 2,0 г измельченного сырья заливали 250 мл горячей воды. Раствор нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником при частом помешивании в течение 30 минут. После охлаждения без доступа света экстракт процеживали через вату в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводили раствор до метки дистиллированной водой, затем фильтровали через мембранный фильтр.
Анализ лекарственого растительного сырья проводили по ВЭЖХ методике [24] на хроматографе Shimadzu LC 20 Prominence (Япония) с УФ детектированием на диодной матрице SPD-M20A (Shimadzu, Япония). Разделение осуществляли на колонке Zorbax SB C18 150*2,1 мм, 5 мкм с предколонкой Zorbax SB C8 20*2,1 мм, 5 мкм (Agilent, США). Использовали подвижную фазу состава: ацетонитрил - 0,04 М фосфатный буферный раствор, подкисленный до pH 2,80. Хроматографирование осуществляли в градиентном режиме элюирования: ацетонитрил 3-40%. Скорость потока подвижной фазы составила 0,25 мл/мин, термостатирование колонки при 30 °С. Объем пробы - 1 мкл. Детектирование проводили в диапазоне длин волн от 190 до 390 нм. Идентификацию фенольных соединений осуществляли по их временам удерживания и УФ-спектрам. Концентрацию веществ определяли по методу абсолютной градуировки.
Определение антиоксидантной активности водных экстрактов лекарственных растений проводили по методике [25]. В мерную колбу вместимостью 100 мл, заполненную на 2/3 бидистиллированной водой, последовательно вносили 1,0 мл реагента состава 6 мМ Fe (III) - 10 мМ о-фенантролина, 1,0 мл пробы, разбавленной в соотношении 1 : 50 или 1 : 100, и доводили объем раствора в колбе до метки бидистиллированной водой. Реакционную смесь выдерживали в течение 60 мин и прибавляли 2 мл 0,5 М раствора NaF. Через 60 мин после введения «стоп-реагента» измеряли оптическую плотность раствора при Х=490 нм в кювете с /=2,0 см. Подставляя значение аналитического сигнала пробы в усредненное уравнение регрессии для вещества-стандарта - аскорбиновой кислоты, полученное в диапазоне 0,05-2,00 мкг/мл, рассчитывали величину АОА продукта и выражали ее в мг аскорбиновой кислоты на 1 г продукта.
Содержание дубильных веществ в лекарственных растениях определяли титрованием водных экстрактов перманганатом калия в присутствии индигосульфокислоты по ГОСТ 24027.2-80 [8].
Результаты и их обсуждение
Проведенные ранее нами ВЭЖХ исследования водных экстрактов растений показали, что в зверобое продырявленном содержатся рутин, (-)-эпикатехин и протокатеховая кислота, в календуле аптечной -транс-кофейная кислота и рутин, в тысячелистнике обыкновенном - протокатеховая и транс-кофейная кислоты [24]. С учетом результатов этих исследований оценку стабильности фитоматериалов в дальнейшем проводили по содержанию этих фенольных соединений. Концентрацию соединений в экстрактах определяли методом абсолютной градуировки. Характеристики градуировочных графиков для протокатеховой, даранс-феруловой кислот, рутина и (-)-эпикатехина представлены в таблице 2.
Таблица 2. Характеристики градуировочных графиков фенольных соединений
Вещество Аналитическая длина волны, нм Интервал определяемых концентраций, мг/л Уравнение регрессии Я
Протокатеховая кислота 2б0 2,5-100 У= (12,3±0,2) х103х X 0,99
Тракс-кофейная кислота 322 1-100 У = (-7,5±5,9) х103х + (23,4±0,1) х103х X 1,00
(-)-эпикатехин 280 2,5-100 У = (2,80±0,03) х103х X 1,00
Рутин 255 1-50 У = (б,32±0,0б) х103х X 0,99
Установлено, что содержание индивидуальных фенольных соединений и флавоноидов растений различных производителей в пределах вида неодинаково (рис. 1). Так, в экстрактах зверобоя продырявленного наименьшие значения АОА, суммы дубильных веществ и концентраций фенольных соединений и флавоноидов наблюдались в образцах производства ЗАО «Иван-Чай» (пос. Горки Ленинские), а наибольшие - ЗАО «Ст-медифарм» (Москва) (рис. 2). Значительные вариации показателей могут быть, по-видимому, обусловлены влиянием условий произрастания и технологии производства сырья.
При исследовании динамики изменения концентрации индивидуальных фенольных соединений, ан-тиоксидантной активности и суммы дубильных веществ водных экстрактов зверобоя про дыряв ленного, тысячелистника обыкновенного, календулы аптечной значительных вариаций результатов в течение года обнаружено не было. Постоянство этих показателей объясняется отсутствием деградации соединений при соблюдении стандартных условий хранения лекарственного растительного сырья. Результаты определения суммы дубильных веществ, АОА и концентрации фенольных соединений в фитоматериалах на примере одного из квартальных исследований представлены в таблице 3 (данные приведены в пересчете на абсолютно-сухое сырьё). Как видно, увеличение антиоксидантной активности и суммы дубильных веществ наблюдается в ряду календула < тысячелистник < зверобой.
