CC BY
119
УДК 615.074:577.16:547.917
ОСОБЕННОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСОВ ВКЛЮЧЕНИЯ ЛИКОПИНА И В-КАРОТИНА С В-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ
Е.В. ЗАХАРЕНКО, М.С. ЛАПШОВА В.И. ДЕЙНЕКД, ЛЛ. ДЕЙНЕКД А.Г. ДОРОНИН
Белгородский государственный национальный исследователский университет
e-mail: deyneka@bsu.edu.ru
В работе предложен метод частичного отделения ликопина от Р-каротина при образовании комплексов включения смеси каротиноидов с Р-циклодекстрином. Этот метод может быть использован при создании готовых форм ликопина - мощнейшего жирорастворимого антиоксиданта. Для получения комплексов предложено добавлять растертый порошок Р-циклодекстрина к ацетоновому раствору каротиноидов, растворимость которых снижена добавлением воды. Показано, что на первой стадии развития системы каротиноиды соосаждаются с Р-циклодекстрином, но выдержка смеси позволяет получить комплексы включения с дифференциацией каротиноидов по афинности к молекулам «хозяина».
Ключевые слова: ликопин, Р-каротин, Р-циклодекстриин, комплексы включения.
Ликопин (I), синтезируемый в растениях и в некоторых микроорганизмах (но не в организме животных), - находится на вершине метаболизма тетратерпенов со сформированной центральной сопряженной полиеновой цепью, входящей в структуры большинства известных каротиноидов. Рис.1.
.!.с
Рис.1. Строение ликопина (I), (II) и Р~ каротина (III)
Это соединение содержит и полностью сопряженных (без стерических напряжений) двойных связей и поэтому имеет наиболее длинноволновый максимум абсорбции в ряду тетратерпенов с аналогичным числом сопряженных связей, что обеспечивает окраску синтезирующих ликопин тканей в красный цвет, хорошо известный по цвету традиционных томатов или мякоти арбуза. При этом ликопин является не только эффективным природным колорантом, но и наиболее мощным среди каротиноидов антиоксидантом, - это свойство обусловливает высокую биологическую активность ликопина [1]. Уместно отметить, что не все пищевые добавки, которым присвоен код, как например, Е-1бос1 - ликопин, являются опасными веществами, употребление которых следует сократить до минимума.
Сегодня ликопин - один из наиболее разрекламированных проектов, разработка эффективных технологий получения которого имеет большое значение для фармацевтической промышленности. Из растительных источников наиболее эффективными являются виды растения рода момордика (МотогсНса), рубиново-красные околосемянники которой являются непревзойденными рекордсменами в растительном мире по уровню накопления ликопина [2, 3]. При этом в околосемянниках плодов М. сНагагШа Ь. и М. Ьакатта Ь. осуществляется биосинтез почти исключительно ликопина, в то время, как в плодах популярного в Юго-Восточной Азии вида М. сосЫпсЫпег^э Брге^. накапливается не только ликопин, но и (3-каротин. Главным образом эти же два каротина накапливаются и в плодах томатов [3].
При разработке готовых форм биологически активных соединений особое внимание уделяется биодоступности этих соединений, что особенно важно для нерастворимых в воде ка-
ротиноидов. Известно, что лучшему усвоению каротиноидов способствует их введение в липидные матрицы [3]. Альтернативный способ повышения биодоступности - синтез комплексов включения каротиноидов с циклодекстринами, исследованию которого посвящено значительное число публикаций, однако выводы таких работ не всегда согласовываются между собой. При исследовании комплексообразования ликопина с а-, (3- и у-циклодекстринами при молярном соотношении 1:50 в работе исследователей из Бразилии [4] было установлено, что комплексы образуются только в случае (3- и у-циклодекстринов. При хранении в холодильнике в течение 180 дней комплекс ликопина с у-циклодекстрином остался без изменения, а комплекс с (3-циклодекстрином разрушился на 8о%, при этом лучшие результаты получаются при приготовлении комплексов ликопин : у-циклодекстрин в мольном соотношении 1 : 200. Но в патенте США [5] утверждается, что при добавлении в раствор 5 г а-циклодекстрина в 40 мл воды при 6о°С 0,3 г ликопина (в виде раствора в хлороформе) при перемешивании в течение 20 мин (достаточном для полного испарении хлороформа) после охлаждения и отделения осадка получается темно-желтый раствор, содержащий 2 мкг ликопина на 1 мл раствора. Изменение окраски ликопина от красной до желтой при его комплексообразовании с (3-циклодекстрином отмечалась и в работе [6] и объясняется агрегацией молекул ликопина, стабилизированной (3-циклодекстрином. В работе испанских исследователей [7] из трех (а-, (3- и у-) циклодекстринов наилучшим для связывания полностью транс-ликопина признан (3-циклодекстрин в мольном соотношении компонентов 0.0026 :1, что обеспечило выход комплекса на уровне 94 %.
