CC BY
99
УДК 123.456
ИССЛЕДОВАНИЕ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ: ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕЗВЕРАТРОЛА С ^ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ В НЕКОТОРЫХ РАСТВОРИТЕЛЯХ
Г.В. Васильев И.П. Анисимович
A.Ю. Михеев
B.И. Дейнека О.О. Новиков
Белгородский государственный университет,
Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85,
E-mail: [email protected]
В работе исследовано взаимодействие транс- и цис-резвератрола с Р-циклодекстрином хроматографическим методом и по методу растворимости. Показано, что оба метода дают согласующиеся результаты. Впервые установлено, что возможна аппроксимация констант комплексообразования на составы растворителей за пределы составов использованных в ВЭЖХ подвижных фаз.
Ключевые слова: цис- и транс-резвератрол, ^-циклодекстрин, комплексы включения, ВЭЖХ, растворимость.
Резвератрол (5-[2-(4-гидроксифенил)этенил])бензол-1,з-диол или транс -3,5,4'-тригидроксостильбен) был впервые выделен из корней одного из видов чемерицы ^ега^ит дт^гАогит) в 1940 году [1]. В настоящее время резвератрол обычно ассоциируется с виноградом, в котором он присутствует главным образом в виде 3-0-[З^-глюкозида (пицеида, piceid) (схема 1) [2], хотя известно более 70 других растительных источников этого соединения [1, 3]. Резвератрол относят к фитоалексинам -вторичным метаболитам, синтезируемым растениями в ответ на биотический и абиотический стресс [4]. Экстракты, содержащие агликон или его глюкозид, издавна использовались в традиционной китайской и японской медицине для лечения различных заболеваний. К настоящему времени высокая биологическая активность резве-ратрола (в том числе и антиканцерогенная) подтверждена экспериментально в многочисленных исследованиях [5, 6], что объясняет высокий интерес исследователей к этому соединению.
RO
R= H
HO....
OH R=
HO
OH
резвератрол
пицеид
OH
Схема 1. Строение транс-резвератрола и пицеида
Однако резвератрол обладает невысокой растворимостью в воде [6], осложненную к тому же быстрым метаболизмом - полупериод жизни резвератрола в организме составляет примерно 8 - 14 мин, что снижает его биодоступность, [6]. Примечательно, что именно технологии супрамолекулярной химии предназначены для решения подобного рода проблем: образование комплексов «гость - хозяин» позволяет изменять и растворимость, и устойчивость молекул «гостей». Целый ряд исследований [7-13] показал, что в качестве «хозяина» для образования комплексов с резвератролом удобно использование циклодекстринов, обладающих подходящим размером полости, не токсичных и разрешенных к использованию в медицинской и пищевой промышленности [14]. Однако между значениями констант комплексообразования, полученных различными авторами с использованием различных методов, существуют большие расхождения. Данная работа посвящена исследованию комплексообразования резве-ратрола с ^-циклодестрином параллельно двумя методами - хроматографическим и по растворимости, а также и решению ряда сопутствующих проблем.
Экспериментальная часть
Хроматографическая система была составлена из насоса высокого давления Bekman 110B, крана дозатора Rheodyne 7125 с петлей объемом 20 мкл; спектрофотометрического детектора с изменяемой длиной волны Nicolet LC/9563 (А = 306 нм). Для регистрации и обработки хроматограмм использовали ПП МультиХром 1.5. Хроматографическая колонка 100x4 мм Диасфер-110-С18. Все хроматографические исследования выполняли при комнатной температуре.
Для приготовления подвижных фаз использовали дистиллированную воду, ацетонитрил (HPLC-gradient grade, Panreac), уксусную кислоту (х.ч., Вектон). В работе использовали резвератрол и в-циклодекстрин (КНР). Чистоту резвератрола проверяли хроматографическим (индивидуальный пик на хроматограмме) и спектроскопическим методом (по сопоставлению коэффициента молярного погашения с литературными данными). Цис-изомер резвератрола получали действием прямого солнечного света на раствор транс-резвератрола в кварцевой посуде - нескольких минут достаточно для получения раствора с сопоставимыми концентрациями двух изомеров. Чистота использованного в работе в-циклодектрина была проверена записью хроматограммы раствора в условиях обращено-фазовой ВЭЖХ с рефрактометрическим детектированием в водно-метанольной (8 об.%) подвижной фазе - на хроматограмме был обнаружен только один пик с удерживанием близким к литературным данным [15].
