CC BY
20Вестник АПК „ ,
_ _____________Растениеводство
УДК 634.8:579.674
;№ 1(25), 2017
Н. М. Агеева, А. И. Насонов, А. В. Прах, И. И. Супрун, Е. А. Сосюра Ageevа N. M., Nasonov A. I., Prakh A. V., Suprun I. I., Sosyura E. A.
ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА МИКРОФЛОРЫ ВИНОГРАДА С ЦЕЛЬЮ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
STUDY OF THE COMPOSITION OF MICROFLORA OF GRAPES FOR THE PURPOSE OF THE IDENTIFICATION OF THE NATURAL POPULATIONS SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Приведены результаты исследования состава микрофлоры винограда с целью идентификации природных популяций дрожжей БассЬаготусев сегеу1в1ае для выделения новых местных штаммов и их последующего использования в технологии столовых и игристых вин.
Ключевые слова: виноград, гроздь, ягоды, дрожжи-сахаромицеты, вид, род, идентификация, колонии.
Are given the results of investigating the composition of microflora of grapes for the purpose of the identification of the natural populations of yeast(s) Saccharomyces cerevisiae for the isolation of new local strains and their subsequent use in the technology of the table and sparkling wines.
Key words: grapes, cluster, berry, yeast(s)-saccharomy-cetes, form, kind, identification, the colony.
Агеева Наталья Михайловна -
доктор технических наук, профессор, главный научный сотрудник НЦ «Виноделие» ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» г. Краснодар Тел.: 8-918-468-25-25 E-mail: ageyeva@inbox.ru
Насонов Андрей Иванович -
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики и микробиологии ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» г. Краснодар Тел.: 8-902-407-59-73 E-mail: nasoan@mail.ru
Прах Антон Владимирович -
кандидат сельскохозяйственных наук, старший
научный сотрудник НЦ «Виноделие»
ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-
исследовательский институт садоводства
и виноградарства»
г. Краснодар
Тел.: 8-961-525-86-70
E-mail: prach@mail.ru
Супрун Иван Иванович -
кандидат биологических наук, заведующий лабораторией генетики и микробиологии ФГБНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» г. Краснодар
Сосюра Елена Алексеевна -
кандидат технических наук, доцент кафедры производства и переработки продуктов питания из растительного сырья
ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный
аграрный университет»
г. Ставрополь
Тел.: 8-903-419-49-42
E-mail: elena_st_86@mail.ru
Ageeva Natalya Mihaylovna -
Doctor of technical Sciences, professor, Chief Researcher of SC «Winemaking»
FSBSI «North-Caucasian zone scientific research institute of horticulture and viticulture» Krasnodar
Tel.: 8-918-468-25-25 E-mail: ageyeva@inbox.ru
Nasonov Andrey Ivanovich -
Ph.D of biological Sciences, senior researcher of the Laboratory of Genetics and Microbiology FSBSI «North-Caucasian zone scientific research institute of horticulture and viticulture» Krasnodar
Tel.: 8-902-407-59-73 E-mail: nasoan@mail.ru
Prakh Anton Vladimirovich -
Ph.D of agricultural Sciences, senior researcher of SC «Winemaking»
FSBSI «North-Caucasian zone scientific research institute of horticulture and viticulture» Krasnodar
Tel.: 8-961-525-86-70 E-mail: prach@mail.ru
Suprun Ivan Ivanovich -
Ph.D on biological Sciences,
Head of the Laboratory of Genetics and Microbiology FSBSI «North-Caucasian zone scientific research institute of horticulture and viticulture» Krasnodar
Sosyura Elena Alekseevna -
Ph.D of technical Sciences, associate professor
of Department of the production and processing
of food from plant material
FSBEI HE «Stavropol State Agrarian University»
Stavropol
Tel.: 8-903-419-49-42 E-mail: elena_st_86@mail.ru
Поддержано грантом № 16-48-230347\16- р_а Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края.