Приведенные выше разногласия в информации о комплексообразовании ликопина и (3-каротина стали причиной проведения исследований в настоящей работе.
Материалы и методы исследования. В работе использовали плоды М. charantia, выращенные в сезоне 2012 г., (3-каротин (фармакопейный) и (3-циклодекстрин (Китай). Ликопин экстрагировали из околосемянника ацетоном. Концентрации каротиноидов в растворах определяли спектрофотометрическим методом с использованием литературных значений
Е10°
удельных показателей поглощения: для ликопина 1сл1 = 3450 при Хтах = 472 пт [8] и для (3-
Е10°
каротина 1см = 2592 при Хтах = 450 пт [9]. Для ВЭЖХ определения состава растворов использовали хроматограф Agilent 1200 Infinity с диодно-матричным детектором (диапазон спектра 370-600 нм, хроматограммы записывали при 450 нм); колонка 250x4 мм Reprosil-Pur C18-AQ, 5 мкм; термостатирование при зо°С, подвижная фаза: 100% ацетон, 1 мл/мин.
В работе была предложена следующая технология получения комплексов включения: к Vi мл раствора каротиноидов в ацетоне, концентрацию каротиноидов в котором определяли спектрофотометрическим методом, добавляли mi г растертого в порошок (в фарфоровой ступке) воздушно сухого (3-циклодекстрина и смесь тщательно перемешивали. Добавляли V2 мл дистиллированной воды, смесь тщательно перемешали встряхиванием и оставляли на 5 - 45 мин в ультразвуковой бане. Затем центрифугированием отделяли осадок. К отделенному от маточного раствора осадку добавляли Vi мл ацетона для реэкстракции каротиноидов; после седиментации (3-циклодекстрина (бесцветный осадок, что свидетельствует о полном извлечении каротиноидов из комплексов) реэкстракт использовали для спектрофотометрического и хроматографического анализа.
Результаты и их обсуждение. Электронные спектры ацетонового экстракта околосемянника момордики и раствора (3-каротина в ацетоне представлены на Рис.2; максимумы абсорбции электронно-колебательной структуры соответствуют литературным данным для этих каротинов [ю]: 448, 474 и 505 нм - для ликопина и 429 пл., 452 и 478 нм - для (3-каротина. Не возникает проблем при подборе хроматографической системы для разделения этих соединений в условиях обращенно-фазовой хроматографии, Рис.3: при использовании традиционных (так называемых «мономерных» октадецилсилильных) С18-стационарных фаз удерживание ликопина оказывается заметно слабее удерживания (3-каротина при любых составах ацетон-ацетонитрильнх подвижных фаз. Это находится в полном соответствии с ростом широко используемого в биологии и в фармацевтике расчетного параметра липофильности (например, по программе ALOGP), равным 9.16 и 9.72, соответственно (интерактивный расчет на сайте виртуальной химической лаборатории, http://www.vcclab.org/lab/alogps/start.html).
о.
о.
0.
0.
Длина полны, нм
Рис.2. Спектры растворов каротиноидов в ацетоне і - экстракт момордики М. сЛагатіа, 2 - (5-каротии
Рис.3. Разделение ликопина (і) и [3-каротина в осадках Реэкстракты получены после выдержки в течение: А - 5, Б - 15, В - 30, Г - 45 мин. В правом верхнем углу - спектры каротиноидов, записанные в кювете детектора.