Рис. 1. Хроматограммы водных экстрактов зверобоя продырявленного различных производителей. а) ЗАО «Иван-Чай»
(пос. Горки-Ленинские); б) ЗАО «Ст-Медифарм» (Москва); в) ЗАО АПФ «Фито-ЭМ» (пос. Мамонтовка); г) ООО ПКФ «Фитофарм», (Анапа); д) «Зеленая аптека» (Горячий Ключ).
1 - протокатеховая кислота;
2 - (-)-эпикатехин; 3 - рутин.
Условия определения приведены в тексте статьи. Длина волны детектирования 255 нм
Рис. 2. Лепестковая диаграмма показателей качества зверобоя продырявленного
Таблица 3. Концентрация индивидуальных фенольных соединений, величины АОА и суммы дубильных веществ в лекарственных растениях (п=4, Р=0,95)
Производитель Протокатеховая кислота, мкМ/г транскофейная кислота, мкМ/г Рутин, мкМ/г (-)-эпикате-хин, мкМ/г АОА, мМ(АК)/г Дубильные вещества, %
Тысячелистник обыкновенный
ООО «Алтай-Фарм», Барнаул 1,85±0,10 0,43±0,02 - - 0,08±0,01 1,82±0,10
ЗАО «Иван-Чай», Горки-Ленинские 0,38±0,04 1,00±0,04 - - 0,09±0,01 2,23±0,24
ЗАО «Ст-Медифарм», Москва 0,42±0,0б 0,55±0,12 - - 0,15±0,02 4,00±0,09
ООО ПКФ «Фигофарм», Анапа 0,59±0,07 0,72±0,07 - - 0,17±0,03 4,28±0,23
Календула аптечная
ЗАО «Здоровье», Наха-бино - 0,88±0,11 5,10±0,52 - 0,09±0,01 1,73±0,08
«Зеленая Аптека», Горячий Ключ - 0,59±0,04 б,13±1,45 - 0,08±0,01 1,б9±0,11
ЗАО «Иван-Чай», Горки-Ленинские - 0,74±0,04 5,б1±1,74 - 0,08±0,01 1,97±0,13
ООО ПКФ «Фигофарм», Анапа - 0,80±0,01 б,2б±0,4 - 0,09±0,01 1,8б±0,11
ЗАО АПФ «Фито-ЭМ», Мамонтовка - 0,б7±0,13 б,85±0,85 - 0,08±0,01 1,8б±0,10
ООО «Компания “Хорст”», Барнаул - 0,б2±0,04 7,94±1,91 - 0,08±0,00 2,10±0,17
Зверобой продырявленный
«Зеленая Аптека», Горячий Ключ 1,40±0,03 - 23,48±4,52 б,б5±0,11 0,25±0,03 б,41±0,б0
ЗАО «Иван-Чай», Горки-Ленинские 2,27±0,б5 - 5,59±0,48 3,77±0,18 0,17±0,01 3,4б±0,37
ЗАО «Ст-Медифарм», Москва 1,35±0,1б - 23,30±0,21 б,б7±1,52 0,31±0,02 б,2б±0,29
ООО ПКФ «Фигофарм», Анапа 2,53±0,48 - 19,90±2,87 4,28±0,8б 0,21±0,01 4,91±0,83
ЗАО АПФ «Фито-ЭМ», Мамонтовка 2,41±0,08 - 12,2б±1,30 4,88±0,90 0,19±0,01 3,97±0,58
С целью установления зависимостей между содержанием индивидуальных веществ и обобщенными показателями качества фитоматериалов - антиоксидантной активностью и суммой дубильных веществ был проведен регрессионный анализ. В образцах зверобоя продырявленного определены значительные содержания индивидуальных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, поэтому данные исследования проводили с использованием этих образцов. Антиоксидантная активность индивидуальных соединений, обнаруженных в образцах зверобоя продырявленного, убывает в ряду рутин > эпикатехин > протокатеховая кислота [25]. Среди антиоксидантов преобладает рутин, его содержание составляет около 50% от суммы анализируемых веществ. Проведенный регрессионный анализ позволил установить удовлетворительную корреляцию между величинами АОА и содержаниями рутина (грасч. = 0,822), суммой индивидуальных веществ, обнаруженных в звербое продырявленном (грасч. = 0,837), а также обобщенными показателями АОА и суммой дубильных веществ (грасч. = 0,963).
Выводы
Увеличение антиоксидантной активности и суммы дубильных веществ в исследуемых растительных материалах наблюдается в ряду календула < тысячелистник < зверобой. Установлено, что содержание индивидуальных фенольных соединений и флавоноидов, сумма дубильных веществ и антиоксидантная активность сухого измельченного сырья, хранящегося при постоянных температуре и уровне влажности без доступа света, остаются стабильными в течение одного года после заготовки сырья.