Ежеквартальный
научно-практический
журнал
Современная винодельческая промышленность для производства вин применяет импортные культуры активных сухих дрожжей, селекционированных в Германии, Франции, Италии. Между тем в мире существует целый ряд примеров успешного выполнения проектов по поиску перспективных коммерческих штаммов винных дрожжей среди диких популяций или созданию таковых на основе скрещивания диких форм и имеющихся в наличии коммерческих штаммов для получения новых штаммов с улучшенными характеристиками. Такие исследования постоянно проводятся во Франции, а выделяемые дрожжи селекционируются и впоследствии применяются в технологии столовых и игристых вин.
Дрожжи, выделенные с поверхности ягод и листьев винограда, адаптированы к условиям конкретной местности и химическому составу ягод, в частности кислотности сока, величины рН, в связи с чем брожение сусла протекает активнее, а получаемый продукт имеет более высокое качество. Кроме того, знание качественного состава дикорастущих дрожжей позволит грамотнее использовать спонтанную микрофлору при производстве виноматериалов для крепких напитков и заранее прогнозировать их качество.
Цель работы - исследовать состав микрофлоры винограда, произрастающего в Анапо-Таманской зоне Краснодарского края с целью идентификации и последующего использования природных популяций дрожжей Saccharo-myces cerevisiae для выделения новых местных рас и штаммов.
В качестве объектов исследований использовали виноград белого сорта Шардоне и красного сорта Каберне-Совиньон, произрастающий в различных хозяйствах Анапо-Таманской зоны районов Краснодарского края. Сформированы следующие варианты:
- Шардоне: 1 - ЗАО «Абрау-Дюрсо»; 2 - ЗАО «Мысхако»; 3 - ООО «Имение Сикоры»; 4 - ООО «Вилла Виктория»;
- Каберне-Совиньон: 5 - ООО «Имение Си-коры»; 6 - ЗАО «Мысхако»; 7 - ООО «Лефкадия» (Крымский р-н); 8 - СПК им. Ленина (Анапский р-н); 9 - АФ «Южная» (Темрюкский р-н).
Массовая концентрация сахаров в винограде сорта Шардоне составляла 17,8-18,5 г/100 см3; в Каберне-Совиньон - 21,6-22,3 г/100 см3. Виноградники различались по возрасту, агротехническому состоянию,увлажненности.
Модифицирована методика отбора проб винограда для идентификации микрофлоры. Виноград (пробы по 2 кг) собирали в стерильные пакеты в период технической зрелости непосредственно на виноградниках и доставляли в лабораторию с соблюдением требуемых мер стерильности [1, 2]. Не вскрывая пакетов, виноград дробили вручную, при этом образовавшимся при раздавливании ягод суслом смывали микроорганизмы с поверхности ягод. Затем в пакетах проделывали отверстие, через кото-
рое сусло, обогащенное спонтанной микрофлорой винограда, сливали в стерильную посуду и проводили брожение.
Для выделения дрожжей-сахаромицетов и других микроорганизмов проводили посевы на твердые питательные среды. Выросшие колонии микроскопировали и по культурально-морфологическим признакам проводили идентификацию сахаромицетов [1, 3]. Отдельные колонии дрожжей получали посевом на элективные твердые питательные среды.
Одновременно отслеживали наличие дрожжей других родов, в том числе Saccharomyces, Pichia, Hansenula и Hanseniaspora.
На рисунке 1 приведена микроскопическая картина дрожжей сахаромицетов, выделенных из бродившего сусла. Дрожжи, выделенные с поверхности ягод сорта Шардоне, имели овальную или округлую форму, диаметр клеток от 3 до 6 мкм.
Дрожжи, выделенные с поверхности ягод сорта Каберне-Совиньон, были крупнее и более овальны: диаметр клеток достигал 8 мкм.
Проведенный анализ результатов исследований свидетельствует о гетерогенности популяции микроорганизмов на ягодах винограда обоих изучаемых сортов независимо от места их произрастания. На поверхности ягод идентифицированы дрожжи различных видов (Saccharomyces: cerevisiae, uvarum, chodati, bayanus), дикие дрожжи-сорняки винодельческого производства - Pichia Hansen (маленькие заостренные клетки), Hansenula Sydow, Hanseniaspora apiculata (более крупные заостренные клетки), Candida mycoderma, Bret-tanomyces Dekkera, Debaryomyces Dekkeri (Torulopsis), а также делящиеся дрожжи Schi-sosaccharomyces acidodevoratus, что согласуется с данными [4]. Кроме того, идентифицированы конидии плесневых грибов Mucor, Aspergillus niger. При этом можно отметить тот факт (табл.), что на поверхности ягод красного сорта винограда Каберне-Совиньон количество колоний микроорганизмов, давших рост на твердой питательной среде, было значительно меньше, чем на белом сорте винограда Шардоне (при одинаковом разбавлении), независимо от места произрастания. Это можно объяснить наличием в кожице винограда Каберне-Совиньон большого количества фенольных соединений, проявляющих антимикробное действие.