Для получения комплексов включения каротиноидов с (3-циклодекстрином удобно использование растворов картиноидов в ацетоне и (3-циклодекстрина в воде. При их смешивании уменьшается растворимость и каротиноидов и (3-циклодекстрина, создавая условия для получения гетерофазы. Однако из-за не слишком высокой растворимости (3-циклодекстрина в воде такой метод не очень удобен, поскольку трудно создать большой избыток молекул «хозяина», что необходимо для получения стабильных комплексов включения. По альтернативному методу можно использовать тонкоизмельченный (3-циклодекстрин, внесенный в раствор каротиноидов в ацетоне, к которому добавлена вода для уменьшения растворимости молекул «гостей». В таком методе в начальный момент может выделиться гетерофоза каротиноидов, которая может быть захвачена в осадок мелкодисперсным (3-циклодекстрином. Для преобразования такого осадка в комплекс включения потребуется некоторое время. Контроль течения процесса в этом случае практически неосуществим при исследовании комплексообразования одного каротино-ида с (3-циклодекстрином, но и может быть выполнен, если каротиноиды представлены комплексом индивидуальных соединений с различной афинностью по отношению к циклодекстрину.
Исследование комплексообразования (3-циклодекстрина с производными коричной кислоты [и] показало, что введение двух заместителей в мета-положение по отношению к основному радикалу приводит к резкому уменьшению констант комплексообразования, хотя введение в пара-положение гидроксильной группы, наоборот существенно увеличивает такие константы. Это объясняется стабилизацией комплексов при гидратации ОН-группы по ротаксано-вому типу (во втором случае) и дестабилизацией в первом случае за счет (в основном) стериче-ских затруднений (эффект тот же и для СН30- и для ОН-групп). Очевидно, что такие затруднения могут возникнуть при внедрении (3-каротина (имеющего три СН3-группы в ортоположении) в полость (3-циклодекстрина, тогда как для не имеющего концевых циклов ликопина очевидных препятствий для образования комплексов нет.
Ъс чі ' #
Действительно, состав осадка оказывается нестабильным во времени, что следует из хроматограмм, приведенных на рис.2. При добавлении воды к ацетоновому раствору смеси ка-ротиноидов (при соотношении вода : ацетон 1:4 по объёму), к которому добавили растертый (3-циклодекстрин в мольном соотношении к сумме каротиноидов 5:1 сразу образуется осадок. При выдерживании такой смеси в ультразвуковой бане в течение 5 мин с последующим центрифугированием удается отделить осадок и реэкстрагировать из него (до полного обесцвечивания) порядка 75% (от исходного количества) смеси ликопина и (3-каротина с соотношением между каротиноидами, не отличающимся от исходного. При этом дальнейшее выдерживание в ультразвуковой бане приводит к небольшому уменьшению количества захваченного в осадок ликопина и к резкому уменьшению доли (3-каротина, рис.4, что указывает на дифференциацию ликопина и (3-каротина при комплексообразовании.
а.%
Рис.4. Зависимость содержания ликопина (1) и Р-каротина (2) в осадках от времени выдержки смеси
кароиноидов с Р-циклодекстрином
Состав каротиноидов в образовавшихся осадках может быть охарактеризован как кинетически контролируемый продукт на начальном временном участке и как термодинамически контролируемый продукт - при увеличении времени выдержки.
Найденная особенность достаточно любопытна, поскольку, с одной стороны, может быть использована в качестве альтернативного известным методам способа разделения каротиноидов с различной афинностью к (3-циклодекстрину. С другой стороны, термодинамический аспект будет определяться многими параметрами, такими как
1) соотношение вода : ацетон (определяющее растворимость в общем случае различных по свойствам каротиноидов); очевидно, что при слишком большом снижении растворимости всех компонентов их афинность по отношению к (3-циклодекстрину будет нивелирована;
2) соотношение циклодекстрин : каротиноид, поскольку даже состав комплексов включения может быть неодинаковым (например, по тем же стерическим причинам).
Для подтверждения такого предположения в настоящей работе нами были выполнены исследования по изменению соотношение вода : ацетон при фиксированном соотношении (3-циклодекстрин : сумма каротиноидов (5:1 по моль), рис.5, и ПРИ одинаковом времени выдержки смеси (30 мин).
ч.г5 41
Рис.5. Зависимость состава осадка комплекса включения от добавки воды к смеси раствора каротиноидов
и Р-циклодекстрина
Как следует из приведенных на Рис.5 данных, при относительно небольшой добавке воды удается отделить ликопин от смеси с (3-каротином с чистотой порядка 85% при начальном его соотношении к (3-каротину 1.0 : 1.4 (т.е. при доле ликопина порядка 40%). Большие добавки воды приводят к потере различия в афинности ликопина и (3-каротина по отношению к (3-циклодекстрину.