По методу растворимости в виалы вместимостью 15 мл добавляли по 10 мл соответствующего растворителя с различной концентрацией в-циклодекстрина и избыток резвератрола. Смесь при периодическом встряхивании выдерживали в течение суток вне доступа прямого солнечного света при комнатной температуре. Избыток рез-вератрола отделяли центрифугированием, а концентрацию резвератрола в растворе определяли методом ВЭЖХ.
Компьютерное моделирование комплексов включения осуществляли в программном пакете HyperChem 8.0 с оптимизацией геометрии методом MM+.
Обсуждение полученных результатов
С использованием метода молекулярного моделирования авторы работы [13] пришли к выводу о том, что внедрение молекулы резвератрола в полость ^-циклодекстрина осуществляется кольцом А, содержащим две гидроксильные груп-
Б о <-> <-> /-ч
с одной гидроксильной группой ориентировано наружу. С этим выводом (или интерпретацией) сложно согласиться, если учесть полученные нами результаты по исследованию комплексообразования между ^-циклодекстрином и фенольными кислотами (производными рядов бензойной и коричной кислот [16]) (табл. 1).
По нашим данным в случае обоих типов фенольных кислот комплексообразо-вание несколько увеличивается при введении гидроксильной группы в параположение. Эта стабилизация комплекса может быть объяснена образованием объемной сольватной оболочки вокруг гидроксильной группы, выходящей за нижний обод ^-циклодекстрина. Добавление дополнительной гидроксильной или метоксильной группы в мета-положение кислот всегда существенно снижало константы комплексо-образования, причем в случае более объемной метоксильной группы, повышающей гидрофобность молекулы, снижение константы было больше, чем при добавлении гидроксильной группы, увеличивающей гидрофильность молекулы. Следовательно, в рассматриваемом случае устойчивость комплексов «гость-хозяин» определяется не гидрофильно-гидрофобными свойствами заместителей в мета-положении, а стериче-скими факторами. Добавление третьей группы (с заполнением обоих метаположений) приводило к дальнейшему уменьшению констант.
Следовательно, в случае пары «в-циклодекстрин - резвератрол» на роль гостя
тч <-> __ «-»
скорее претендует именно кольцо Б, с гидроксильной группой в пара-положении, а не кольцо А, с двумя мета-заместителями, схема 2.
Кстати, именно поэтому для резвератрола и в-циклодекстрина найдены комплексы только состава 1:1, а не 1:2 - по одной молекуле в-циклодекстрина на каждое из ароматических колец.
Таблица 1
Константы комплексообразования феноль-
Заместители Подвижные фазы
1 2
Производные бензойной кислоты
нет 190 -
4-гидрокси 232 -
3,4-дигидрокси 82 -
3 -метокси-4 -гидрокси- 61 -
3,5-диметокси-4-гидрокси- 19 -
Производные транс-коричной кислоты
нет - 53
4-гидрокси- 270 56
3,4-дигидрокси 152 26
3 -метокси-4 -гидрокси- - 14
Метод обращенно-
фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ), использованный в данной работе для определения констант комплексообразова-ния, основан на простой зависимости между концентрацией б-циклодекстрина в подвижной фазе и фактором удерживания сорбата (для комплексов состава 1:1) [9]:
1
1
Колонка: 150x4 мм, Диасфер-110-С18№Г, 5 мкм. Подвижные фазы: 1-10 об.% ацетонитрила 2-20 об.% ацетонитрила и 0,5 об.% уксусной кислоты в обеих фазах
- + -^- • ^ ] , (1)
k(о ш ка) 1 1
где к(г) - фактор удерживания сорбата г; к0(г) - фактор удерживания сорбата г в элюенте без в-циклодекстрина, [CD] - концентрация в-циклодекстрина в подвижной фазе. По нашим данным во всех случаях соблюдалась линейность такого соотношения (рис.1), что подтверждало образование только комплексов состава 1 : 1 для обоих изомеров (цис и транс) резвератрола.