Этот факт подтвердился динамикой брожения сусел на спонтанной микрофлоре. В образцах из белого сусла накопление биомассы клеток протекало быстрее, и видимые признаки брожения были уже на вторые сутки: массовая концентрация сахаров уменьшилась на 2,84,3 г/100 см3.
В сусле из винограда Каберне-Совиньон сначала отмечено появление прозрачной пленки, и только на 3-4-е сутки появились первые признаки забраживания, а концентрация сахаров снизилась на 2,5-4 г/100 см3.
Растениеводство 117
Рисунок 1 - Микроскопическая картина дрожжей-сахаромицетов: а-в - Шардоне;
г-е - Каберне-Совиньон
Наибольшее количество колоний на твердой среде в чашках Петри отмечено на ягодах молодых виноградников Шардоне ООО «Имение Си-коры» и ООО «Вилла Виктория». Установлено меньшее количество сахаромицетов на ягодах Шардоне, произраставшего в гористой местности ЗАО «Абрау-Дюрсо».
В хозяйствах ООО «Имение Сикоры» и ЗАО «Мысхако» в период созревания винограда сорта Каберне-Совиньон и отбора проб отмечалась засуха. Возможно, этим объясняется меньшее количество выросших колоний сахаромицетов. В то же время в период сбора образцов более влажная погода отмечалась на виноградниках СПК им. Ленина, ООО «Лефка-дия». Возможно, эти погодные факты оказали определенное влияние на количество микроорганизмов на поверхности ягод винограда: на винограде, произраставшем в более влажных
условиях, идентифицировано и большее количество дрожжей-сахаромицетов.
Были проведены посевы на твердую элективную среду с целью оценки многообразия форм колоний сахаромицетов. Известно [5, 6], что в зависимости от вида дрожжей колонии могут иметь разнообразную форму: округлую, с перегородками и без них, лучевую или перистую, с образованием четко выраженного внутреннего кольца, при этом вид колонии может быть блестящим и матовым, сухим и влажным, гладким и морщинистым, с гладкими или деформированными краями. Кроме того, часть колоний может иметь и особую, ни с чем не сравнимую форму [7, 8]. Различается рельеф поверхности и толщина колонии.
На рисунке 2 представлены фотографии гигантских колоний, выросших на твердой питательной среде.
Таблица - Рост колоний дрожжей на твердой питательной среде
№ вари- Хозяйство Количество колоний в чашках Петри Среднее
анта 1 2 3 4 5
Шардоне
1 ЗАО «Абрау-Дюрсо» 28 33 34 29 33 31
2 ЗАО «Мысхако» 31 35 33 37 35 34
3 ООО «Имение Сикоры» 41 39 37 43 42 41
4УСЯ ООО «Вилла Виктория» 38 36 40 33 38 37
Каберне-Совиньон
5 ООО «Имение Сикоры» 12 8 14 7 6 9
6 ЗАО «Мысхако» 8 6 6 9 5 7
7 ООО «Лефкадия» 14 12 16 15 10 13
8 СПК им. Ленина 17 21 19 23 14 19
9 АФ «Южная» 11 12 8 12 13 10
Ежеквартальный
научно-практический
журнал
Рисунок 2 - Внешних вид гигантских колоний дрожжей-сахаромицетов, выросших на твердой
питательной среде (сорт винограда Шардоне)
Полученные результаты (рис. 2) показали разнообразие форм, размеров, внешнего вида колоний, полученных путем посева проб Шардоне и Каберне-Совиньон на твердую питательную среду. При этом:
«а» - колония матовая, с морщинистой рыхлой поверхностью, была получена путем посева пробы Каберне-Совиньон (ООО «Имение Си-коры»);
«б» - колония с перегородками, с выраженным центром, матовая, также принадлежит Каберне-Совиньон, но произраставшему в ЗАО «Мысхако».