Выводы. Добавление (3-циклодекстрина к водно-органическому раствору смеси каротиноидов может быть использовано для разделения каротинодов за счет различной устойчивости комплексов включения; при этом результат зависит от ряда параметров, включая кинетические и термодинамические.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ «Государственное задание вузу на 2013 г, проект № 3.1785.2011».
1. Agarwal // J. Am. Coll. Nutr. - 2000. - V.19. - P. 563-569.
2. Момордика - уникальный источник ликопина / В.И. Дейнека, М.Ю. Третьяков,
Доан Хоанг Жанг, В.К. Тохтарь, Л.А. Дейнека, И.А. Гостищев // Масложировая промышленность. 2011. №.3. С.12-13.
3. Collins J.K. Lycopene: From Plants to Humans / J.K. Collins, P. Perkins-Veazie // HortSci. - 2006. -V.41. - P. 1135-1144.
4. Venket Rao A. Role of Antioxidant Lycopene in Cancer and Heart Disease / A. Venket Rao, S. Matioli G. Microencapsulacjao do licopeno com ciclodextrinas / G. Matioli, D.B. Rodriguez-Amaya // Cicnc. Tecnol. Aliment., Campinas. - 2003. - V.23(Supl). - P. 102-105.
5. Leuenberger B. Cyclodextrin-polyene inclusion complexes. / B. Leuenberger, H. Stoller //Patent
USA 5,221,735.1993. ... .
6. UV-Vis spectroscopic characterization of inclusion compounds of P-cyclodextrin with lycopene / L. Wang , J. La, Z. Du, D. Wu // Spectroscopy Spectral Anal. - 2004. - V.24. - V.183-186.
7. Stabilization of all-trans-lycopene from tomato by encapsulation using cyclodextrins / G.P. Blanch,
M.L.R. del Castillo, M. del Mar Caja, M. Perez-Mendez, S. Sanchez-Cortes // Food Chem. - 2007. - V.105. - P. 1335-13418. Phytoene, Phytofluene, and Lycopene from Tomato Powder Differentially Accumulate in Tissues of
Male Fisher 344 Rats / J.K. Campbell, N.J. Engelmann, M.A. Lila, J.W. Erdman // Nutr Res. - 2007. - V.27. - P. 794-801.
9. Variebility of lutein content in peas (Pisum sativum L.) in relation to the variety, season and chlorophyll content / M. Holasova, R. Dostalova, V. Fiedlerova, J. Horacek // Czeh. J. Food Sci. - 2009. - V.27. - P-S188-S191.
10. Rodriguez-Amaya D.B. A guide to carotenoid analysis in food. Washington / D.B. Rodriguez-Amaya // DC.: Ed. ILSI-Intema-tional Life Sciences Institute.2001. - 64 p.
11. Модулирование селективности разделения сорбатов за счет образования супрамолекулярных комплексов в подвижной фазе / И.П. Анисимович, В.И. Дейнека, Л.А. Дейнека, В.Ф. Селеменев // Сорбц. и хроматогр. процессы. - 2010. - Т.10, Вып.3. - С. 401-408.
E.V. ZAKCHARENKO, M.S. LAPSHOVA cydodextrin has been proposed. The method may be utilized for lyco-
Литература
PARTICULARITIES OF INCLUSION COMPLEXES FORMATION OF LYCOPENE AND P-CAROTENE WITH It -CYCLODEXTRIN
The method for partial resolution of lycopene from P-carotene due to inclusion complexes formation of the carotenoids with P-
Belgorod National Research University
V.I. DEINEKA, L.A. DEINEKA A.G.DORONIN
pene preparations manufacture. For the manufacture it has been proposed to add powdered P-cyclodextrin to the acetone solution of carotenoids with lowered solubility due to some water admixture. The first stage of processes was found to be a coprecipitation of carotenoids with P-cyclodextrin, while under reflux the complexes with carotene inclussion (into cydodextrin cavity) ability differentiation may be prepared.
e-mail: deyneka@bsu.edu.ru
Keywords: lycopene, P-carotene, P-cyclodextrin, inclusion complexes.