Метод ВЭЖХ имеет то преимущество, что возможно одновременное определение констант комплексообразования для нескольких молекул «гостей». Это позволило нам определять константы устойчивости и транс- и цис-резвератрола в одних и тех же условиях. При этом константа устойчивости цис-изомера оказалась лишь на 20-30 % меньше, чем для
транс-изомера, табл.2, что также не согласуется со строением комплекса, определенным по методу компьютерного
моделирования [13], поскольку в предложенной авторами схеме при замене транс-
резвератрола на цис-изомер геометрия комплекса должна измениться принципиально. При предлагаемом нами варианте образования комплекса внедрением в полость б-циклодекстрина кольца Б молекулы резвератрола кольцо А не должно существенно влиять на устойчивость комплекса, а в цис-изомере может реализоваться наиболее выгодная конформация кольца А относительно верхнего обода б-циклодекстрина. Кстати, снижение константы при переходе от транс- к цис-изомеру сопоставимо с уменьшением константы при удалении двойной связи при переходе от производных коричной к производным бензойной кислот (табл. 2).
Существуют несколько источников погрешности в определении констант различными методами. В хроматографическом методе специфическая погрешность связана с определением фактора удерживания сорбатов, к(г), для расчета которого требуется определение так называемого «мертвого» времени колонки, ^. Можно показать прямыми расчетами, что относительная погрешность определения констант может достичь 10 % при малых временах удерживания, но не превышает 1 % при 5 % при по-
Схема 2. Моделирование строения комплекса включения транс-резвератрола с б-циклодекстрином
ложительных логарифмах факторов удерживания. Следовательно, более надежные константы комплексообразования можно получить при использовании коротких колонок и «медленных» элюентов.
1/ед
0,04 Н---------1----------1----------1----------1
0 0,0025 0,005 \СО], моль/л
Рис. 1. Зависимость между фактором удерживания транс-резвератрола и концентрацией Р-циклодекстрина в подвижной фазе Колонка: 100x4 мм, Диасфер-110-С18, 5 мкм. Основа подвижной фазы: 15 об. % ацетонитрила и 2 об. % уксусной кислоты в воде
Другой источник погрешности количественно оценить труднее. Уравнение (1), применяемое для расчета константы комплексообразования, строго говоря, может быть использовано только в том случае, если удерживание сорбата изменяется исключительно за счет процессов ком-плексообразования в подвижной фазе при неизменности состояния стационарной фазы. Но наши исследования показали, что при увеличении концентрации ^-циклодектрина в подвижной фазе в случае кофеина удерживание даже немного увеличивается. Этот факт может быть следствием модификации поверхности октадецилсилановых фаз ^-циклодекстрином. Действительно, если это соединение обладает гидрофобной полостью, то эта полость может заполняться не только сорбатом в подвижной фазе, но и углеводородными радикалами октадецилсиланизированной поверхности. По нашим данным удерживание ^-циклодекстрина в использованных стационарных фазах оказалось весьма заметным (к « 0.2). Следовательно, с изменением концентрации ^-циклодекстрина изменяется не только соотношение компонентов в подвижной фазе, но и состояние поверхности: за счет сорбции ^-циклодекстрина увеличивается число доступных поверхностных гидроксильных групп. Тогда должно увеличиваться удерживание полярных соединений.
Для оценки правильности хроматографического метода, тем не менее, желательно сопоставить константы, получаемые для одного и того же набора растворов, но рассчитанные с использованием принципиально различных методов. В цитированных ранее работах использовались различные методы для расчета констант комплексооб-разования резвератрола. Так по флуориметрическим измерениям для температур 20, 30 и 40°С были получены константы комплексообразования резвератрола с
Таблица 2
Сопоставление констант комплексообразования изомеров резвератрола с ^-циклодекстрином
Подвижная фаза, объемные доли, % Константы устойчивости комплексов изомеров резвератрола с Р-циклодекстрином
СHзCN СН3СООН транс- цис-
12.5 2 199 165
15.0 2 91 73
17-5 2 57 40
^-циклодекстрином на уровне двух тысяч (2122, 2038 и 1884, соответственно, [13]); по растворимости (метод фазовых диаграмм, [8]) при 37оС было найдено несколько большее значение константы - 2057. На том же уровне в диапазоне рН 4 ^ 8 оказались константы, найденные методом ВЭЖХ [9], хотя авторы цитируемой работы использовали вместо стандартной обращенной фазы фазу GF-450, предназначенную для эксклюзивной хроматографии. В работе [10] по флуориметрическому методу также была получена константа немногим более двух тысяч, но ферментный метод (окисление резвератрола) и метод фазовых диаграмм приводили к получению примерно вдвое больших констант (4220 и 4438).