Список литературы
1. Муравьева Д.А. Фармакогнозия. М., 1991. 560 с.
2. Евдокимова О.В. Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника // Вестник ВЕУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. 2007. №2. С. 155-160.
3. Javanmardia J., Stushnoff C., Locke E., Vivanco J.M. Antioxidant activity and total phenolic content of Iranian Ocimum accessions // Food Chemistry. 2003. V. 83. Pp. 547-550.
4. Fennell C.W., Light M.E., Sparg S.G., Stafford G.I., van Staden J. Assessing African medicinal plants for efficacy and safety: agricultural and storage practices // Journal of Ethnopharmacology. 2004. V. 95. Pp. 113-121.
5. Тимофеев Н.П., Лапин A.A., Зеленков B.H. Оценка качества лекарственного сырья левзеи сафлоровидной методом бромной антиокислительной емкости // Бутлеровские сообщения. 2006. Т. 8, №2. С. 36-41.
6. Школьникова М.Н., Аверьянова Е.В., Щеглова И.В. Изучение возможности применения метода ускоренного старения для прогнозирования сроков хранения безалкогольных бальзамов // Ползуновский вестник. 2007. №3. С. 184-187.
7. Stafford G.I., Jager A.K., van Staden J. Effect of storage on the chemical composition and biological activity of several popular South African medicinal plants // Journal of Ethnopharmacology. 2005. V. 97, N1. Pp. 107-115.
8. EOCT 24027.2-80 Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных и дубильных веществ, эфирного масла. 06.03.1980.
9. Еосударственная Фармакопея СССР. XI изд. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. М., 1987.
10. ЕалкинМ.А., Казаков А.Л. Дикорастущие полезные растения Северного Кавказа. Ростов-на-Дону, 1980. 128 с.
11. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Asteraceae (Compositae) / под ред. П.Д Соколова. Л., 1993. 352 с.
12. Khare C.P. Indian Medicinal Plants. An illustrated dictionary. New-Delhi; Springer, 2007. 863 p.
13. Петков В. Современная фитотерапия. София, 1988. 504 с.
14. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. Методы биохимического исследования растений, 3-е изд., пере-раб. и доп. Л, 1987. 430 с.
15. Нечаев А.П., Траунберг C.E., Кочеткова А.А. Пищевая химия. СПб., 2004. 640 с.
16. Marusk A., Proscevicius J., Bimbiraite-Surviliene K., Kornysova O., Ragazinskiene O., Ratautaite V. Comparison of phytochemical composition of medicinal plants by means of chromatographic and related techniques // Procedia Chemistry. 2010. N2. Pp. 83-91.
17. Ukiya M., Akihisa T., Yasukawa K., Tokuda H., Suzuki T., Kimura Y. Anti-inflammatory, anti-tumor-promoting, and cytotoxic activities of constituents of marigold (Ca/endu/a officinalis) flowers // J. Nat. Prod. 2006. V. 69. Pp. 1692-1696.
18. Pietta P., Bruno A., Mauri P., Rava A. Separation of flavonol-2-0-glycosides from Ca/endu/a oficina/is and Sambu-cus nigra by high-performance liquid and micellar electrokinetic capillary chromatography // Journal of Chromatography. 1992. V. 593. Pp. 165-170.
19. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paconiaceae - Thymelaeaceae / под ред. А.П. Соколова. Л., 1985. 336 с.
20. Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Исследования по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов зверобоя продырявленного // Химия растительного сырья. 2008. №1. С. 81-86.
21. Zheng W., Wang S.Y. Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs // J. Agric. Food Chem., 2001. V. 49. Pp. 5165-5170.
22. Shadkami F., Helleur R. Use of an injection port for thermochemolysis-gas chromatography/mass spectrometry: Rapid profiling of biomaterials // Journal of Chromatography A. 2009. V. 1216. Pp. 5903-5910.
23. Wei Y., Xiea Q., Dong W., Ito Y. Separation of epigallocatechin and flavonoids from Hypericum perforatum L. by high-speed counter-current chromatography and preparative high-performance liquid chromatography // Journal of Chromatography A, 8 May 2009. V. 1216, N19. Pp. 4313-4318.
24. Темердашев 3.A., Фролова H.A., Колычев И.А. Определение фенольных соединений в лекарственных растениях методом обращено-фазовой ВЭЖХ // Журнал аналитической химии. 2011. Т. 66, №4. С. 417-424.
25. Темердашев З.А., Храпко Н.В., Цюпко Т.Е., Воронова О.Б., Балаба А.Н. Определение антиоксидантной активности пищевых продуктов с использованием индикаторной системы Fe(III)/Fe(II) — органический реагент // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2006. Т. 72, №11. С. 15-19.
Поступило в редакцию 21 февраля 2011 г.
После переработки 28 сентября 2011 г.