Остальные колонии принадлежат сорту винограда Шардоне:
«в» (ЗАО «Мысхако») - колония гладкая, блестящая, круглая, с выраженным центром, края мало деформированы;
«г» (ООО «Имение Сикоры») - колония небольших размеров (даже при длительном наблюдении роста колонии не было), гладкая, блестящая, с выраженным центром, края мало деформированы;
«д» (ЗАО «Мысхако») - гигантская колония, матовая, блестящая, с хорошо выраженным центром, края деформированы;
«е» (ЗАО «Абрау-Дюрсо») - колония блестящая, лучистая, с перегородками и выраженным центром, при этом количество лучей варьировало от одного до четырех.
Таким образом, представленные материалы исследований свидетельствуют о существенном многообразии сахаромицетов на виноградниках различных сортов. Для более точной идентификации видовой принадлежности будет проведена генетическая экспертиза выращенных колоний.
Литература
1. Бурьян Н. И. Микробиология виноделия. Симферополь : Таврия, 2002. 403 с.
2. Саенко Н. Ф. Методы селекции хересных дрожжей на спиртоустойчивость // Труды Ин-та микробиологии АН СССР. 1961. Вып. 10. С. 96-103.
3. Косиков К. В. Генетические методы селекции дрожжей: гибридизация, полиплоидия. М., 1999. 116 с.
References
1. Buryan N. I. Microbiology of the wine making. Simferopol : Tavriya, 2002. 403 p.
2. Saenko N. F. Breeding methods sherry yeast to spirostachys // Proceedings of Institute of Microbiology, USSR Academy of Sciences. 1961. Vol. 10. P. 96-103.
3. Kosikov K. V. Genetic methods of the selection of yeast(s): hybridization, polyploid. M., 1999. 116 p.
в
;№ 1(25), 2017
Растениеводство
4. Травникова Е. Э., Скорикова Т. К. Выделение местных рас дрожжей сахаромицетов для приготовления столовых вин // Мага-рач. Виноградарство и виноделие. 2011. № 4. С. 21-22.
5. Магомедова Е. С., Абдуллабекова Д. А., Абрамов Ш. А. Разнообразие и морфофизи-ологические свойства дрожжей,обитающих в условиях различной вертикальной поясности // Юг России: экология, развитие. 2009. № 1. С. 99-102.
6. Теория и практика виноделия. Характеристика вин. Созревание винограда. Дрожжи и бактерии / Ж. Рибейро-Гайон, Э. Пейно, П. Рибейро-Гайон, П. Сюдро. М. : Пищевая промышленность, 1979. Т. 2. 348 с.
7. Kurtzman C. P., Piskur J. Taxonomy and phylogenetic diversity among the yeasts // Comparative Genomics: Using Fungi as Models / P. Sunnerhagen, J. Piskur eds. Berlin : Springer, 2006. P. 29-46.
8. Barnett J. A. Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research // Microbiology. 2003. № 149 (3). P. 557-567.
119
4. Travnicova E. E., Skorikova T. K. Isolation of the local races of yeast(s) of saccharomycetes for the preparation of the table faults // Magarach. Viticulture and the wine making. 2011. № 4. P. 21-22.
5. Magomedova E. S., Abdullabekova D. A., Abramov Sh. A. Variety and the morpho-physiological properties of yeast(s), which dwell in conditions of different vertical zonation // The south of Russia: ecology, development. 2009. № 1. P. 99-102.
6. Theory and the practice of wine making. Characteristic of faults. Ripening grapes. Yeast(s) and bacterium / Zh. Ribeyro-Gayon, E. Peyno, P. Ribeyro-Gayon, P. Syudro. M. : Foods industry, 1979. T. 2. 348 p.
7. Kurtzman C. P., Piskur J. Taxonomy and phylogenetic diversity among the yeasts // Comparative Genomics: Using Fungi as Models / P. Sunnerhagen, J. Piskur eds. Berlin : Springer, 2006. P. 29-46.
8. Barnett J. A. Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research // Microbiology. 2003. № 149 (3). P. 557-567.