Приведенные выше значения констант бессмысленно напрямую сопоставлять с найденными в настоящей работе, табл.2, поскольку в использованной нами обращено-фазовой хроматографии для получения приемлемых времен удерживания и симметричной формы пиков в элюент необходимо добавлять органические модификаторы (в нашем случае - ацетонитрил и уксусную кислоту). Но эти вещества также обладают некоторой неполярностью и могут конкурировать с резвератролом за место в полости, что подтверждается уменьшением констант при росте концентрации ацетонитрила в подвижной фазе, табл. 2. По этой причине мы выполнили параллельное определение константы методом ВЭЖХ и методом растворимости для одних и тех же растворов ^-циклодекстрина в растворителе (в подвижной фазе), содержащей 12.5 об.% ацетонитрила и 2 об.% уксусной кислоты. Расчет показал неплохое совпадение: по растворимости среднее значение константы составило 190 при значении 199, полученном по методу ВЭЖХ.
Полученные данные свидетельствуют о достаточной надежности хроматографического метода определения констант комплексообразования. В таком случае представляет интерес возможность аппроксимации констант интерполяцией данных за пределы использованного диапазона составов подвижных фаз. В жидкостной хроматографии для аппроксимации параметров удерживания используют полулогарифмические координаты «логарифм фактора удерживания, lgk(i), vs объемная доля органического модификатора, Ф», для которых предполагается либо линейная, либо квадратичная функциональная зависимость [17]. Для констант комплексообразования можно предполагать в первом приближении линейную взаимосвязь:
lg Kp (i) = а + b • Ф, (2)
где Ф - объемная доля органического модификатора в подвижной фазе.
Полученные в настоящей работе значения констант комплексообразования в подвижных фазах, в которых постоянным оставалась концентрация уксусной кислоты (2 об. %), но изменялась концентрация ацетонитрила (12,5 ^ 30 об. %), удовлетворительно аппроксимируются прямолинейной зависимостью (2), рис.1:
lgXp(i) = 3.639 - 0.108-Ф. (R2 = 0.9954).
При аппроксимации на нулевое содержание ацетонитрила получается константа 4350, что соответствует большим значениям из литературных данных. Для контроля мы рассчитали константу по методу растворимости в водном растворе без каких-либо органических добавок, получив в итоге даже немного более высокое значение -4717 (точка указана на рис.2 в логарифмических единицах).
Найденное различие (менее 10 %) между константами может быть объяснено, во-первых, обсуждавшимися выше погрешностями расчета констант, во-вторых, экспериментальными погрешностями, в-третьих, возможной необходимостью введения квадратичной зависимости, которая в обычной практике хроматографии чаще используется именно для водно-ацетонитрильных растворов (подвижных фаз) [17] и, в-четвертых, возможным влиянием на константу уксусной кислоты, входившей в состав всех элюентов. При этом однозначно то, что константа комплексообразования резвератрола с в-циклодекстрином выше четырех тысяч.
№р
3
2
1
0
0 10 Ф,
Рис.2. Зависимость констант комплексообразования резвератрола с ^-циклодекстрином от концентрации ацетонитрила в подвижной фазе
Очевидно, что комплексообразование за счет внедрения в полость молекулы «хозяина» может изменить растворимость «гостей». При этом логично предположить и уменьшение химической активности молекулы «гостя» в реакциях, затрагивающих все части, кроме ориентированных на центры верхнего и нижнего обода циклодекстрина, т.к. доступ к ним затруднен или исключен стенками молекулы «хозяина». В случае резвератрола при его ориентации в полости в соответствии со схемой 2, увеличения химической активности ожидать не следует. И действительно, в работах [10, 12, 18] найдено снижение скорости ферментного окисления резвератрола, увеличение его фотостабильности и неизменность ряда биологически важных свойств при образовании комплексов. Однако в работе [11] приводятся данные, свидетельствующие об усилении способности резвератрола к перехвату радикалов при добавлении ^-циклодекстрина по методике с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила фРРН) [19]. Мы проверили влияние ^-циклодекстрина на антиоксидантные свойства резвератрола по методу [20] в котором в качестве окислителя используется Fe3+ с последующим определением образовавшегося Fe2+ по образованию окрашенного комплекса с 2,2’-дипиридилом (рис. 3).
Рис.3. Восстановительная активность резвератрола и кверцетина до и после образования комплексов включения с Р-циклодекстрином
Оси абсцисс - число моль исследуемого соединения ( □ и ■ -резвератрол, О и ф - кверцетин; по оси ординат - число моль образовавшихся ионов Fe2+, экспериментальные данные для образцов - незаполненные значки и пунктирная линия
По полученным данным (по тангенсу угла наклона прямой линии, аппроксимирующей экспериментальные данные, рис. 3) восстановительная (антиоксидантная) активность резвератрола, во-первых, примерно в 8 раз ниже, чем кверцетина, т.е. рас-
сматривать это соединение в качестве антиоксиданта можно лишь условно, поскольку и реальная концентрация его в природных источниках также мала. Во вторых, образование комплексов с ^-циклодекстрином не только не повышает эту активность, но и, наоборот, немного снижает ее.
Выводы
Транс- и ^ис-резвератрол образует комплекс включения с ^-циклодекстрином состава 1:1 предположительно внедрением моногидроксилированнного ароматического кольца. В работе определены константы комплексообразования в нескольких различных составах подвижных фаз. Показано, что константа комплексообразования в водном растворе может быть определена методом ВЭЖХ с аппроксимацией результатов на чисто водные растворы по линейной зависимости логарифма константы относительно объемной доли органического модификатора.
Список литературы
1. Orallo F. Biological effects of cis- versus frans-resveratrol / In «Resveratrol in health and disease ». Ed. B.B. Aggarwal, S. Shishodia. CRC Press, Taylor & Francis gpoup, LLC, 2006. - 641 c.
2. Romero-Perez A.I., Maite Ibern-Gomez M., Lamuela-Raventos R.M., M. de la Torre-Boronat C. Piceid, the Major Resveratrol Derivative in Grape Juices // J. Agric. Food Chem. - 1999. -Vol. 47. - P. 1533-1536.
3. Delaunois B., Cordelier S., Conreux A., Clement C., Jeandet P. Molecular engineering of resveratrol in plants // Plant Biotechnol. J. - 2009. - Vol. 7. - P. 2-12.
4. Dixon R.A. Natural products and plant disease resistance // Nature. - 2001. - Vol. 411. -P. 843-847.
5. de la Lastra C.A., Villegas I. Resveratrol as an anti-inflammatory and anti-aging agent: Mechanisms and clinical implications // Mol. Nutr. Food Res. - 2005. - Vol. 49. - P. 405-430.
6. Das S., Liu H.-S., Ho P.C., Ng K.-Y. The impact of aqueous solubility and dose on the pharmacokinetic profiles of resveratrol // Pharm. Res. - 2008. - Vol. 25. - P. 2594-2600.
7. Lopez-Nicolas J.M., Nunez-Delicado E., Perez-Lepez A.J., Barrachina A.C., Cuadra-Crespo P. Determination of stoichiometric coefficients and apparent formation constants for P-cyclodextrin complexes of trans-resveratrol using reversed-phase liquid chromatography // J. Chromatogr. A. -2006. - Vol. 1135. - P. 158-165.
8. Bertacche V., Lorenzi N., Nava D., Pini E., Sinico C. Host-Guest interaction study of resveratrol with natural and modified cyclodextrins // J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. - 2006. - Vol. 55. - P. 279-287.
9. Lopez-Nicolas J.M., Garda-Carmona F. Rapid, simple and sensitive determination of the apparent formation constants of trans-resveratrol complexes with natural cyclodextrins in aqueous medium using HPLC // Food Chem. - 2008. - Vol. 109. - P. 868-875.
10. Lucas-Abellan C., Fortea M.I., Gabald^ J.A., Nunez-Delicado E. Complexation of resveratrol by native and modified cyclodextrins: Determination of complexation constant by enzymatic, solubility and fluorimetric assays // Food Chem. - 2008. - Vol. 111. - P. 262-267.
11. Lu Z., Cheng B., Hu Y., Zhang Y., Zou G. Complexation of resveratrol with cyclodextrins: Solubility and antioxidant activity // Food Chem. - 2009. - V. 113. - P. 17-20.
12. Sapino S., Carlotti M.E., Caron G., Ugazio E., Cavalli R. In silico desighn, photostability and biological properties of complex resveratrol/hydroxypropyl-P-cyclodextrin // J. Incl. Phenom. Mycrocycl. Chem. - 2009. - Vol. 63. - P. 171-181.
13. Lu Z., Chen R., Liu H., Cheng B., Zou G. Study of the complexation of resveratrol with cyclodextrins by spectroscopy and molecular modeling // J. Incl. Phenom. Mycrocycl. Chem. - 2009. - V.63. - P. 295-300.
14. Stella V.J., He Q. Cyclodextrins // Toxicol. Pathol. - 2008. - V. 36. - P. 30-42.
15. Chatjigakis A.K., Cardot Ph.J.P., Coleman A.W., Parrot-Lopez H. Retention Properties of Cyclodextrins and Modified Cyclodextrins in Reversed Phase HPLC // Chromatographia. - 1993. -V. 36. - P. 174-178.
16. Анисимович И.П., Лапшова М.С., Дейнека Л.А., Дейнека В.И. Исследование образования комплексов включения Р-циклодекстрина с фенольными кислотами методом ВЭЖХ / Высокие технологии, фундаментальные исследования, образование: сборник трудов Седьмой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». 28-30.04.2009, Санкт-Петербург, Россия / под ред. А.П. Кудинов. Г.Г. Матвиенко. - СПб.: Изд-во Политехн. Ун-та, 2009. - С. 159-161.
17. Baczek T., Kaliszan R., Claessens H.A., van Straten M.A. Computer-Assisted Optimization of Reversed-Phase HPLC Isocratic Separations of Neutral Compounds // LC^GC Europe. - 2001. -June. - P. 2-6.
18. Lucas-Abellan C., Fortea I., Lopez-Nicolas J.M., Nunez-Delicado E. Cyclodextrins as resveratrol carrier system // Food Chem. - 2007. - V.104. - P. 39-44.
19. Sanchez-Moreno C., Larrauri J.A., Saura-Calixto F. A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols // J. Sci. Food Agric. - 1998. - V.76. - P. 270-276.
20. Темердашев З.А., Храпко Н.В., Цюпко Т.Г., Воронова О.Б., Балаба А.Н. Определение антиоксидантной активности пищевых продуктов с использованием индикаторной системы Fe (III) / Fe (II) - органический реагент // Заводск. Лаборат. - 2006. - Т.72, №11. - С. 15-19.
INVESTIGATION OF SUPRAMOLECULAR COMPLEXES: INTERACTION OF RESVARATROL WITH jmCLODEXTRIN IN SOME SOLVENTS
In the paper interaction of cis- and trans-resveratrol with j3-cyclodextrin has been investigated by two methods (chromatographic and solubility) simultaneously. The coincidence of the results was found, a possibility of approximation of the constants beyond mobile phase compositions under investigation has been proved.
Belgorod Hate Umversity, Key words: cis- and trans-resveratrol, ^-cyclodextrin, inclusion com-
Pobedy Str., 85,Belgorod, plexes, HPLC, solubility methods.
308015, Russia
E-mail: [email protected]
G.V. Vasiliev I.P. Anisimovitch A.Yu. Mikcheev V.I. Deineka О.О. Novikov
